非洲猪瘟病毒外膜蛋白CD2v的原核表达及其免疫特性的研究

本研究参考非洲猪瘟病毒(ASFV)国内分离株SY18株的EP402R基因(编码CD2v蛋白),优化其序列,设计特异性引物扩增。将去除跨膜保留胞外区或胞内区的两种截短体克隆到原核表达载体p ET-28a中,再转化至大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞。经IPTG诱导,铁蛋白融合CD2v胞外区(CD2vN-Fe)和铁蛋白融合CD2v胞外-胞内区(CD2v-NC-Fe)均获得高效表达。以该融合蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,通过酶联免疫吸附实验(ELISA)和间接免疫荧光(IFA)方法检测其灵敏度和特异性。结果表明:CD2vN-Fe多抗特异性较强。本研究为建立ASFV的血清学鉴别检测方法奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒C-type lectin蛋白的原核表达及其免疫特性研究

为了制备非洲猪瘟病毒(ASFV)SY18毒株的C-type lectin蛋白多抗,以基因序列优化的真核质粒为模板,扩增EP153R基因,构建原核表达重组质粒pET-32a-EP153R。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态中,利用IPTG诱导宿主菌表达后,纯化C-type lectin重组蛋白。用纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,制备C-type lectin蛋白多抗,利用Western-blot和间接免疫荧光技术鉴定该抗体的反应性和特异性。结果表明,原核表达重组蛋白C-type lectin经IPTG诱导表达成功,大小约为38 ku,其主要以包涵体形式表达,且能与His标签单抗发生反应,C-type lectin蛋白多抗可特异性识别非洲猪瘟病毒C-type lectin蛋白。本研究为非洲猪瘟血清学检测方法的建立及C-type lectin蛋白生物学功能的探究奠定了基础。     

基于CHO-K1细胞稳定表达的非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体的间接ELISA检测方法,将构建的GFP基因与CD2v基因串联的重组真核表达质粒pIRES-GFP-CD2v转染CHO-K1细胞,通过嘌呤霉素筛选并结合有限稀释法,筛选稳定表达CD2v的单细胞克隆株.转染细胞经过PCR鉴定后进行扩大培养,收集并纯化细胞培养液,获得目的蛋白,通过West...     

猪CD8分子α链胞外区基因片段在毕赤酵母中的表达

为了给猪CD8α分子单克隆抗体的研制提供高生物学活性的抗原,采用PCR方法从pGEM-T-pCD8α重组质粒中克隆了pCD8α分子的胞外区基因片段,构建了真核融合表达载体pPIC9K-pCD8α-ED,在毕赤酵母中进行表达,并对重组基因工程菌的发酵时间、pH值进行了优化。结果表明,表达出约20ku的目的蛋白,诱导表达的最适pH值为5.0,诱导表达的最佳时间是120h。Western-blot分析结果显示,表达产物能被鼠抗人CD8α多克隆抗体识别,在20ku左右出现目的条带,说明表达的目的蛋白具有免疫活性结构。     

猪生殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白抗原表位基因的表达及其表达产物的抗原性

为了确定猪生殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白A、B抗原表位之间的相互关系和对免疫的影响,应用PCR方法扩增出A、B抗原表位基因并分别克隆于原核和真核表达载体中。原核重组质粒表达的重组蛋白经Western-blotting检测证明,该重组蛋白具有良好的抗原性。将重组蛋白和真核表达质粒免疫小鼠,前者可诱导产生针对PRRSV的特异性ELISA抗体,但是此抗体没有中和活性;后者不能诱导免疫小鼠产生PRRSV特异性抗体。结果表明,中和抗体的产生不但与A、B表位的空间构象有很大的关系,如果蛋白质分子质量过小也不能诱导机体产生有效的免疫反应。     

