江苏省猪高热病病例主要继发感染病毒的多重PCR检测

应用建立的2个多重PCR方法,对2005~2006年收集于江苏省的211份猪高热病疑似病料进行了检测。结果,PRRSV阳性率为51.2%,PCV2阳性率为44.1%,CSFV阳性率为10.4%,PPV阳性率为3.9%,PRV阳性率为2.4%。2005年病料中PCV2阳性率为21.2%,2006年为73.2%;2005年PRRSV阳性率为38.1%,2006年为67.7%。2006年猪高热病疫情比2005年严重,PCV2和PRRSV可能在其中发挥了协同致病作用。对10个PRRSV分离株ORF5基因和Nsp2基因进行的测序表明,2006年分离株Nsp2基因中有连续87个碱基的缺失。     

猪体恩诺沙星内服和肌注途径给药排泄规律的比较

给10头猪分别按体重5 mg／kg单剂量内服和肌注恩诺沙星。采集自然排泄的猪粪、尿,用高效液相-荧光法测定恩诺沙星及其代谢产物环丙沙星浓度,计算采样间隔内单位时间药物排泄量占给药量的比例,比较2种不同给药途径原形药物和环丙沙星的排泄规律。结果显示,2种给药途径对恩诺沙星和环丙沙星总排泄量的影响不显著,仅对药物排泄量与时间之间的关系产生影响; 2种给药途径的试验猪粪样中恩诺沙星的排泄量均高于尿样;内服与肌注给药后96 h内,粪和尿中检出的环丙沙星分别占给药量的3．93％和4．02％,累积排泄的恩诺沙星和环丙沙星之和分别占给药量的9．89％(内服)和9．57％(肌注)。     

猪瘟病毒荧光RT-PCR快速检测方法的建立

以猪瘟病毒5′端非编码区为靶核酸序列设计引物和探针,建立了一步法荧光RT-PCR检测猪瘟病毒。荧光RT-PCR仅检测出猪瘟C株、T株,未能检测出牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪呼吸系统冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪细小病毒、伪狂犬病病毒、猪生殖与呼吸综合征病毒、PK-15细胞和牛睾丸原代细胞;对猪瘟病毒T株的扩增反应产物进行了测序分析,与预期序列相符。荧光RT-PCR的检测极限可达到1 TCID50/mL,整个试验流程只需2 h。采用荧光RT-PCR和抗原捕获ELISA同时检测临床病料、猪副产品共207份样本,两种方法的检出率分别为17.4%和13.5%,两者符合率为95.7%(198/207);荧光RT-PCR的检出率高于ELISA,两者差异显著。结果表明,建立的荧光RT-PCR可用于猪产品、临床病料中猪瘟病毒的快速检测。     

猪血管内皮细胞体外生长特性的研究

试验以体外分离培养的猪血管内皮细胞为材料 ,研究了细胞的生长曲线、不同基础培养基对细胞生长的影响及胰岛素在生长液中的适宜含量。结果表明 ,传代猪血管内皮细胞接种后有1d左右的滞留期 ,然后细胞进入对数生长期 ,可持续 2d ,第 5d进入平台期 ,第 8d细胞开始脱落死亡 ;与MEM相比 ,M 199更适合于用作培养猪血管内皮细胞的基础培养基 ;在不用贴附基质和内皮细胞生长因子 (ECGF)的条件下 ,生长液中加入胰岛素 ,可明显促进细胞的生长和增殖 ,胰岛素的最适用量为 8μg/mL。     

长白猪IL-6基因的克隆及其序列分析

用PHA和LPS诱导猪脾和淋巴结淋巴细胞,提取细胞总 RNA,利用 RT-PCR技术克隆猪IL-6的cDNA并进行序列测定与分析。测序结果及同源性分析表明,已扩增到 IL-6 基因,大小约为669 bp,含有1个639 bp的开放阅读框,编码212个氨基酸,其中前28个氨基酸为信号肽,且碱基序列在不同种属动物间差别较大。分组诱导表明,LPS效果更佳,PHA和 LPS联合诱导能使更多的IL-6转录表达。     

