基于N蛋白的PEDV间接ELISA检测方法的建立与初步应用

本研究旨在原核表达猪流行性腹泻病毒(porcine epizootic diarrhea virus,PEDV)的核衣壳(N)蛋白,以重组N蛋白作为包被抗原建立PEDV血清抗体间接ELISA检测方法,并进行初步应用。克隆PEDV N基因并将其插入到原核表达载体p ET-28a中,转化BL21感受态细胞进行诱导表达,对表达的N蛋白进行镍柱纯化及Western-blot鉴定;将纯化的N蛋白作为包被抗原并优化反应条件,建立检测PEDV血清抗体的间接ELISA方法,并进行特异性、灵敏性和重复性试验,最后对临床样品进行检测。原核表达得到大小为58ku的重组N蛋白,Western-blot检测表明N蛋白具有良好的特异性和反应原性。PEDV间接ELISA方法的最优反应条件为抗原包被量每孔0.05 g,血清以1∶200倍稀释,作用1.0 h,酶标二抗以1∶5 000倍稀释,作用1 h,TMB显色时间为25 min。在该优化条件下,D4500.269为阳性,反之为阴性。特异性试验表明,对PCV2、PRV、CSFV、PRRSV、FMDV阳性血清检测结果均为阴性,特异性良好;对96份阳性血清进行检测,敏感性为98.9%。重复性试验表明,批内变异系数0.99%~2.33%,批间变异系数3.54%~6.67%。用本试验建立的体系对临床上164份血清进行检测,阳性率为56.7%,与标准试剂盒的符合率为95.1%。总之,本试验建立的基于原核表达的N蛋白作为检测抗原的PEDV血清间接ELISA方法具有敏感性高、特异性强、重复性好,可用于临床PEDV血清抗体的检测。