猪细小病毒Z株NS部分基因的扩增及序列分析

从猪细小病毒Z株提取基因组DNA ,利用PCR扩增部分基因 ,并对该扩增片段进行测序与分析。结果表明 ,扩增的NS基因长 330bp ,编码 10 9个氨基酸。氨基酸序列中含有猪细小病毒的重要保守序列 ,并有 1个潜在的糖基化位点NFSN。Z株NS基因与其他猪细小病毒Kresse、NADL2 2、NADL2 1株的核苷酸同源性分别为 99%、98%、98% ,氨基酸同源性均为 99%。     

H9N2亚型禽流感病毒华东分离株的生物学特性及遗传进化分析

对从华东地区分离的6株鸡源H9N2亚型禽流感病毒进行了生物学特性及血凝素(HA)基因和神经氨酸酶(NA)基因的分子遗传进化分析.发现这6株病毒对SPF鸡无致病性,IVPI均为0,可被单克隆抗体4E7分为2个亚群.序列分析表明,这6株病毒的HA基因裂解位点处的氨基酸序列均为RSSR↓GLF,Ck/HD/16/07和Ck/HD/112/05的潜在糖基化位点与其他4株不一致;NA基因为N2亚型,其中4个毒株的茎部缺失3个氨基酸,而另2个毒株无缺失.     

禽流感病毒A/Turkey/Canada/63毒株HA和NA基因的克隆及序列分析

用SPF鸡胚增殖禽流感病毒(AIV)A/Turkey/Canada/63毒株,提取病毒基因组总RNA,应用RT-PCR技术分别扩增该病毒分离株的HA和NA基因全片段,并克隆到pMD18-T载体上。测序结果表明,该毒株的HA基因全长为1745bp,含有完整的阅读框架,编码566个氨基酸；NA基因全长1467bp,编码469个氨基酸。BLAST序列比较结果显示,该毒株HA基因属于H6亚型,NA基因属于N2亚型。将获得的HA和NA基因与AIV数据库中H6和N2基因进行遗传演化分析,表明该毒株HA基因与其他H6基因核苷酸的同源性为80.5%～87.3%,氨基酸的同源性为88.0%～93.1%；NA基因与其他N2基因核苷酸的同源性为86.0%～93.5%,氨基酸的同源性为90.6%～96.3%。     

猪瘟野毒E2基因同源性比较

以人工感染发病猪的脾为材料提取总RNA ,根据已报道的猪瘟病毒基因组序列 ,设计合成了 2对引物 ,以总RNA为模板 ,利用反转录聚合酶链式反应 (RT PCR)、套组聚合酶链式反应(nPCR)及测序技术 ,对流行于我国甘肃省、陕西省、宁夏和广西自治区的 5株野毒株的主要外膜糖蛋白E2基因的核苷酸序列进行了测定 ,用DNAstar软件比较分析了 5株野毒之间及其与猪瘟兔化弱毒株 (C ST株 )E2基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列的同源性。结果发现 ,5株野毒与C ST株核苷酸序列的同源性为 81.7%～ 83.1% ,氨基酸同源性为 87.3%～ 88.6 % ,表明它们之间存在较大的差异 ;但 5株野毒之间核苷酸序列的同源性高达 98.8%～ 99.3% ,氨基酸同源性为96 .6 %～ 99.2 % ,表明它们之间的差异较小     

