H9亚型禽流感病毒RT-PCR检测方法的建立

通过分析流感数据库中123个HA序列,根据HA保守区序列设计并合成了1对引物,建立了一步法RT-PCR检测方法,预期扩增片段大小为732 bp。通过对H9亚型禽流感病毒(AIV)不同稀释度的尿囊液和棉拭子浸出液进行检测,证实病毒尿囊液的最低检出量为1×104.7EID50/mL;阳性棉拭子的最低检出量为1×102.5EID50/mL。用该方法检测H1~H15亚型AIV和鸡新城疫病毒等其他14种禽病病原,结果仅有H9亚型AIV出现特异性目的条带,而其他均未出现目的条带。脏器及咽喉、泄殖腔棉拭子样品在1∶10稀释度下,病毒分离和RT-PCR方法可以达到相同的阳性检出率。表明建立的AIV H9亚型RT-PCR方法具有较好的特异性和敏感性。     

死亡大鼠看家基因mRNA时序性降解的组织差异性研究

目的研究死亡大鼠看家基因mRNA时序性降解的组织差异性,评价其用于死亡时间推断的价值。方法SD大鼠20只分为死后0、1、3、5、7d共5组,脊椎脱臼法处死大鼠,提取大鼠心、肝、脾、肺、肾、脑组织,在相应时间段提取RNA,应用一步法RT-PCR技术检测各组织中看家基因GAPDHmRNA和β-actinmRNA的水平,Vilber凝胶图像分析系统测定扩增产物IOD值,SPSS10．0统计软件对数据进行方差分析。结果GAPDHmRNA、β—actinmRNA扩增产物相对灰度与积分光密度值随死后经过时间的延长而逐渐减小,且与死亡时间显著相关,大鼠脾脏和脑组织GAPDHmRNA和β-actinmRNA在死后5d内可检出,心脏和肾脏在死后3d内可检出,而肝脏和肺脏GAPDHmRNA和β-actin mRNA降解较快,仅在死后1d内可检出。结论脑组织和脾脏中mRNA稳定性较好,适用于PMI特别是晚期PMI的推断。除环境温度外,环境湿度也是死亡时间推断中的重要影响因素。     

牛冠状病毒牛肠病毒牛病毒性腹泻病毒三重一步法实时荧光PCR方法的建立与应用

为建立一种可以快速检测牛冠状病毒（BCoV）、牛肠病毒（BEV）、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）的实时荧光PCR方法并应用于临床检测,根据BCoV N基因、BEV 5′-UTR基因、BVDV 5′-UTR基因设计3对特异性引物和探针,通过对引物、探针的浓度以及反应条件的优化,建立了牛冠状病毒、牛肠病毒、牛病毒性腹泻病毒三重一步法实时荧光PCR方法,并对该三重PCR方法的敏感性、重复性、特异性和临床样本检测结果进行了评价。结果显示,该方法灵敏度高,对BCoV、BEV和BVDV的最低检测限为10 copies/μL;重复性稳定,批内和批间变异系数（CV）均在2%以下;特异性强,对常见腹泻类病原无交叉反应。应用此方法检测河南省445份牛腹泻粪便样本,BCoV、BEV和BVDV的阳性率分别为6.5%(29/445)、17.5%(78/445)、12.1%(54/445)。上述结果表明,本研究建立了牛冠状病毒、牛肠病毒、牛病毒性腹泻病毒一步法三重实时荧光PCR方法,为疫病的快速检测及预防提供了有效的技术手段。     

印第安纳型水疱性口炎病毒一步法RT-PCR检测方法的建立

根据印第安纳型水疱性口炎病毒(VSV)L蛋白的序列,设计了一套特异性引物,建立了检测VSV核酸的一步法RT-PCR方法,并用该法检测了不同的组织样品。结果显示,人工感染VSV小鼠组织检测为阳性,而口蹄疫、猪水疱病、猪瘟、猪生殖与呼吸综合征等病料检测均为阴性,表明该方法具有较好的特异性。     

重组鸡IFN-α的高效表达与一步复性和纯化

通过在线网站以及生物学软件分析,将天然鸡IFN-α基因中的稀有密码子同义替换为大肠杆菌偏好的密码子.优化后的基因经人工合成后与温控型表达载体pWL连接并转入大肠杆菌中进行诱导表达,经SDS-PAGE分析,表达产物的分子质量约为19 ku,表达量占总蛋白的28.3%.表达产物主要以包涵体形式存在,用高浓度变性剂溶解后,采用Sephadex G50凝胶过滤一步复性并纯化重组鸡IFN-α,纯度可达98%以上.每1 L培养基可以得到47.1 mg的重组鸡IFN-α,产出率达34.14%.表达的重组鸡IFN-α在CEF/NDV检测系统上的比活性为1.12×10~8U/mg.     

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神华宁煤集团承担的煤制二甲醚间接一步法开发项目通过专家验收 由神华宁煤集团承担的国家高技术产业发展项目——“年产40万吨煤制二甲醚间接一步法新工艺技术开发”项目，近日通过专家验收。     

性别控制胚胎玻璃化一步法稀释冷冻保存技术的研究

为了创立在用户庭院就能应用的玻璃化保存性别控制胚胎的冷冻剂稀释处理方法,采用细管内3种不同液体层构成(A、B、C)法,对新鲜分割胚一步法稀释后的存活能力进行了研究;其次用特定细管最小容量冷却法与上述3种不同液体层构成中效果较好的B法对玻璃化冷冻溶解的新鲜分割胚、体外受精分割胚及冷冻溶解的体外受精分割胚进行一步法稀释后的存活能力予以对比。结果,3种不同液体层构成间胚胎的存活能力无显著差异,B法较高;应用特定细管最小容量冷却法在冷冻溶解的新鲜分割胚、体外受精分割胚及冷冻溶解的体外受精分割胚一步法稀释后的存活能力均显著高于B法。结果表明,特定细管最小容量冷却法是更有效的保存方法。     

禽流感病毒一步法RT-PCR检测方法的建立

为了能快速准确地对禽流感进行病原学诊断,根据流感病毒的M基因序列,在保守区内用Oligo4.0软件设计了1对引物,建立了一步法RT-PCR诊断方法,其目的片段大小为229 bp。通过对不同稀释倍数的H5亚型禽流感病毒尿囊液和棉拭子浸出液进行检测,结果显示,病毒尿囊液的最低检出稀释度为1∶104;阳性棉拭子的最低检出稀释度为1∶23。用病毒分离法和一步法RT-PCR同时检测人工感染鸡不同脏器、口咽及泄殖腔棉拭子样品,二者符合率为100%,但前者的检测灵敏度比后者高10~100倍。用该方法检测H1~H15亚型禽流感病毒和鸡新城疫病毒等其他14种禽病病原,所有禽流感病毒均有229 bp的目的条带出现,而其他14种禽病病原均无目的条带出现,表明该方法的特异性好。     

胶体金免疫层析一步法快速检测Glm(3)因子

建立一种简便快速的胶体金免疫层析一步法,用于检测Glm(3)因子.采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记抗人Glm(3)单克隆抗体,研制出抗人Glm(3)因子免疫层析检测试剂盒.样品的Glm(3)因子,与测试条上的金标记抗体结合后沿着反应膜移动,再与膜上固相抗体结合形成肉跟可见的红色反应带.使用该方法可检出10万倍稀释的血清样品,整个试验只需5min完成.对常见的23种动物血(痕)检验,未出现交叉反应.在100例样品的检测中,本方法的检测结果,与Dot-ELISA的检测结果的符合率为100%.该方法适用于法医物证快速检验.