牛分枝杆菌ESAT-6基因和CFP-10基因在大肠杆菌中的融合表达

以牛分枝杆菌Vallee株基因组DNA为模板,应用PCR扩增获得了ESAT-6和CFP-10两个目的基因片段,采用重叠延伸剪接技术(SOE)将ESAT-6基因和CFP-10基因通过(Gly4Ser)3接头连接,得到了融合基因.将融合基因片段先克隆于pMDl8-T载体,再亚克隆到表达载体pET32a(+)中,通过限制性内切酶消化、菌液PCR鉴定、序列分析证实得到含预期序列的重组质粒pET-ESAT-6-CFP-10;该质粒转化BL21(DE3);经IPTG诱导,表达出了40 ku的融合蛋白;用Ni螯合层析方法纯化该蛋白,经SDS-PAGE检测,出现了清晰的单一条带;Western-blotting试验结果显示,该融合蛋白能与抗牛分枝杆菌阳性血清发生反应.结果表明,ESAT-6基因和CFP-10基因在大肠杆菌中融合表达成功并具有良好的反应原性.     

结核分枝杆菌CFP10-ESAT-6融合基因的表达及其多克隆抗体的制备

以结核分枝杆菌标准株H37Rv的基因组DNA为模板,经重叠PCR扩增获得CFP10-ESAT-6融合基因片段,克隆于pET21a表达载体中,获得了重组质粒pET21a-CFP10-ESAT-6,将其转化大肠杆菌BL21细胞,经IPTG诱导表达,得到了25 ku的目的蛋白。表达产物经纯化和定量分析后免疫新西兰大白兔,收集兔血清进行抗体ELISA检测。结果显示,成功构建了CFP10-ESAT-6融合基因的原核表达质粒,获得了CFP10-ESAT-6融合蛋白,以此蛋白免疫动物可产生高效价的抗体。     

牛分枝杆菌Ag85A基因在大肠埃希氏菌中的表达

以BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切已构建的pGEM-T-85A和pET28a( ),并将纯化的Ag85A基因亚克隆至pET28a( )中,构建出原核表达质粒pET28a-85A。将pET28a-85A转化至感受态E.coliBL21(DE3)中,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,可见约32 ku的外源蛋白带。Western-blotting分析表明,该蛋白具有牛分枝杆菌的抗原性。     

牛分枝杆菌融合基因hsp65-esat6的原核表达及产物的纯化

以牛分枝杆菌ValleeⅢ株基因组DNA为模板扩增hsp65和esat6基因,采用重叠延伸剪接技术(SOE)获得了融合基因hsp65-esat6,将hsp65-esat6连接到原核表达载体pET32a(+)上,构建重组质粒pET65-E6,将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,以IPTG诱导(终浓度为1 mmol/L),表达产物进行SDS-PAGE分析。以Ni2+亲和层析柱纯化表达的融合蛋白和Western-blot分析该融合蛋白的免疫活性。结果表明:Hsp65-ESAT6融合蛋白以包涵体形式表达。表达的融合蛋白裂解为两部分,即58 ku和30ku,二者相加与预测大小88 ku相符。纯化的融合蛋白能与抗牛分枝杆菌阳性血清发生反应。     

牛疱疹病毒Ⅰ型gB基因的原核表达及产物的抗原性分析

采用PCR方法,以牛疱疹病毒Ⅰ型基因组DNA为模板扩增gB基因,克隆至pGEM-T载体。将以克隆质粒pGEM-T-gB为模板扩增的gBⅠ、gBⅡ和gBⅢ基因片段分别连接至原核表达载体pET32a。获得的重组质粒分别转化感受态细胞BL21(DE3),在IPTG诱导下表达。经SDS-PAGE鉴定,gBⅠ、gBⅡ和gBⅢ基因片段在大肠埃希氏菌BL21(DE3)中以融合蛋白形式获得了表达。以磁化组氨酸蛋白纯化系统对融合蛋白纯化后,Western-blotting和ELISA分析结果表明,这些融合蛋白均与BHV-1标准阳性血清反应,可作为抗原用于牛传染性鼻气管炎ELISA检测方法的建立。     