非洲猪瘟病毒K205R蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

将合成的非洲猪瘟病毒K205R基因序列插入p ET-28a(+)表达载体,经IPTG诱导表达p ET-28aK205R重组蛋白。用制备的重组抗原免疫BALB/c小鼠,采用化学融合方法融合、筛选,获得了6A4、7F5和7G3三株抗K205R蛋白的杂交瘤细胞株。经鉴定,这3株单克隆抗体(单抗)的亚类均为Ig G1型;单抗的腹水效价分别为1∶51 200、1∶409 600和1∶102 400。将这3株杂交瘤细胞连续培养20代,在第20代仍有很高的分泌抗体的能力,表明其稳定性较好。Western-blot检测结果表明,这3株单抗与K205R重组蛋白有良好的反应性和特异性。上述结果表明,本研究制备的这3株杂交瘤细胞株能够稳定分泌抗体,分泌的抗体特异性高,为非洲猪瘟诊断技术的研究奠定了基础。     

口疮病毒VIR蛋白多克隆抗体的制备及VIR蛋白的亚细胞定位观察

为研究口疮病毒VIR蛋白的生物学特性,构建了含有VIR基因的重组表达质粒pET-VIR和含有绿色荧光蛋白融合真核重组质粒pEGFP-VIR;诱导表达和纯化VIR蛋白,并用纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,利用间接ELISA测定抗体效价,用Western-blot鉴定抗体的反应原性。利用脂质体介导法将pEGFP-VIR质粒转染绵羊睾丸细胞,4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)进行细胞核染色后激光扫描共聚焦显微镜观察VIR在细胞内的表达和亚细胞定位。结果显示,表达和纯化了含有GST标签的GSTVIR蛋白,主要以可溶性形式存在,其分子质量约27ku,制备的多克隆抗体效价达1∶218;Western-blot分析结果显示,此多克隆抗体有较好的特异性反应;VIR蛋白主要定位于细胞核内。本试验结果为VIR生物学功能的深入研究奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体的制备及阻断ELISA检测方法的建立

为建立一种能检测血清中非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)抗体的阻断ELISA方法,本研究以真核表达后纯化的ASFV p30重组蛋白作为包被抗原,以特异性单抗作为阻断抗体,经条件优化、特异性试验和敏感性试验,建立了一种检测血清中ASFV抗体的阻断ELISA方法.结果 显示,纯化后...     

抗非洲猪瘟病毒VP73蛋白鸡卵黄抗体的制备及鉴定

为研制非洲猪瘟的诊断试剂,将原核表达的非洲猪瘟病毒VP73融合蛋白纯化后,作为抗原免疫蛋鸡,先后用饱和硫酸铵和硫酸钠对卵黄抗体(IgY抗体)进行分离提取,制备抗非洲猪瘟病毒VP73蛋白的特异性IgY抗体。对初步提纯的IgY抗体进行SDS-PAGE和Western-blot鉴定,并用间接ELISA测定IgY抗体的效价。结果显示,提纯后的IgY抗体有1条重链和1条轻链,分子质量分别约为65ku和26ku;IgY抗体可与非洲猪瘟病毒VP73蛋白发生特异性反应,在约71ku处出现特异性杂交条带;间接ELISA测定的IgY抗体效价约为1∶8 192;浓度测定结果显示,每1mL卵黄液可得到9.2mg卵黄抗体。结果表明,用表达的VP73蛋白作为免疫原制备的特异性IgY抗体具有免疫反应原性,可用于研制非洲猪瘟的诊断试剂。     

