猪传染性胃肠炎病毒S-N融合双基因疫苗的构建及其免疫原性分析

为了构建TGEV S-N融合双基因疫苗并分析其免疫原性,从S、N基因克隆质粒中以PCR扩增了S基因(2.1kb,含A、B、C、D抗原位点)和N基因(1.2kb),将S基因插入pVAX1载体构建了pVAX-S质粒,再将N基因插入pVAX-S中S基因末端,构建了融合表达S、N双基因的重组质粒pVAX-S-N,将pVAX-S-N转染COS7细胞以免疫荧光试验进行S、N双基因的表达鉴定。用纯化的pVAX-S-N和作为对照的pVAX-S、pVAX1、PBS免疫BALB/c小鼠,共免疫3次,分别测定免疫后第0、14、28、42天的小鼠血清IgG抗体,测定免疫后第42天小鼠外周血T淋巴细胞亚群(CD3+、CD4+、CD8+)的数量。结果,融合质粒pVAX-S-N可在COS7细胞特异性表达S、N两个蛋白,pVAX-S-N免疫小鼠后第14天即可诱导产生抗TGEV的特异性IgG,但pVAX-S-N诱导的抗体水平一直低于pVAX-S诱导的抗体水平,在免疫后第42天差异极显著(P<0.01);pVAX-S-N可激发小鼠产生细胞免疫应答,但pVAX-S-N组的CD3+、CD4+、CD8+数量均低于pVAX-S免疫组。研究结果表明,融合双基因疫苗pVAX-S-N具有免疫原性,但免疫效果却不如单基因疫苗pVAX-S的理想。     

金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖偶联抗原的制备及免疫原性分析

为建立金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖(CP5)纯化与偶联技术方法,获得具有免疫原性的CP5偶联抗原,采用高压破碎菌体的方法释放荚膜多糖,酶处理去除核酸和蛋白质,通过离子交换层析进一步纯化,得到纯化的CP5,并对其纯度和反应原性进行检测;采用己二酸二酰肼(ADH)间桥法制备CP5-牛血清白蛋白(CP5-BSA)偶联抗原,加佐剂免疫小鼠,进行抗体水平测定。结果表明,纯化的CP5纯度为675.1g/kg,经用免疫琼脂双扩散试验检测,纯化多糖仅与同型菌株抗血清发生沉淀反应,偶联抗原CP5-BSA可以刺激小鼠产生CP5免疫应答。此研究结果为奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌亚单位疫苗的研制提供了试验依据。     

传染性腔上囊病病毒广西流行株免疫原性的研究

分别制备传染性腔上囊病病毒(IBDV)广西流行毒株040124、BH11、TSC-2(9)和YL052以及参考强毒株CJ801-BKF的灭活油乳荆疫苗(OEV)及其多价OEV,分别进行IBD商品疫苗毒株B87(in)和FW2512对4个广西流行毒株的攻毒免疫保护试验、流行毒株间的免疫交叉保护试验、多价OEV不同免疫剂量及其与CJ801-BKF株OEV的免疫保护对比试验.结果显示,2个IBD商品疫苗均不能对4个流行毒株提供完全的保护;4个流行毒株的OEV对同源毒株的攻毒均可产生100%保护,其中040124株OEV的交叉免疫保护性最好;在毒株免疫组与未免疫组免疫器官指数的比较中发现,TSC-2(9)株OEV免疫鸡的免疫器官受病毒的损伤程度最严重,而040124、BH11和YL052株OEV的免疫均能较好地保护鸡的免疫器官免受病毒的损伤;多价OEV 3个免疫剂量的免疫保护指数(IPI)为80%～100%,1mL免疫组的IPI显著高于0.25 mL免疫组(P＜0.05),而1 mL免疫组与0.5 mL免疫组差异不显著(P＞0.05);多价OEV的免疫效力显著高于毒株YL052、TSC-2(9)和CJ801-BKF的OEV(P＜0.05).结果表明,本研究制备的多价灭活疫苗适用于本地IBD的防制.     

多头带绦虫六钩蚴Tm45W基因的克隆表达与免疫原性分析

为分析多头带绦虫Tm45W重组蛋白的免疫原性,利用RT-PCR技术首次从激活的多头带绦虫六钩蚴中扩增出多头带绦虫Tm45W基因。将扩增产物重组于原核表达载体pET32a(+)中,构建pET32a-Tm45W表达载体,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达融合蛋白;表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析后,将纯化的Tm45W重组蛋白免疫小鼠,用ELISA检测其血清抗体。结果显示,Tm45W基因全长为813bp,其开放阅读框为765bp,编码255个氨基酸,与多头带绦虫新疆株多头蚴45m基因(序列号:EU326106)的部分序列同源性为90.60%;表达的重组蛋白大小为45ku,与脑多头蚴病羊血清的免疫印迹分析呈阳性反应;小鼠免疫后第1周血清中即可检测到抗Tm45W蛋白的特异性抗体,并于免疫后第35天达到高峰。结果表明Tm45W重组蛋白具有较好的反应活性,能引起机体较强的体液免疫反应。     