非洲猪瘟CD2v胞外区基因片段的真核表达及其多克隆抗体的制备

本研究利用真核表达系统表达非洲猪瘟病毒的CD2v胞外区蛋白,研究其免疫特性,制备多克隆抗体并研究其性质,为研发特异性单抗奠定数据基础。以非洲猪瘟病毒Wuhan2019-1株(GenBank:MN393476.1)为模板,合成CD2v胞外区基因序列,并将其克隆至真核表达载体pCAGGS载体中,获得pCAGGS-CD2v胞外区重组质粒。经酶切和测序鉴定后,将重组质粒转染293F细胞,获得重组胞外CD2v蛋白(简称His-CD2v)。用Ni-NTA柱纯化His-CD2v,并以此为抗原免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,利用ELISA和间接免疫荧光对多克隆抗体进行鉴定。结果显示,(1)His-CD2v融合蛋白在293F中以可溶形式表达,SDS结果显示,相对分子质量约为35~80 ku的弥散带;(2)融合表达的His-CD2v能与阳性血清反应,与对照不反应;(3)HisCD2v制备的多抗效价最高达1∶218700,且能与阳性血清竞争性结合CD2v抗原。上述结果表明,His-CD2v融合蛋白的表达及其多抗的成功制备,为进一步筛选CD2v特异性单抗及研制竞争ELISA试剂盒,为非洲猪瘟感染与免疫鉴别方法的建立奠定了坚实的基础。     

广东省猪源葡萄球菌耐药性分析及多重耐药基因cfr的流行现状

为了解2013-2017年间广东省猪源葡萄球菌的耐药情况及多重耐药基因cfr的流行现状,采集生猪养殖场和交易市场猪鼻腔拭子分离葡萄球菌,采用琼脂稀释法测定分离菌株对14种抗菌药物的敏感性,并用PCR检测mecA和cfr基因的携带情况。结果显示,在采集的4099份样品中分离到葡萄球菌1485株,其中金黄色葡萄球菌173株。猪源葡萄球菌对红霉素、四环素、泰妙菌素、克林霉素、沃尼妙林和氟苯尼考耐药严重,耐药率分别为91.0%、90.2%、87.7%、84.6%、84.6%及82.0%,对利福平和利奈唑胺相对敏感,未发现万古霉素耐药菌株;庆大霉素、四环素、红霉素和环丙沙星的耐药率呈现逐年上升的趋势。在1485株葡萄球菌中,mecA和cfr的检出率分别为39.9%和12.3%。cfr阳性菌株常携带多种耐药基因,cfr基因的遗传背景也呈现多样化。结果表明,广东省猪源葡萄球菌的耐药情况严重,cfr的检出率高,应加强养殖业中抗菌药物的规范和合理使用,减缓耐药性的产生和传播。     

茜草素的抗菌活性与药效试验

用化学合成的茜草素做了体外抑菌试验、体内抗菌活性试验、人工感染猪多杀巴氏杆菌疗效试验、急性毒性试验及临床治疗试验。结果表明,茜草素在体外对金黄色葡萄球菌、变形杆菌、大肠埃希氏菌、绿脓杆菌、沙门菌和克雷伯氏菌等均有显著的抑制作用,对后4种病原菌的抑制作用超过了六茜素。在小白鼠体内对大肠埃希氏菌也有非常显著的抗菌作用。对人工感染多杀巴氏杆菌的患病仔猪有显著的治疗作用。小白鼠腹腔注射茜草素的LD50为336 mg/kg。茜草素对临床型乳牛乳腺炎的治愈率为87.5%,总有效率为100%。     

猪促卵泡激素α和β亚基基因的克隆及其重组腺病毒表达载体的构建

为探索人工制备猪促卵泡激素的可行性,从猪的脑垂体中抽提总RNA,通过RT-PCR方法,克隆了猪促卵泡激素α、β亚基基因,并将其分别定向插入腺病毒穿梭质粒中,通过转化BJ5183-AD-1细胞继而构建含有猪促卵泡激素α、β亚基基因的重组腺病毒质粒;将含有猪促卵泡激素α、β亚基基因的重组腺病毒质粒转染AD-293细胞,细胞产生病变,证实猪促卵泡激素α、β亚基基因重组腺病毒表达载体构建成功.     

猪瘟病毒E2蛋白B细胞识别基序的筛选

根据猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)E2蛋白的序列设计并人工合成18条重叠多肽,与载体蛋白BSA偶联后,利用抗CSFV E2蛋白单克隆抗体SWmAb8筛选该蛋白上的B细胞表位;同时用12肽噬菌体随机肽库淘选E2单抗识别多肽序列。结果显示,多肽序列VSPTTLRTEV能被单抗SWmAb8识别;含SPTxLR基序的噬菌体能被单抗SWmAb8结合,且能被病毒抗原竞争性抑制。证实SPTxLR基序很可能是E2蛋白的线性表位之一,可诱导机体产生中和抗体。