多房棘球绦虫主要卵抗原重组蛋白的制备及其在免疫诊断中的初步应用

通过对多房棘球绦虫(Echinococcus multiloculais)主要卵抗原(Em MEA)基因的表达、抗体制备及血清ELISA检测,初步评价其作为诊断抗原的价值。根据WormBase数据库Em MEA基因序列设计引物,利用RT-PCR扩增Em MEA基因并构建重组表达质粒,诱导表达、纯化重组蛋白Em MEA;制备Em MEA多克隆抗体并进行免疫组织定位;ELISA方法检测Em MEA重组抗原的敏感性和特异性。结果表明,Em MEA基因长度为957 bp,编码319个氨基酸,与其它绦虫中同源蛋白的氨基酸相似性为90.85%～96.93%。Em MEA重组蛋白约为40 ku,制备的多克隆抗体可识别虫体天然Em MEA蛋白,抗体效价达1∶25 600;Em MEA蛋白仅分布于原头蚴体壁。ELISA检测表明,Em MEA重组抗原和虫体天然抗原的特异性均为100%,Em MEA重组抗原的敏感性(100%)优于虫体天然抗原的敏感性(95.83%)。结合以上研究结果,Em MEA抗原具有作为多房棘球蚴病诊断抗原的潜能。     

鸡Toll样受体3胞外区片段的克隆表达及多克隆抗体的制备

以笔者所在课题组扩增测序的广西三黄鸡Toll样受体3(TLR3)基因为基础,采用降落PCR法从鸡外周血淋巴细胞中扩增其胞外功能区片段chTLR3-LRR,并构建该片段的原核表达重组质粒,通过优化蛋白表达条件,用获得的融合蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,通过Western-blot鉴定多克隆抗体的特异性。结果显示,该片段长度为834bp,与预测的片段大小、碱基序列相符;构建的原核表达重组质粒pET-chTLR3-LRR经IPTG诱导后,表达出预期的30ku的重组蛋白,所获得的鼠抗鸡TLR3多克隆抗体能够与经传染性法氏囊炎病毒(IBDV)刺激后的鸡胚成纤维细胞的TLR3蛋白发生特异性免疫反应。表明,所选择的区域片段具有很好的免疫原性,制备的鼠抗鸡TLR3多抗具有良好的特异性,这为进一步研究鸡TLR3的功能提供了重要材料。     

鹅Ⅰ型禽副黏病毒F基因重组质粒的构建及其DNA免疫

通过RT PCR扩增出鹅Ⅰ型禽副黏病毒GPMV/QY97 1株F蛋白基因的cDNA ,并将F基因cDNA克隆到含CMV启动子的pCI载体上 ,构建这一基因的真核表达质粒pC GPMVF ,以此质粒肌肉注射 3周龄非免疫鸡 ,并分别于免疫后第 2、4、6周通过ELISA方法检测抗体水平。结果证明 ,用重组质粒pC GPMVF免疫鸡 ,能刺激机体产生抗Ⅰ型禽副黏病毒的特异性抗体和免疫应答     

旋毛虫HSP70基因的原核表达及其免疫原性

利用RT-PCR方法扩增旋毛虫HSP70基因,将其扩增产物克隆到pEASY-Blunt Simple载体中,经限制性酶切后与pET-28a(+)载体连接,进一步转化至感受态细胞Transetta(DE3)中,用IPTG诱导表达重组旋毛虫HSP70。以纯化的重组HSP70制备多克隆抗体,并对HSP70进行免疫印迹分析及免疫组织化学染色。结果表明,重组质粒的鉴定和DNA测序均正确;SDS-PAGE和Western-blot分析结果显示,在70ku处获得一目的条带;免疫组织化学染色结果显示,该HSP70具有很好的免疫原性。证实,成功构建了重组表达质粒pET28a-HSP70,为深入研究旋毛虫HSP70的功能奠定了基础。     

西尼罗病毒E蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

利用PCR技术扩增西尼罗病毒(WNV)E蛋白基因并将其插入原核表达载体pET-30a(+),构建重组质粒pET-30a(+)-WNV-E,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导目的蛋白表达,对诱导条件进行优化,利用His镍柱亲和层析法纯化目的蛋白,纯化后的蛋白经SDS-PAGE与Westernblot鉴定正确后,免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体并进行间接免疫荧光鉴定。结果显示:WNV E蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式被成功表达,蛋白最佳诱导条件为37℃,0.8 mmol/L IPTG诱导5 h,经间接免疫荧光鉴定多克隆抗体能特异性识别WNV E蛋白。本研究成功表达并纯化了WNV E蛋白,证明该蛋白具有良好的免疫原性,为WNV抗原、抗体检测方法的建立和新型疫苗的研发及相关研究奠定了基础。     