胸膜肺炎放线杆菌毒素ⅠBD基因特异性片段的克隆及表达

以胸膜肺炎放线杆菌(APP)血清1型标准菌株基因组为模板,用PCR扩增ApxⅠBD基因的特异性片段;对PCR产物纯化回收后与载体pMD 18-T进行连接、转化,经酶切和序列分析鉴定后亚克隆到原核表达载体pET28a中,构建重组表达质粒pETⅠBD;转入大肠埃希氏菌BL21中,以IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE电泳。结果,从APP中克隆的ApxⅠBD DNA序列与已发表序列的同源性为100%,长1 447 bp,编码482个氨基酸,所表达的融合蛋白相对分子质量约54ku,与预期的大小相符。结果表明,含有ApxⅠBD基因特异性片段的重组表达载体pETⅠBD已成功构建。     

结核分枝杆菌Ag85B和ESAT-6基因重组产单核细胞李斯特菌的构建

对编码结核分枝杆菌抗原Ag85B和ESAT-6的基因片段进行了扩增,并将其克隆入穿梭载体DKSV7,利用基因同源重组技术构建了表达结核分枝杆菌抗原Ag85B和ESAT-6的重组产单核细胞李斯特菌(LM).结果表明,外源基因成功整合入LM基因组并获得转录;Western-blot分析结果显示,重组菌携带的外源基因在动物体内能够表达;溶血试验与细胞感染试验表明,较之野生型李斯特菌,外源基因的插入破坏了重组菌LM(pKSV7-H85-6B)的溶血活性,显著降低了对细胞的侵袭能力.证实,携带结核分枝杆菌保护性抗原Ag85B和ESAT-6的重组李斯特菌对结核病新型疫苗的研究具有潜在应用价值.     

禽分枝杆菌副结核亚种map0862基因与map2154c基因的串联重组表达

以禽分枝杆菌副结核亚种参考株P18的基因组DNA为模板,扩增出了map0862基因和map2154c基因.采用重叠延伸剪接PCR技术(PCR-SOE)获得了融合基因map0862-2154c.将融合基因与原核表达载体pET32a( )连接,构建了重组质粒pET0862-2154c.将重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中,以IPTG(终浓度1 mmol/L)诱导后对表达产物进行SDS-PAGE分析和Western-blot检测.结果表明.表达的重组蛋白map0862-2154c的分子质量为76 ku,可用于建立诊断副结核病的ELISA.     

猪传染性胃肠炎病毒S基因抗原位点B与C之间片段的克隆与原核表达

将RT-PCR扩增的猪传染性胃肠炎病毒S基因抗原位点B与C之间的目的片段经克隆、双酶切后连接于表达载体,经酶切、PCR和测序鉴定的阳性重组质粒转化BL21(DE3),用IPTG诱导重组菌株表达其融合蛋白.结果显示,目的片段的大小为357bp,序列分析表明,S基因与其他猪传染性胃肠炎病毒相应基因具有很高的同源性;Western-blotting检测表明,分子质量约34ku的融合蛋白具有良好的反应原性.     

新城疫病毒F蛋白免疫活性片段的原核表达

利用已构建的新城疫病毒F基因重组质粒,通过氨基酸序列分析和InsightⅡ基因工作站的MODELER程序和同源模建技术,预测了试验株F蛋白的表面抗原分布位置.设计引物扩增了2段含有多个抗原位点的多肽片段,通过双酶切定向克隆到原核表达载体pET32a,获得了重组质粒pET32a-F1和pET32a-F2以及2个片段串联起来后克隆的重组质粒pET32a-F3.重组质粒经诱导表达并取产物进行分析,结果显示,F1、F2、F3片段均获得了融合表达.Western-blotting证实,表达产物F1、F2和F3与NDV阳性血清均具有免疫反应性.用表达的重组蛋白加免疫佐剂经皮下接种免疫鸡,免疫2次后产生较高的抗体水平,用100 LD50的超强毒株GD-05-2攻击,重组蛋白免疫组鸡可达到约70%的保护率,并可显著抑制排毒.     

