口蹄疫病毒3D基因的真核表达及其表达产物的功能分析

利用RT-PCR技术扩增口蹄疫病毒(FMDV)编码RNA依赖的RNA聚合酶的3D基因,经测序确认后将其克隆到真核表达质粒载体pcDNA3.1( )中,重组质粒pcDNA3.1( )-3D经HindⅢ、XbaⅠ双酶切后转染至BHK-21细胞,用纯化的目的蛋白进行Western-blotting鉴定,并预测该3D基因表达产物的三级结构。结果显示,获得分子质量约55 ku的单一3D基因表达产物,其三级结构较为保守。利用RNA细胞内复制体系和荧光定量RT-PCR技术,证明3D基因表达产物在细胞内可促进口蹄疫病毒基因组的复制。     

番鸭花肝病病原的研究

从广西患花肝病的雏番鸭肝、脾分离到 3株病毒 ,定名为NM1、NM2 、NM3。这 3株病毒能在番鸭胚和番鸭胚成纤维细胞上增殖 ,并产生细胞病变。人工感染 1日龄番鸭致死率达 10 0 % ,但对鸡、康贝尔鸭和鹅不致病。分离毒对氯仿不敏感 ,耐热、耐酸 ,不被DNA抑制物所抑制。分离毒的细胞培养物经超薄切片 ,磷钨酸负染 ,在电镜下观察到大量球形、实心 (少量空心 )的病毒粒子 ,其直径 6 6～ 70nm ,无囊膜 ,属无囊膜的RNA病毒     

病毒性出血败血症病毒实时荧光RT-RPA恒温检测方法的建立

为建立一种简单、快速的病毒性出血败血症病毒(VHSV)检测方法,本研究通过比较分析VHSV N基因的保守序列,设计了多对引物和一条探针。经过筛选优化,建立了实时荧光RT-RPA检测方法。该方法在39℃恒温反应20 min即可快速、特异性地检测出VHSV,与其他水生动物病毒不发生交叉反应,该方法检测限为1.83×10^3PFU/mL,利用本研究方法对30份鲑鳟鱼临床样品以及9份鱼类疫病病原样品进行检测,检测结果与荧光定量PCR方法结果一致。上述结果表明,本研究建立的检测方法操作简单,反应灵敏,结果可靠,仪器依赖性低,适用于现场对VHSV快速检测。     

荧光标记复合扩增检测4个STR基因座多态性

目的建立荧光标记复合扩增D1S2142,D13S1492,D14S306,D15S659基因座检测分型方法,并对成都汉族群体4个基因座的遗传多态性进行调查。方法用6-FAM标记D1S2142和D15S659引物,HEX、TMR分别标记D14S306和D13S1492引物,PCR复合扩增,310基因分析仪电泳自动收集电泳结果数据,GeneScan Analysis Software3.7NT软件计算扩增产物片段相对大小,Genotyper(3.7NT软件进行样本基因型分型,建立了荧光标记复合扩增检测4个STR基因座基因型的方法,对145名成都汉族无关个体样本进行分型。结果荧光标记复合扩增D1S2142,D13S1492,D14S306,D15S659基因座,每个STR基因座都获得了清晰的基因型分型结果。145份样本,4个STR基因座分别检出10,14,7,12个等位基因和22,54,21,39种基因型,其基因型分布均符合Hardy-W e inberg平衡。4个基因座在成都汉族群体的杂合度分别依次为0.7793,0.8345,0.7793和0.8345;多态信息含量分别依次为:0.7656,0.8730,0.7470和0.8312。累计非父排除率为0.9783,累计个人识别机率为0.9999 917。结论荧光标记复合扩增D1S2142,D13S1492,D14S306,D15S659基因座,可实现对每个基因座准确分型;成都汉族群体该4个基因座的遗传学数据,可为群体遗传学和法医学研究与应用提供基础资料。     

利用DNA和RNA进行死亡时间推断的研究进展

死亡时间是法医和刑事侦查工作者在调查犯罪行为和其他死亡事件中所需要的重要信息之一。但是目前死亡时间推断所使用的传统方法常受到经验和环境的影响，从而降低推断的准确性。由于DNA和某些RNA在细胞内的含量十分稳定，而且个体死亡后这些遗传物质随着死亡时间的延长呈有规律地降解，所以通过测定死后细胞内的DNA和RNA含量推断死亡时间成为法医学的研究热点。     