一株野生灰雁禽流感H9亚型病毒全基因序列的测定与分析

为研究新疆野生灰雁禽流感毒株的基因变异与演化,选择A/Grey goose/XJBZH/1/09(H9N2)株,应用RT-PCR对该毒株的8个基因片段进行了克隆、序列测定与分析。结果,该毒株的HA、NA、NS、M、NP、PB1、PB2和PA这8个基因的核苷酸序列长度分别为1 831、1 548、1 077、1 202、1 705、2 342、2 426和2 319bp。基因序列分析表明,该毒株的HA基因与鸡源毒株A/Chicken/Xinjiang/01/2010(H9N2)的同源率为99.3%;HA和NA基因与鸽源毒株A/pigeon/HongKong/WF53/03(H9N2)的同源率分别为91.5%和91.1%;HA、NA、NS和PB1基因与猪源毒株A/swine/Yangzhou/1/2008(H9N2)的同源率分别为97.5%、97.8%、96.9%和97.5%;NA基因与人源毒株A/Shaoguan/408/98(H9N2)的同源率为93.8%;M、NP、PA和PB2基因与所选的全部参考毒株的同源率均很低。遗传进化分析表明,A/Greygoose/XJBZH/1/09(H9N2)株属于欧亚种系,位于Y280-like亚群。     

H7N2禽流感病毒分离株血凝素蛋白全基因的序列分析

为进一步分析H7N2禽流感病毒(AIV)分离株血凝素(HA)基因的特性,参照已发表序列设计了1对引物,采用RT-PCR获得了1条约1.7 kb的DNA片段,测序后进行了同源性比较、HA基因系统发育进化树分析和氨基酸编码分析。结果表明,所测的2个分离株的HA基因全长1 664 bp,编码除信号肽以外的HA蛋白的全部544个氨基酸,其中包括HA1的323个氨基酸,HA2的221个氨基酸。2个分离株HA基因核苷酸序列的同源性为99.4%;与GenBank中AIV标准株A/Afri.Star./Eng-Q/983/79(H7N1)的同源性最高,分别为99.4%和99.0%;与美国A/Chicken/NewYork/13142-5/94(H7N2)株同源性很低(仅65.0%),而与以色列、意大利H7N2AIV的同源性较高(为96%~97%);2个分离株在HA基因进化树中均处于H7亚型AIV的欧亚群系分支内。推导氨基酸的序列分析表明,其HA蛋白裂解位点的氨基酸序列为-GR-GLF-,仅包含1个碱性氨基酸(R-)残基,符合低致病力AIV的基因特征。     

H9亚型禽流感病毒分离株A/Chick/Shandong/6/96的基因序列分析

对1株H9N2亚型禽流感病毒(AIV)A/Chick/Shndong/6/96(H9N2)进行了全病毒基因序列分析.结果表明,该毒株8个基因的核苷酸序列皆与1994年分离株A/Chicken/Beijing/l/94(H9N2)具有很高的同源性(96.0%-98.6%);推导其血凝素(HA)裂解位点处的氨基酸序列为A-R-S-S-R,完全符合H9 AIV欧亚分支中的类A/chicken/Beijing/1/94亚分支的特征;虽然其神经氨酸酶(NA)基因与A/Chicken/Beijing/l/94(H9N2)相比,出现了9个核苷酸的缺失,然而其同源性仍然较高,为97.3%;而与欧亚分支中的类A/Chicken/Korea/323/96和类A/Quail/HongKong/G1/97亚分支的同源性却相对较低,分别为92.0%和84.2%;其它基因的比较情况也大体相近.提示该毒株是由1994年分离株进化而来,在遗传演化上属于H9亚型流感病毒欧亚分支中的类A/Chicken/Beiing/l/94(H9N2)亚分支.     

组成新发典型甲型H1N1流感病毒8个基因片段的变异性分析与疫病流行原因初探

为探索新近暴发的甲型H1N1流感病毒各基因片段的变异性与本次疫病流行的内在原因,以NCBI GenBank中报道的l株新发的典型H1N1甲型流感病毒A/New York/1669/2009(H1N1)作为研究对象,运用在线BLAST和CLUSTAL X等生物信息学软件对其PA、NP、M、PB1、PB2、NA、HA和NS基因片段进行了比较分析.结果表明,新发甲型H1N1流感毒株的PB1、NP基因来源于人源谱系流感病毒,HA、NA、NS、M基因来源于猪源谱系流感病毒,PB2和PA基因来源于禽源谱系流感病毒.此外,新发甲型H1N1流感病毒的HA和NA分别在第249和386位新出现1个"-NTT-"、"-NFSI-"的糖基化位点.HA的6个潜在抗原决定簇中有3个发生了氨基酸序列改变,NA则是12个中有5个发生了改变.表明,这些抗原基因的大范围重组与高频率变异可能是造成这次流感暴发与大规模流行的根本原因.     

