多头带绦虫六钩蚴Tm45W基因的克隆表达与免疫原性分析

为分析多头带绦虫Tm45W重组蛋白的免疫原性,利用RT-PCR技术首次从激活的多头带绦虫六钩蚴中扩增出多头带绦虫Tm45W基因。将扩增产物重组于原核表达载体pET32a(+)中,构建pET32a-Tm45W表达载体,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达融合蛋白;表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析后,将纯化的Tm45W重组蛋白免疫小鼠,用ELISA检测其血清抗体。结果显示,Tm45W基因全长为813bp,其开放阅读框为765bp,编码255个氨基酸,与多头带绦虫新疆株多头蚴45m基因(序列号:EU326106)的部分序列同源性为90.60%;表达的重组蛋白大小为45ku,与脑多头蚴病羊血清的免疫印迹分析呈阳性反应;小鼠免疫后第1周血清中即可检测到抗Tm45W蛋白的特异性抗体,并于免疫后第35天达到高峰。结果表明Tm45W重组蛋白具有较好的反应活性,能引起机体较强的体液免疫反应。     

基于线粒体nad1和nad4基因对四川省多头带绦虫种群遗传多样性的分析

为探讨多头带绦虫的种群遗传多样性,应用PCR方法扩增20株分离自四川省攀枝花市、雅安市、成都市的山羊脑部和肌间的多头蚴的线粒体nad1基因和nad4基因的部分序列,并进行分析。序列分析结果显示,20株多头蚴的pnad1基因和pnad4基因序列分别有2个和8个变异位点,长度分别为753bp和801bp,变异率分别为0~0.3%和0~0.8%,检测出3个和6个单倍型,总的单倍型多样性分别为0.574±0.055和0.742±0.074,核苷酸多样性分别为0.000 82±0.000 53和0.002 88±0.001,平均遗传距离分别为0.002和0.003。构建的种系发育树显示,四川分离株与已知多头带绦虫位于同一分支,且与分布的地理区域、寄生部位没有直接的相关性。结果表明,四川多头带绦虫的遗传多样性水平低,其中nad1基因的遗传多样性水平低于nad4基因的遗传多样性。     

多头带绦虫四川株的生物学特性

通过对2只试验犬在人工感染脑多头蚴后节片排出情况和对随机选取的50个孕卵节片内虫卵数量与大小的观察,以及用终浓度为10g/L次氯酸钠溶液,在显微镜下对虫卵孵化过程的观察,期望能为动物脑包虫病预防措施的制定以及进一步开展该虫的相关研究奠定基础。结果显示,2只试验犬分别在感染后的第45、50d开始排出节片且试验犬体内孕卵节片排出的持续时间分别为142d和54d,每日排节片数最高可达64片;孕卵节片内虫卵数最少约为780枚,最多约为16 035枚,平均为5 278.800±3 696.769枚,虫卵数量主要集中在2 000～6 000范围内,共占总节片数的52%;虫卵大小为(33.74±2.71)μm×(32.33±2.09)μm;虫卵的整个孵化过程大致需要4～5min,且随着孵化时间的延长虫卵原有的外形和整个胚膜结构消失,可见透明的六钩蚴。     

基于线粒体cox2基因的33株细颈囊尾蚴分离株种系发育关系分析

采用PCR方法从细颈囊尾蚴四川和云南两省的分离株中扩增出了线粒体细胞色素氧化酶Ⅱ亚基(COⅡ)的基因片段(pcox2),并结合GenBank中其他6种带属绦虫的同源序列进行了分析,探讨了细颈囊尾蚴与其他带属绦虫的亲缘关系。序列分析结果显示,分离自猪、山羊和绵羊的33株细颈囊尾蚴的pcox2长度均为523bp,序列间无插入、缺失,A、T、C、G碱基的平均含量分别为27.9%、41.4%、10.5%、20.1%,其中A+T含量(69.3%)明显高于G+C含量(30.6%),碱基组成存在明显偏倚。测定的33个细颈囊尾蚴分离株pcox2序列相似性较高(97.3%～100%);而与带科带属其他6种绦虫分离株的相似性均在90%以下。在构建的NJ树中,分布于我国四川和云南两省7个不同地理区域的细颈囊尾蚴聚为一支,且与地理区域、宿主没有直接的相关性。表明细颈囊尾蚴pcox2序列种内相对保守,种间差异较大,故可作为种间遗传变异研究的标记,从而为细颈囊尾蚴的种群遗传学研究和其相关疾病的诊断奠定基础。     

多头带绦虫Tm16基因的克隆表达与免疫原性分析

为分析多头带绦虫Tm16重组蛋白的免疫原性,利用RT-PCR技术从激活的多头带绦虫六钩蚴中扩增Tm16基因,将扩增产物亚克隆入pET32a(+)载体中,构建pET32a-Tm16表达载体,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达融合蛋白;表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析后,将纯化的Tm16重组蛋白免疫小鼠,用ELISA检测其血清抗体。结果显示,多头带绦虫Tm16基因序列长569bp,包括1个399bp的开放阅读框,与已报道的Tm16基因(序列号:EF672036)的序列同源性为99.8%。表达的重组蛋白大小约为30.69ku,与脑多头蚴病羊血清的免疫印迹分析呈阳性反应;小鼠免疫1周后血清中即可检测到抗Tm16蛋白的特异性抗体,并于免疫后第5周达到高峰。结果表明Tm16重组蛋白具有较好的免疫原性,可作为脑多头蚴病疫苗的候选抗原。