死亡时间——当今中国法医病理学研究的热点及难点

在法医病理学研究的诸多重要问题中,时间问题无疑是其中的一个热点问题,同时也是一个难点问题。法医病理学中的时间问题主要包括:死亡时间、损伤时间、猝死者病理学标本能够诊断的时间(包括发病多久可以诊断及保存多久可以诊断)、水中经过时间等,其中尤其以死亡时间为研究热点。现结合本单位的研究结果,就死亡时间推断问题做一介绍。     

Developmental Validation of the Quantifiler® Duo DNA Quantification Kit for Simultaneous Quantification of Total Human and Human Male DNA and Detection of PCR Inhibitors in Biological Samples*

Abstract: The Quantifiler^® Duo DNA Quantification kit enables simultaneous quantification of human DNA and human male DNA as well as detection of inhibitors of PCR in a single real-time PCR well. Pooled human male genomic DNA is used to generate standard curves for both human (ribonuclease P RNA component H1) and human male (sex determining region Y) specific targets. A shift in the cycle threshold (C_T) values for the internal positive control monitors the presence of PCR inhibitors in a sample. The assay is human specific and exhibits a high dynamic range from 0.023 to 50 ng/μL. In addition, the multiplex assay can detect as little as 25 pg/μL of human male DNA in the presence of a 1000-fold excess of human female DNA. The multiplex assay provides assessment of the DNA extract and guidance for the selection of the appropriate AmpFℓSTR^® Amplification Kit to obtain interpretable short tandem repeat profiles.     

猪传染性胃肠炎病毒聚合酶基因反义RNA对病毒的抑制作用

通过PCR扩增出猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)聚合酶部分片段,反向插入逆转录病毒表达载体pLXSN中,用脂质体法将重组质粒plxas-pol转染PA317细胞,经抗生素G418筛选出稳定的产毒细胞克隆,分别扩大培养后,取其上清液感染小鼠成纤维细胞NIH3T3,细胞克隆产生的重组病毒效价达9.0×105CFU/mL。用高效价假病毒感染IBRS2细胞,再经抗生素G418筛选,提取细胞克隆总RNA,经RT-PCR证明plxas-pol整合入IBRS2细胞。以TGEV感染IBRS2细胞和具有抗性的IBRS2细胞所产生的细胞病变为指标,证明该反义RNA对病毒有明显抑制作用,抑制率约为80%。用2×103和4×102TCID50/mL剂量的TGEV感染时,引起细胞死亡的时间分别为21 h和27 h,与对照组相比,抗性细胞系可明显延迟因病毒感染引起细胞死亡的时间。     

应用反转录-聚合酶链反应检测动物组织中的口蹄疫病毒

应用反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术检测了猪和牛的扁桃体、淋巴结、脊髓、肌肉和蹄冠皮肤中的口蹄疫病毒（ＦＭＤＶ）。与接种乳鼠测毒法比较，该方法的灵敏度达０．１６ＬＤ５０～０．３２ＬＤ５０病毒量。检测人工感染后７～３５ｄ的猪组织样品７７份，２５份为阳性；接种乳鼠并盲传３代，乳鼠－间接血凝试验（ＩＨＡ）鉴定６份为阳性。检测人工感染后４～７ｄ的牛组织样品５２份，２０份为阳性；接种乳鼠－ＩＨＡ鉴定１２份为阳性。检测野外鲜肉样品４７份，１２份为阳性；任选其中８份样品接种细胞单层，盲传至第６～７代，先后有５份样品产生ＣＰＥ；其中６份样品同时接种乳鼠，盲传至第６～７代，３组乳鼠出现ＦＭＤＶ致病症状，ＩＨＡ鉴定为阳性。检测冻猪肉样品３７份，３份为阳性；冻牛肉样品９份、冻羊肉样品１０份，均为阴性     

H9N2亚型禽流感病毒聚合酶基因的克隆及序列分析

采用RT-PCR方法对1株H9N2亚型禽流感病毒Ck/GS/2/99株RNA聚合酶基因PB2、PB1和PA分别进行了扩增,将其克隆到pGEM-T easy载体后进行序列测定与分析。结果表明,该株病毒的PB2、PB1和PA基因开放阅读框(ORF)分别由2280、2274和2 151个碱基组成,分别编码759、757和716个氨基酸。经同源性与系统发生树分析,该毒株RNA聚合酶基因PB2、PB1和PA与Ck/NX/4/99株的核苷酸和氨基酸同源性均在98%以上,另外这3个基因与Dk/HK/Y280/97、Sw/HK/9/98和Qu/HK/NT/28/99株的关系密切。