牛霉形体免疫相关性蛋白P51的筛选与鉴定

为了筛选免疫原性蛋白,建立牛霉形体的快速诊断方法,利用二维凝胶(2-D)电泳、Western-blot分析及蛋白质谱分析,筛选出一个免疫相关性蛋白P51。以牛霉形体中国分离株Hubei-1为模板,扩增了p51基因,并克隆到原核表达载体pET32a上。结果显示,重组蛋白pET32a-p51与牛霉形体阳性血清的Dot-blotting试验结果为阳性,而Western-blotting试验结果为阴性。以pET32a-p51重组蛋白为包被抗原的ELISA试验表明其能与自然感染和人工感染牛霉形体的阳性血清发生特异性反应,而与灭活疫苗免疫的阳性血清不发生特异性反应,与牛传染性胸膜肺炎的阳性血清没有交叉反应。表明P51可能是牛霉形体特有的一种构象依赖性免疫相关蛋白,是一种有前景的诊断用抗原。     

羊痘病毒P32蛋白编码基因的克隆及表达

为获得山羊痘病毒膜蛋白重组P32抗原,根据其基因序列设计合成了1对特异性引物, 对CaPV P32基因进行了PCR扩增,产物大小约为969 bp;产物回收纯化后,将其克隆至pBAD／ Thio-TOPO载体中,转化TOP10大肠埃希氏菌感受态细胞,与已报道的多株CaPV P32基因序列的同源性高达99％;相应地,氨基酸序列同源性为98％。经测序筛选出阳性克隆,该重组菌株经 L-arabinose诱导,可稳定、高效地表达CaPV P32抗原。表达蛋白为融合蛋白,分子质量约 51．53 ku。     

狂犬病病毒糖蛋白膜外区基因在大肠埃希氏菌中的高效表达

为获得狂犬病病毒(RV)糖蛋白抗原,采用RT-PCR方法从狂犬病病毒ERA株中扩增了编码RV糖蛋白的全长基因,将其克隆于pMD18-T载体,再经PCR扩增出糖蛋白全长基因和膜外区基因,将其分别亚克隆至原核表达载体pET-28a( )、pET-32a( )和pGEX-4T-1中,经PCR 和双酶切鉴定以及序列分析,表明已成功构建了重组质粒。将重组质粒转化到大肠埃希氏菌BL21 (DE3)中进行表达,结果显示,克隆到pET-32a( )的糖蛋白膜外区基因表达量最高,目的蛋白表达量占菌体总蛋白的45．4％。经Western-blotting检测,不同载体表达的糖蛋白膜外区产物均可与兔抗RV多抗发生特异性反应,表明,重组蛋白具有良好的反应原性。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白基因的克隆和表达

以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)血清7型25-4株基因组DNA为模板,用PCR扩增外膜蛋白(OMP)基因特异片段,并克隆于pMD 18-T中,经酶切及核苷酸序列分析鉴定后,亚克隆于原核表达载体pGEX-6P-1,成功构建了重组表达载体pGEX-omp;以此转化大肠埃希氏菌BL21(DE3),经SDS-PAGE鉴定,表达的可溶性融合蛋白分子质量约为61 ku,命名为GST-OMP。以GST亲和层析柱纯化并利用Xa因子酶解,获得切掉标签的OMP。经ELISA检测,该OMP蛋白能够与兔抗APP的阳性血清反应,具有很好的免疫活性。GST-OMP蛋白的成功表达为APPOMP相关分子生物学功能的研制奠定了基础。     

旋毛虫HSP70基因的原核表达及其免疫原性

利用RT-PCR方法扩增旋毛虫HSP70基因,将其扩增产物克隆到pEASY-Blunt Simple载体中,经限制性酶切后与pET-28a(+)载体连接,进一步转化至感受态细胞Transetta(DE3)中,用IPTG诱导表达重组旋毛虫HSP70。以纯化的重组HSP70制备多克隆抗体,并对HSP70进行免疫印迹分析及免疫组织化学染色。结果表明,重组质粒的鉴定和DNA测序均正确;SDS-PAGE和Western-blot分析结果显示,在70ku处获得一目的条带;免疫组织化学染色结果显示,该HSP70具有很好的免疫原性。证实,成功构建了重组表达质粒pET28a-HSP70,为深入研究旋毛虫HSP70的功能奠定了基础。     

山羊痘病毒RPO30基因绿色荧光蛋白质粒的构建及融合表达

为了研究针对山羊痘病毒RPO30的siRNAs的干扰效果,构建了RPO30基因与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的融合表达质粒,并在BHK-21细胞中表达.通过对RPO30基因进行PCR扩增,克隆入表达载体pEGFP-N1,并进行双酶切及测序鉴定;将阳性重组质粒转染BHK-21细胞,检测绿色荧光蛋白的表达和RPO30...     

