不同化学激活剂对小鼠卵母细胞的激活效果

为探讨不同激活剂的卵母细胞孤雌激活效果及激活胚体外发育情况,用乙醇、Ca-A23187、SrCl2、6-DMAP及CB分别对小鼠卵母细胞进行了激活处理。结果显示,70 mL/L乙醇刺激小鼠卵母细胞时,以激活5~7 min的激活效果及孤雌胚发育较好,桑囊胚发育率可达29.11%;用SrCl2激活小鼠卵母细胞时,6~10 mmol/L为最佳处理浓度,3~6 h为最佳激活时间,桑囊胚发育率可达16.67%;以70 mL/L乙醇激活5 min,再用2 mmol/L 6-DMAP 5μg/mL CB激活3 h效果最佳,桑囊胚发育率高达35.77%。研究证实,小鼠卵母细胞经乙醇、6-DMAP和CB等复合激活后能较好地发育。     

受精液和受精时间对牦牛卵泡卵母细胞体外受精的影响

利用屠宰牦牛卵巢,抽取其表面2~5 mm的卵泡内卵母细胞,经体外成熟后分别用BO液和改良Tyrode’s液进行体外受精研究。结果表明,BO液受精6 h和改良Tyrode’s液分别受精6 h和18 h,牦牛体外受精卵的卵裂率差异不显著(分别为52.48%、47.67%和50.00%,P>0.05)。它们的4细胞发育率分别为75.47%、78.05%和64.10%,8细胞发育率分别为56.60%、56.10%和48.72%,使用改良Tyrode’s液受精18 h的发育率最低,与其他2组相比,差异极显著(P<0.01);而受精时间同为6 h时,2种受精液之间发育率的差异不显著(P>0.05)。     

不同生理状态乳牛卵巢卵母细胞基因的差异表达

为了研究不同生理状态下的卵巢卵母细胞基因的表达情况,采集乳牛的卵巢,分离了卵母细胞,以单个卵母细胞的mRNA作为模板,用设计的随机引物和锚定引物,采用一步法RT-PCR扩增了卵母细胞基因.经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,发现有功能黄体和无黄体卵巢卵母细胞基因的电泳条带之间无明显差异,对一条明显差异条带进行回收、纯化,将纯化的PCR产物连接到T栽体,阳性克隆经鉴定后,进行测序和同源性比较.结果显示,与体外培养的牛早期胚胎的一条序列具有很高的同源性.     

绵羊去透明带卵母细胞的孤雌激活

为探索一种简化的绵羊核移植操作程序,比较了不同浓度离子霉素、两种不同激活方法对保留和去除透明带的绵羊卵母细胞孤雌发育的影响。结果,2.5μmol/L离子霉素+2mmol/L 6-DMAP激活去除透明带卵母细胞时,卵裂率为78.9%,囊胚发育率为13.7%;采用5μmol/L离子霉素+2mmol/L 6-DMAP方法激活保留透明带的卵母细胞时,卵裂率为88.5%,囊胚发育率为14.7%。在WOWs培养中,对去除和保留透明带的卵母细胞,用5μmol/L离子霉素+2mmol/L 6-DMAP激活时,卵裂率分别为70.4%和69.2%,用70mL/L无水乙醇+2mmol/L 6-DMAP激活时,卵裂率分别为33.3%和23.0%,离子霉素处理组的卵裂率显著高于无水乙醇处理组。结果表明,透明带的去除与否对卵裂率没有产生影响,但各处理组的卵裂卵均未发育为囊胚。     

卵丘细胞对小鼠卵母细胞体外成熟及其后续发育的影响

观察了卵丘细胞共培养对小鼠生发泡期部分裸露(PNO)和裸卵(NO)成熟和发育能力的影响;分别用小鼠、大鼠、猪的卵丘细胞与小鼠PNO和NO进行了共培养。检测了小鼠PNO和NO的减数分裂能力、生发泡构型、受精和胚胎发育能力。结果,PNO、NO的减数分裂能力显著(P<0.05)低于卵丘完整复合体(COCs)的减数分裂能力。COCs中SN型卵母细胞比率显著高于PNO和NO中SN型卵母细胞比率(P<0.05),大部分PNO和NO的卵母细胞核型为NSN型。与对照组相比,与小鼠或大鼠卵丘细胞共培养的小鼠PNO和NO的减数分裂能力没有显著提高,但是与猪卵丘细胞共培养却可以提高小鼠PNO和NO的减数分裂能力。结果表明,猪卵丘细胞能促进小鼠卵母细胞的体外成熟,但并不影响小鼠卵母细胞的受精和胚胎发育。     