NF-κB受体激活因子配体的表达及其多克隆抗体的制备

为获取猪源NF-k B受体激活因子配体(RANKL)及其抗体,根据GenBank中猪源RANKL的序列设计引物,将合成的RANKL基因克隆至pMAL-C4x表达载体,转化到大肠杆菌DH5α。经PCR和双酶切鉴定后测序分析,将阳性克隆转化至大肠杆菌BL21后通过IPTG诱导表达。优化表达条件,确定是包涵体表达,蛋白大小为78.1 ku。使用纯化的RANKL为抗原免疫兔制备多克隆抗体。构建重组质粒pCMV-RANKL,表达目的蛋白并使其与多克隆血清反应。经ELISA、Western-blot和IFA鉴定,证实抗RANKL多克隆抗体有良好的抗原特异性,为后续黏膜免疫的研究奠定了基础。     

口蹄疫病毒VP1基因的原核表达及免疫原性检测

将口蹄疫病毒VP1基因克隆至原核表达载体 pBAD/TOPO中 ,经鉴定后得到了重组质粒 pBAD VP1。将此重组质粒转化到受体菌TOP10中 ,分别以不同浓度的诱导剂L 阿拉伯醛糖进行诱导 ,并在不同诱导时间进行采样 ,经处理后做SDS PAGE和蛋白质印迹分析。结果 ,以终浓度为 0 .0 2 g/L的L 阿拉伯醛糖进行诱导 ,4h后表达可达到高峰 ,表达产物大小约为 4 0ku。软件扫描结果显示 ,VP1融合蛋白的表达量占细菌总蛋白的 2 6 .3% ,能与抗FMDV抗体发生特异性反应 ,融合蛋白以包涵体和可溶形式存在。抽提融合蛋白的包涵体 ,经过洗涤后制成油乳剂疫苗 ,经皮下注射免疫豚鼠 ,用乳鼠中和试验测定豚鼠血清中和指数 ,并用口蹄疫病毒对豚鼠进行攻毒。结果表明 ,用此融合蛋白的包涵体免疫豚鼠能诱导产生中和抗体 ,并对病毒的攻击提供免疫保护。     

猪瘟病毒E2基因和牛疱疹病毒Ⅰ型UL49基因的共表达

为了探讨牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)UL49基因编码的膜蛋白VP22对猪瘟病毒E2基因表达水平的影响,构建了单独表达E2蛋白的pcDNA3.1-E2及融合表达E2-VP22的pcDNA3.1-E2-UL49。将pcDNA3.1-E2与pcDNA3.1-E2-UL49分别转染293 T细胞,间接免疫荧光试验结果显示,单独表达E2蛋白的细胞,其荧光主要固缩于核周,而融合表达E2-VP22蛋白的细胞在核周及细胞质内都有大量的荧光;Western-blot分析结果显示,VP22蛋白与E2蛋白都获得了表达,但融合了VP22蛋白的E2蛋白表达量要相对高一些(P<0.01),表明VP22蛋白可以促进E2蛋白的表达。     