H9N2亚型猪流感病毒A/Swine/Shandong/1/02 分离株的基因序列分析

从有肺炎症状的病猪中分离到1株H9N2亚型猪流感病毒(SIV)A/Swine/Shndong/1/02,对其进行了全病毒基因序列分析.结果表明,该毒株8个基因片段的核苷酸序列均来自禽流感病毒(AIV),与我国目前家禽中流行的H9N2亚型AIV毒株具有很高的同源性,与A/Duck/Hong Kong/Y280/97(H9N2)的同源性为94.1%～98.9%,与A/Chicken/Beijing/1/94(H9N2)的同源性为94.5%～98.2%;推导的其血凝素(HA)裂解位点处的氨基酸序列为P-A-R-S-S-R,完全符合H9亚型AIV欧亚分支中的类A/Chicken/Beijing/1/94亚分支的特征;基因分析结果表明,该分离株的所有基因片段均来源于H9N2亚型AIV,它可直接感染猪,并导致发病,但它并未在猪体内发生重组.     

番鸭呼肠孤病毒ZJ99株σC蛋白基因的克隆与序列分析

参考已发表的番鸭呼肠孤病毒(mDRV)的S4序列设计了1对扩增σC蛋白基因的引物,对mDRVZJ99株的RNA抽提物进行RTPCR扩增,获得了特异性的扩增片段。将PCR产物克隆测序,序列经同源性比较,发现mDRVZJ99株σC蛋白基因序列与福建MW9710株对应基因的同源性为99.5%,与法国89026株对应基因的同源性为94.2%,与法国89330株对应基因的同源性为95.0%;相应的氨基酸序列同源性分别为98.9%、94.1%、93.7%。基于σC基因及其推导氨基酸序列的蛋白质结构及物理化学性质预测结果,与国外学者对mDRVσC蛋白的报道相似。     

乐果亚急性暴露对大鼠胆碱酯酶浓度及细胞色素P450亚型表达量的影响

对6周龄雄性Wistar大鼠5次灌胃给予20%LD_(50)的乐果,观察给药后大鼠的毒性反应,每日测定实验鼠采食量、饮水量和体重。最后一次给药后第24 h,采用丁酰硫代胆碱法测定大鼠红细胞、血清和脑组织中的胆碱酯酶浓度,并采用定量RT-PCR法检测大鼠肝中细胞色素P450基因8个亚型的表达量。结果表明,大鼠用药后不同时间内出现了有机磷药物中毒的典型症状,其采食量、饮水量和体重明显下降,红细胞、血清和脑组织中胆碱酯酶浓度均明显低于对照组,肝细胞色素P450的8个亚型中CYP2B1/2的表达量明显高于对照组。     

猪链球菌2型三种重组表达蛋白对BALB/c小鼠的免疫保护性评价

将150只BALB/c小鼠随机分成5组。用猪链球菌2型pET32a-Sly、pET32a-38ku和pET32a-Sly-38ku表达的重组蛋白制备的疫苗,以及猪链球菌2型全菌灭活疫苗分别免疫A、B、C、D组小鼠,E组为生理盐水对照。首免后第2周加强免疫1次,二免后第2周,用致死量强毒猪链球菌2型四川分离株和江苏分离株以及马链球菌兽疫亚种安徽分离株攻毒,观察攻毒后对小鼠的免疫保护率。结果,A组与C、D组对猪链球菌2型感染的保护率差异显著(P<0.05),而C组与D组之间保护率无显著差异;A、B、C、D组之间对马链球菌兽疫亚种安徽分离株感染的保护率差异不显著;各免疫组的保护率极显著高于对照组。结果表明,3种重组疫苗具有良好的免疫原性,能对强毒株猪链球菌2型的攻击感染起到保护作用。     