绵羊卵母细胞的差异蛋白质组学研究

为了研究绵羊卵母细胞成熟过程中蛋白质的表达模式,以期在蛋白质水平探索绵羊卵母细胞成熟的分子机制,将采用双向凝胶电泳技术获得的2-DE图谱经PDQuest8.0分析并找出差异蛋白斑点后,对差异蛋白斑点进行高效液相色谱串联离子阱质谱分析。结果显示,GV期和MⅡ期卵母细胞2-DE图谱之间存在13个表达差异明显的蛋白斑点;4个蛋白斑点的质谱检测结果较为理想,对应3种不同的蛋白质,分别为截短的VP2、苹果酸脱氢酶、谷胱甘肽转移酶M3;其中截短的VP2、苹果酸脱氢酶在卵母细胞成熟过程中表达量下调,谷胱甘肽转移酶M3在卵母细胞中大量表达并且表达量上调。结果表明,绵羊卵母细胞成熟过程中,细胞的mRNA合成和表达水平以及糖代谢水平可能降低,细胞的抗氧化和解毒能力可能提高。     

水牛卵母细胞去核方法的比较

水牛卵母细胞体外成熟22 h后,分别用盲吸法、点击法和纺锤体成像系统(Spindleview System)去核。结果,三者的去核率分别为65．1％、81．8％和95．0％,差异极显著(P< 0．01)。以水牛胎儿成纤维细胞为供体,通过核移植构建的重构胚的融合率、分裂率和囊胚发育率, 在上述3种方法之间均没有显著差异(P>0．05)。认为点击法是一种较为简单、实用和有效的去核方法。     

兔卵母细胞的孤雌激活

从电脉冲次数、脉冲强度、脉冲间隔时间三方面对兔卵母细胞的孤雌激活进行了研究。结果表明 ,注射HCG后 16h的MⅡ期卵 ,用 1.4kV/cm、6 0 μs的直流脉冲电激 ,脉冲次数分为 1、2、4、8次 4组 ,每次间隔 30min ,随着电激活次数的增加 ,活化率从 4 6 .5 %增加到 95 .8% (P <0 .0 1) ,但是电激活 8次后 ,桑椹胚率却从 6 3.6 %下降到 2 1.2 % ,囊胚率从 2 3.6 %下降到 2 .8%(P <0 .0 1) ;用 6 0 μs的直流脉冲电激 3次 ,每次间隔 30min ,分为 0 .4、1.2、2 .4kV/cm 3组 ,以1.2kV/cm脉冲强度的兔卵母细胞激活较为理想 ,脉冲强度增加到 2 .4kV/cm时 ,卵细胞死亡率升为6 7.1% (P <0 .0 1)。用 1.4kV/cm、6 0 μs的直流脉冲电激 3次 ,电脉冲间隔时间分为 30、12 0、2 4 0min 3组 ,卵细胞活化率分别为 6 8.6 %、91.5 %、91.9% (P <0 .0 1)。     

供体细胞形态、直径和传代次数对猪体细胞核移植效果的影响

通过采集猪卵巢表面的卵母细胞,经过体外成熟和去核,供体细胞经过分离、培养和传代,注核并构建重构胚胎,融合和激活重构胚胎,以探讨供体细胞的形态、直径和传代次数对猪体细胞核移植重构胚胎的发育能力和核移植效果的影响。结果显示,表面光滑的卵丘细胞作为供体细胞核移植后的分裂率和囊胚率均显著高于表面粗糙的卵丘细胞(P<0.05),虽然融合率差异不显著(P>0.05)。直径小于15μm的供体细胞核移植后的融合率显著低于直径大于30μm的供体细胞(P<0.05)。直径20～30μm供体细胞核移植后的分裂率与直径小于15μm的供体细胞组的分裂率差异显著(P<0.05),与直径大于30μm的供体细胞组差异不显著(P>0.05)。直径20～30μm的供体细胞核移植后的分裂率与囊胚率(63.73%和21.54%)较高,囊胚率有显著差异(P<0.05)。对不同代数胎儿成纤维细胞核移植效果的研究发现,6～9代成纤维细胞的融合率显著高于3～5代和≥10代的成纤维细胞(P<0.05),但卵裂率和囊胚率差异不显著(P>0.05)。结果表明,表面光滑的供体细胞有利于重构胚胎的发育,直径20～30μm的供体细胞较适合进行核移植,用传代培养6～9代...     

站在“克隆”金字塔上的人——记广西大学动物科技学院院长石德顺

正个人简介:石德顺,男,1962年出生,广西兴安县人,博士,研究员,现任广西大学动物科技学院院长,博士生导师,兼任畜禽育种国家工程实验室技术委员会委员、国家转基因生物新品种培育重大专项执行专家组专家等职务。多年来一直从事动物克隆及体外受精等技术的研究与开发工作。先后丰富和发展了牛卵母细胞体外成熟、体外受精和胚胎早期发生的理论,在国内建立了一套高效的牛体