盖塔病毒6K蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为用于猪群中盖塔病毒(Getah virus,GETV)的流行病学调查,并研究其6K蛋白功能,制备了该蛋白的单克隆抗体。将6K基因克隆至原核表达载体pCold-TF,并转化大肠杆菌BL21(DE3),进行IPTG低温诱导表达。将诱导的重组菌超声裂解,离心后收集上清,经过镍柱亲和和切胶纯化后,免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞进行融合。使用间接免疫荧光(IFA)法筛选阳性杂交瘤细胞,获得1株GETV 6K单克隆抗体,命名为25C5。将其注射小鼠腹腔,制备6K单抗腹水。IFA检测结果显示,单抗25C5可以结合GETV蛋白并产生特异性荧光。在Western-blot和免疫沉淀试验中,单抗25C5可以结合GETV感染的ST-R细胞样品,其特异性条带大小约6 ku。以上结果表明,单抗25C5免疫学反应特性良好,可用于检测GETV,为该病毒的分离鉴定、致病机制和蛋白功能等研究奠定了基础。     

鸡CTLA-4胞外区的原核表达与免疫佐剂作用

为了探索鸡细胞毒性T细胞相关抗原-4(CTLA-4)胞外区(ChIgV)作为免疫佐剂的可行性,采用RT-PCR从鸡外周血淋巴细胞扩增ChIgV编码序列;测序结果显示,其核苷酸序列与已发表序列的同源性为100%。将猪CD151基因片段克隆入原核表达载体pET-30a和ChIgV融合表达载体pET-ChIgV,获得重组表达载体pET-CD151和pET-ChIgV-CD151。分别将pET-CD151和pET-ChIgV-CD151转化BL21(DE3)大肠杆菌,用IPTG诱导重组菌表达,SDS-PAGE结果显示,能表达预期的18ku和28ku重组蛋白,表达产物均为不溶性包涵体。采用包涵体纯化法和尿素变性/复性法获得了纯化的可溶性重组蛋白。以每只500μg剂量2次免疫SPF鸡,用间接ELISA测定血清抗体效价,结果显示,CD151免疫组在初免后第3周特异抗体检测为阳性,第5周抗体效价达到1∶13 000;ChIgV-CD151免疫组在初免后第2周特异抗体检测为阳性,第4周抗体效价达1∶53 000。分别用CD151和ChIgV-CD151免疫血清进行Western-blot检测,结果显示,均能在CD151阳性猪肺巨噬细胞膜蛋白中检测到预期的29ku蛋白条带,而在CD151阴性PK-15细胞膜蛋白中不能检测到相应的蛋白条带。表明,ChIgV可作为鸡抗原提呈细胞的靶向导入分子和新型免疫佐剂。     

鸡朊蛋白的原核表达及其抗血清的制备

运用分子生物学方法分别构建了pGEX-4T-ChPrP1、pGEX-4T-ChPrP2、pGEX-4T-ChPrP3重组表达载体,经转化大肠杆菌BL21(DE3)和IPTG诱导表达,并对融合蛋白诱导表达时间、IPTG浓度进行优化,诱导表达的GST-ChPrP(25～247)融合蛋白经GST-trap FF柱亲和层析纯化,用纯化后的GST-ChPrP(25～247)融合蛋白免疫新西兰雄兔,以探究鸡朊蛋白的结构与功能。结果表明,本试验成功构建了pGEX-4T-ChPrP1、pGEX-4T-ChPrP2、pGEX-4T-ChPrP3重组表达菌,SDS-PAGE分析结果显示,得到大小为50、42和32ku左右的融合蛋白GST-ChPrP(25～247)、GST-ChPrP(96～247)、GST-ChPrP(174～247),与预期结果基本相符,在最适条件下每升pGEX-4T-ChPrP1菌液通过GST-trap FF层析柱获得的GST-ChPrP(25～247)融合蛋白达10mg,制备的抗血清经琼脂糖凝胶扩散试验检测到较高的多克隆抗体效价(1∶32);Western-blot分析结果显示,融合蛋白GST-ChPrP(25～247)、GST-ChPrP(96～247)和GST-ChPrP(174～247)及鸡脑组织蛋白均可与该抗血清发生特异性免疫反应。证实,鸡重组朊蛋白具有良好的抗原性,与鸡脑组织朊蛋白具有相同的抗原成分。