猪圆环病毒2型感染裸鼠及BALB/c小鼠的研究

用猪圆环病毒2型(PCV2)经腹腔注射BALB/c小鼠及裸鼠各15只,每隔2周1次,共感染3次。BALB/c小鼠初次、再次感染后均未出现明显的临床症状,仅有2只小鼠出现病理变化;从血清中可检测到PCV2核酸及其ORF2抗体;同时淋巴细胞增殖反应显著增强,NK和CTL细胞杀伤率显著升高;CD4+、CD8+、CD3+T淋巴细胞及CD19+B淋巴细胞数量显著减少。裸鼠也未出现明显的临床症状,从血清中可检测到PCV2核酸,但未检测到PCV2 ORF2抗体;除NK细胞杀伤率显著升高外,其余免疫学指标无显著改变。结果表明,BALB/c小鼠比裸鼠对PCV2易感,各项免疫学指标变化与PCV2感染猪一致,但不表现临床症状,仅个别BALB/c小鼠出现病理变化,说明BALB/c小鼠对PCV2不如猪易感。     

Preparing NATO for the Future – Operating in an Increasingly Contested Environment

The global proliferation of precision-strike systems may be challenging the foundations of Western military-technological supremacy. Relatedly, the development of so-called Anti-Access and Area Denial (A2/AD) capabilities across the globe threatens to complicate Western freedom of military movement and access, and could give way to a more contested military-strategic environment. The twin challenges of precision-strike proliferation and A2/AD strongly impact NATO’s agenda, which revolves around strengthening deterrence and defence in Eastern Europe, and addressing the different threats emanating from the so-called Southern European neighbourhood. In order to address or mitigate such challenges, the Alliance needs to produce operational concepts and capabilities able to deliver deterrence and expeditionary warfare in a maturing precision-strike environment, one characterised by the emergence of A2/AD capabilities.     

中华鳖TLR2部分序列的克隆及其组织表达差异分析

为探究中华鳖天然免疫的分子机制,针对TLR2(Toll-like receptor 2)保守区设计兼并引物,从中华鳖脾cDNA中扩增出了740bp的目标序列。测序和序列分析结果表明,该序列包含富含半胱氨酸型C端结构域、跨膜结构域和TIR结构域;与斑马鱼、鸡等脊椎动物相应的TLR2序列相似性为60.5%～74.4%。采用荧光定量PCR检测中华鳖感染嗜水气单胞菌后各组织TLR2mRNA表达的变化,结果显示,感染后第24小时,中华鳖脾和外周血TLR2mRNA相对表达水平升高,其中外周血中的增幅最显著,是对照组的8.57倍;中华鳖外周血经4μg/mL酵母聚糖刺激后,第2小时TLR2mRNA相对表达水平较高。首次获得了中华鳖TLR2部分cDNA序列,并分析了不同刺激物对中华鳖TLR2mRNA转录的影响。     

猪戊型肝炎病毒广西株ORF2三段连续基因编码蛋白的表达及抗原性分析

为了确定猪戊型肝炎病毒(HEV)ORF2抗原性片段的分布,参考中国T1株序列设计套式引物,从新鲜猪粪中扩增出HEV部分基因片段,长1725bp,位于ORF2第205～1929bp之间,命名为HEVORF2-A。根据HEVORF2-A序列设计了3对引物,分别扩增HEVORF2-A三段连续的基因片段,命名为HEVORF2-B1、HEVORF2-B2、HEVORF2-B3,分别位于HEVORF2-A第1～576bp,577～1149bp,1150～1725bp之间。将这4段扩增的基因片段分别与表达载体pET32a(+)连接,并转入BL21(DE3)pLysS感受态细胞,经IPTG诱导,SDS-PAGE分析。结果显示,经1mmol/LIPTG37℃诱导6h后,除pET32a-A在82.6ku处有微量融合蛋白表达外,pET32a-B1、pET32a-B2、pET32a-B3分别在41.3ku、41.5ku、41.8ku处有高水平的融合蛋白表达。用自然感染猪血清和北京万泰HEVELISA诊断试剂盒阳性对照血清进行Western-blot分析,结果3个短的融合蛋白均能检测到明显的条带,表明构建的3个表达载体具有良好的抗原性。     