环形泰勒虫裂殖体表面蛋白基因高免疫原性区片段的克隆及其表达

根据环形泰勒虫TaA12 72 1株裂殖体表面抗原 (TaSP)基因的序列设计了 1对引物 ,用PCR扩增出该基因长为 393bp的高免疫原性区片段 (SBxp)。将扩增产物连接到 pGEM TEasy载体上 ,转化入大肠埃希氏菌JM 10 9中进行克隆。随后将重组质粒 pGEM SBxp和表达载体 pGEX 4T 1分别以BamHⅠ、XhoⅠ酶切后 ,将酶切的目的片段SBxp亚克隆到原核表达载体中构建了重组表达载体 pGEX 4T 1 SBxp ,并将其转化到BL2 1宿主菌中。提取重组质粒经BamHⅠ、XhoⅠ酶切、PCR鉴定和测序确证后 ,阳性克隆用IPTG诱导表达。收集不同时间的菌液进行SDS PAGE电泳和Westernblotting检测。结果 ,SBxp基因在大肠埃希氏菌中成功表达 ,其表达产物为分子质量 4 3ku的融合蛋白 ,该产物能被牛环形泰勒虫阳性血清所识别。     

伪狂犬病病毒闽A株糖蛋白gD基因去信号肽片段在大肠埃希氏菌中的表达

应用PCR方法从包含伪狂犬病病毒(PRV)Fa株糖蛋白gD基因的重组质粒pB13中扩增出糖蛋白gD基因去信号肽片段,将其克隆到大肠埃希氏菌表达载体pThiohisA中。测序结果表明,糖蛋白gD基因去信号肽片段长1 155 bp,与PRV Fa株糖蛋白gD基因完全一致。经1mmol/L IPTG诱导后,重组质粒pThiohisA-gD在大肠埃希氏菌XL1-blue、Top10、DE3和DH5α中均得到表达,其中在宿主菌XL1-blue中表达量最高。Western-blotting结果显示,大肠埃希氏菌XL1-blue表达的糖蛋白gD具有免疫原性。     

犬冠状病毒YS1株的致弱驯化与免疫试验

应用猫肾传代细胞(CRFK)单层接毒方法将犬冠状病毒(CCV)强毒YS1株连续传代驯化至60代,经安全性试验和免疫原性测定,该强毒株己驯化至弱毒水平,对犬安全,免度原性良好.     

禽流感病毒M2e多拷贝重组蛋白的原核表达及其免疫原性分析

为了获得流感病毒M2e多拷贝重组蛋白并分析其免疫原性,通过比对GenBank中H5和H9亚型流感病毒的M2基因,选择其N端由23个氨基酸组成的胞外域(M2e)序列进行合成,并将4个M2e序列与3个位于HA246~260T/B细胞表位交叉串联,在其末端添加酵母转录因子,然后克隆到pGEX-6P-1载体中,表达重组蛋白。SDS-PAGE和蛋白免疫印迹试验分析表明,重组蛋白成功表达,而后纯化获得高纯度产物。经纯化的重组蛋白与弗氏佐剂混合后肌肉注射BALB/c小鼠,二免2周后采集小鼠血清并用ELISA检测M2e抗体水平;同时分离脾细胞并用ELISPOT检测特异性T细胞的数量。ELISA结果表明重组蛋白能诱导免疫组小鼠产生高水平的M2e特异性抗体;ELISPOT分析显示,在M2e肽段的刺激下,免疫组小鼠每1×106个脾淋巴细胞中的斑点形成数达150个。结果表明,成功表达的重组蛋白具有良好免疫原性,为广谱型流感病毒亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

猪囊尾蚴T24基因的克隆与表达

采用RT-PCR方法扩增猪囊尾蚴T24免疫原基因,将扩增产物与pGEM-T easy载体连接,重组质粒经PCR、酶切鉴定后进行测序;构建T24基因的pGEX-4T-1原核表达载体,经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE、Western-blotting;用所表达的蛋白免疫小鼠,经ELISA检测血清抗体,验证其免疫原性。结果显示。所克隆的T24基因片段长716 bp。含有1个678 bp的开放阅读框,其编码226个氨基酸,与已报道的猪囊虫T24基因核苷酸序列同源性为100％;表达的融合蛋白大小为40 ku,并能被猪囊虫阳性血清识别;免疫小鼠在免疫1周后即可检测到血清抗体,第30 d达到较高水平,表明该融合蛋白具有较好的免疫原性。     

猪链球菌2型三种重组表达蛋白对BALB/c小鼠的免疫保护性评价

将150只BALB/c小鼠随机分成5组。用猪链球菌2型pET32a-Sly、pET32a-38ku和pET32a-Sly-38ku表达的重组蛋白制备的疫苗,以及猪链球菌2型全菌灭活疫苗分别免疫A、B、C、D组小鼠,E组为生理盐水对照。首免后第2周加强免疫1次,二免后第2周,用致死量强毒猪链球菌2型四川分离株和江苏分离株以及马链球菌兽疫亚种安徽分离株攻毒,观察攻毒后对小鼠的免疫保护率。结果,A组与C、D组对猪链球菌2型感染的保护率差异显著(P<0.05),而C组与D组之间保护率无显著差异;A、B、C、D组之间对马链球菌兽疫亚种安徽分离株感染的保护率差异不显著;各免疫组的保护率极显著高于对照组。结果表明,3种重组疫苗具有良好的免疫原性,能对强毒株猪链球菌2型的攻击感染起到保护作用。