鸭源H9N2亚型流感病毒NS基因的克隆及表达

根据GenBank中收录的H9N2亚型流感病毒的NS基因序列设计合成了 1对引物NSU/NSL ,利用RT PCR扩增出了H9N2株NS基因 ;将该基因片段克隆到 pMD 18 T载体上 ,并对所得到的重组质粒进行酶切分析及序列测定。结果 ,获得了NS基因片段的阳性重组子 ,扩增的NS基因包含NS1基因完整的阅读框架和部分NS2基因 ,其序列与GenBank中收录的其他分离株NS基因比较 ,同源性达 96 %～ 99%。再将克隆的NS基因插入到原核表达载体 pET 2 8a后 ,转化E .coliBL2 1(DE3)感受态细胞 ,在IPTG诱导下获得了预期的蛋白表达 ,所表达蛋白质的分子质量约为 30ku。     

金黄色葡萄球菌Fc段受体结合蛋白A基因的克隆与原核表达

为研制葡萄球菌蛋白A(staphylococcal protein A,SPA)的相关免疫试剂盒,设计了1对引物,从金黄色葡萄球菌基因组中扩增出了876bp的细胞壁结合蛋白SPA基因,该基因编码292个氨基酸,包含了E、D、A、B、C 5个IgG结合结构域。构建了原核表达载体pET28a(+)-SPA,经IPTG诱导,表达出分子质量约35.0ku的SPA蛋白,并应用亲和层析柱纯化了SPA蛋白,Western-blot分析表明纯化的SPA蛋白具有生物学活性。     

鸭瘟病毒gD基因胞外区的原核表达及ELISA检测方法的建立与应用

为研究分离鉴定的鸭瘟病毒gD基因(GenBank登录号:EU195085)及其编码蛋白的应用,采用PCR方法从鸭瘟病毒CHv毒株DNA中获取编码gD胞外区基因729bp片段,构建重组表达载体pET32a-gD,转化受体菌E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达重组gD蛋白。结果显示,该重组蛋白分子质量约为31ku,为gD胞外区与载体6个组氨酸的融合表达产物,与gD胞外区预期大小一致(27.5ku);经离心收集菌体,超声裂解后,SDS-PAGE分析结果显示,gD蛋白主要以包涵体形式表达;将包涵体溶解后进行Ni-NTA亲和层析可较好地纯化重组蛋白。Western-blot检测显示,gD蛋白能与兔抗鸭瘟病毒血清特异结合,具有较好的免疫反应性。利用该蛋白建立了ELISA检测方法,优化了该方法的各个反应条件,并进行了初步应用,为该方法的临床应用奠定了基础。     

多头带绦虫六钩蚴Tm45W基因的克隆表达与免疫原性分析

为分析多头带绦虫Tm45W重组蛋白的免疫原性,利用RT-PCR技术首次从激活的多头带绦虫六钩蚴中扩增出多头带绦虫Tm45W基因。将扩增产物重组于原核表达载体pET32a(+)中,构建pET32a-Tm45W表达载体,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达融合蛋白;表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析后,将纯化的Tm45W重组蛋白免疫小鼠,用ELISA检测其血清抗体。结果显示,Tm45W基因全长为813bp,其开放阅读框为765bp,编码255个氨基酸,与多头带绦虫新疆株多头蚴45m基因(序列号:EU326106)的部分序列同源性为90.60%;表达的重组蛋白大小为45ku,与脑多头蚴病羊血清的免疫印迹分析呈阳性反应;小鼠免疫后第1周血清中即可检测到抗Tm45W蛋白的特异性抗体,并于免疫后第35天达到高峰。结果表明Tm45W重组蛋白具有较好的反应活性,能引起机体较强的体液免疫反应。