PCV2 ORF2 B细胞表位与PPV VP2真核表达质粒的构建及其免疫原性

为了研究猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2B细胞表位与猪细小病毒(PPV)VP2重组真核表达质粒的免疫原性,将PCV2ORF2的B细胞表位基因(141～257bp)重组到PPV SC-1株VP2基因的N端,构建了真核表达质粒pCI-VP2.ORF2B。用脂质体转染法将重组质粒pCI-VP2.ORF2B转染至Vero细胞中,利用间接免疫荧光法检测其在体外的表达情况。将重组质粒免疫小鼠,并设猪细小病毒灭活疫苗、猪圆环病毒亚单位疫苗和空载体对照组,采用MTT比色法、流式细胞术和ELISA法分别对免疫小鼠脾淋巴细胞的转化功能,外周血CD4+和CD8+淋巴细胞比例,PCV2和PPV IgG抗体效价进行了检测。结果表明,转染Vero细胞后第48小时用间接免疫荧光法能在荧光显微镜下观察到绿色荧光,检测到特异性蛋白的表达;pCI-VP2.ORF2B免疫组脾淋巴细胞从第7天开始对ConA有明显反应,显著高于对照组;CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴细胞的数量高于或显著高于对照组;在免疫后第14天检测到PPV/PCV2IgG抗体。提示pCI-VP2.ORF2B能够有效诱导机体产生细胞免疫和体液免疫反应。     

阿维菌素对体外培养王鸽神经细胞内游离钙离子浓度及CaM mRNA表达的影响

提取美国王鸽8～9日龄鸽胚脑神经细胞进行体外培养,按照阿维菌素(AVM)染毒的剂量分成4组,分别为0ìg/L(Ⅰ组)、2.5 ìg/L(Ⅱ组)、5 ìg/L(Ⅲ组)和10 ìg/L(Ⅳ组),染毒24 h后,用MTT法进行细胞活性检测,应用荧光探针法检测细胞内游离Ca2+浓度,应用半定量RT-PCR法检测细胞内CaM mRNA的表达水平.结果显示,AVM能够引起王鸽神经细胞内游离Ca2+浓度升高,CaM mRNA表达水平下降.表明AVM能影响王鸽体外培养神经细胞内的钙稳态.     

猪圆环病毒2型武威株ORF2基因序列分析及真核表达载体的构建

根据GenBank中猪2型圆环病毒(PCV-2)的核酸序列,设计了1对引物,采用PCR方法从疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的死亡仔猪组织病料中扩增出了ORF2基因,将其克隆到pMD18-T载体上,筛选获得了重组质粒pMD18-T-ORF2。对此重组质粒进行序列测定分析,结果表明,克隆的ORF2基因与其他PCV-2的ORF2核苷酸序列同源性为92.0%~93.3%,推导氨基酸序列的同源性为82.9%~84.6%。重组质粒pMD18-T-ORF2经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切,将回收的ORF2基因转移入真核表达载体pIRES,成功构建了重组质粒pIRES-ORF2。     

冷应激对雏鸡空肠黏膜前列腺素E2含量和环氧合酶-2 mRNA表达的影响

以15日龄健康雏鸡为试验对象,进行急性和慢性冷应激(12±1)℃处理,检测空肠黏膜前列腺素E2(PGE2)含量和环氧合酶-2(COX-2)mRNA的表达量。结果显示,急性冷应激时空肠黏膜PGE2含量和COX-2mRNA的表达量无显著变化;慢性冷应激时,空肠黏膜PGE2含量和COX-2mRNA表达量均显著升高,并随着冷应激时间的延长而降低。说明冷应激可引起雏鸡空肠黏膜PGE2含量和COX-2mRNA表达量的变化,这些变化可能在冷应激对肠道的损伤中起一定的作用。