金黄色葡萄球菌8型荚膜多糖的提取纯化及其反应原性

为获取金黄色葡萄球菌8型荚膜多糖(CP8),采用高压破碎菌体释放荚膜多糖,酶处理去除核酸和蛋白,再通过离子交换层析进一步纯化得到CP8荚膜多糖,并对荚膜多糖的纯度和反应原性进行了检测。结果显示,得到的荚膜多糖纯度为63.83%,净产量为6.23 mg/L。用免疫琼脂双扩散试验检测,结果纯化的CP8仅与CP8抗血清反应,反应原性在pH2.5~11.5范围内稳定。表明,获得的CP8荚膜多糖具有较高的纯度和良好的反应原性,可用于制备载体蛋白-荚膜多糖完全抗原,研发有效的预防金黄色葡萄球菌疫苗。     

金黄色葡萄球菌336型多糖偶联抗原的制备及免疫原性

采用溶葡萄球菌酶消化菌体释放金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)336型多糖(Type 336polysaccharides,336PS),梯度乙醇浓度浸提和用不同酶消化进行粗提,通过凝胶过滤层析纯化得到了336PS多糖,并对其纯度进行检测。将336PS通过ADH间桥法与BSA连接制备偶联抗原,采用凝胶过滤层析纯化,200~400nm波长扫描鉴定,从层析波峰和检定波长判定偶联成功。加佐剂制备成疫苗免疫小鼠,进行抗体检测和小鼠免疫保护试验。结果表明,纯化的336PS纯度为685.1g/kg;偶联抗原波峰较BSA前移,其原最高吸收波峰为212nm,从206nm向280nm偏移。偶联抗原336PS-BSA可以刺激小鼠产生抗336PS的免疫应答反应,并能够对免疫小鼠提供免疫保护作用。     

乳牛孕酮人工抗原的制备与鉴定

采用二环己基碳化二亚胺偶联法将孕酮-11α-半琥珀酸酯(11-αOH-P4-HS)分别与牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)载体偶联,制备乳牛孕酮人工抗原P4-BSA和P4-OVA,并用SDS-PAGE对制备的人工抗原进行测定。再用制备的人工免疫抗原P4-BSA免疫BALB/c小鼠制备免疫血清。用P4-OVA作为ELISA检测抗原,方阵滴定法确定检测抗原的最佳包被浓度,间接ELISA测定免疫血清中抗体的特异性及效价。结果表明,成功制备了乳牛孕酮人工抗原,P4-OVA的最佳包被浓度为5.82×10-5ng/mL,最佳封闭液为50 mL/L的羊血清,免疫血清具有良好的特异性。     

金黄色葡萄球菌凝聚因子A区基因的克隆表达及表达产物的免疫学特性

采用PCR技术对引起乳牛乳腺炎的金黄色葡萄球菌凝聚因子(ClfA)A区基因进行了扩增和克隆测序,并对测序结果用DNAStar软件进行了抗原表位分析,成功构建了原核表达质粒pET-32a-ClfA A.将其转入宿主菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,证实目的蛋白以可溶形式存在.用His·Bind柱对其纯化后获得了纯度较高的蛋白.纯化后的蛋白与弗氏佐剂乳化后免疫家兔得到了较高效价的抗血清,通过ELISA、试管凝集试验、吞噬调理试验、抗体抗金黄色葡萄球菌黏附能力检测等对表达产物及制备的超免疫血清进行了检测.试验证明目的蛋白具有黏附活性,自制的超免疫血清具有抗金黄色葡萄球菌黏附至牛纤维蛋白原的作用以及吞噬调理作用,所表达的蛋白为ClfA A蛋白.     

斑点免疫金渗滤法检测猪生殖与呼吸综合征抗体的研究

应用提纯的猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗原包被硝酸纤维素膜,然后用胶体金标记的金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)建立了检测PRRS抗体水平的斑点免疫金渗滤法(DIGFA)。该法通过胶体金标记SPA直接显色,阳性者出现红色斑点,整个试验过程仅需5min即可判断结果;与猪瘟、猪伪狂犬病、猪细小病毒病阳性血清不发生交叉反应;纯化PRRSV抗原的最低检测量为0.0553mg mL,即55.3ng 点。对200份猪血清用该法与ELISA同时进行PRRS抗体检测,两种方法的符合率达98%。     

葡萄球菌GST-mTSST-1融合蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立

以纯化的金黄色葡萄球菌无毒诱变超抗原GST-mTSST-1融合蛋白作为检测抗原,通过优化ELISA反应条件,初步建立了检测血清特异性GST-mTSST-1抗体的间接ELISA方法,监测了小鼠血清中特异性GST-mTSST-1抗体水平的动态变化规律。方阵试验确定的GST-mTSST-1抗原的最适包被浓度为5.0μg/mL,血清最佳稀释倍数为1∶100,ELISA阳性反应的临界值为D490 nm≥0.219,批内和批间重复试验的变异系数均小于10%。应用该方法对试验小鼠血清进行检测,结果表明,建立的间接ELISA方法具有较高的敏感性、特异性和较好的重复性,适用于检测特异性GST-mTSST-1血清抗体。     

油酸人工抗原的合成及其单克隆抗体的制备

为建立奶牛血清中油酸(OA)含量的免疫学检测方法,将油酸用活泼酯法分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)进行偶联,制备人工抗原和包被原;利用薄层色谱法(TLC)和红外光谱法鉴定人工抗原合成是否成功;用OA-BSA常规免疫6周龄雌性BALB/c小鼠,取小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合,用间接ELISA筛选出阳性细胞株,再用有限稀释法进行亚克隆;采用小鼠体内诱生法制备腹水,Hi Trap Protein G HP纯化柱纯化腹水,并对纯化后的腹水用ELISA检测抗体效价,以及抗体亚型鉴定。结果表明,TLC监测抗原合成过程中有新物质生成,红外图谱显示OA-BSA波谱形态与BSA相似且拥有OA的特征峰;小鼠血清抗体效价为1∶12 800,用ELISA方法筛选出1株细胞G-1,抗体亚型为Ig G1型。为建立油酸的免疫学检测方法奠定了基础。     

氯霉素全抗原合成及多克隆抗体的制备

用重氮化方法将氯霉素与牛血清白蛋白 (BSA)和卵清蛋白 (OVA)偶联 ,制备免疫抗原和包被抗原 ,用ELISA方法进行鉴定。将偶联抗原用弗氏佐剂乳化后免疫德国大白兔 ,制备多克隆抗体 ,并用硫酸铵沉淀法初步纯化 ,用亲和层析法进一步纯化。用所得抗体建立竞争酶联免疫吸附分析法(ELISA)用于氯霉素检测 ,最低检查限为 0 .3ng/mL。     

金黄色葡萄球菌疫苗候选分子StbA主要抗原表位区的表达及重组蛋白抗血清的制备

通过生物信息学软件分析金黄色葡萄球菌转铁蛋白结合蛋白(StbA)的主要抗原表位区,PCR扩增StbA主要抗原表位区的编码序列;将该序列插入表达载体pGEX-4T-1中,测序验证后转化大肠杆菌BL21(DE3)进行IPTG诱导表达。结果表明,重组菌能表达出分子质量约为54 000u的重组融合蛋白。表达产物经亲和层析纯化后可获得较高纯度的目的蛋白。Western-blot检测证实该重组蛋白能与乳腺炎患病奶牛恢复期血清发生阳性反应。ELISA结果显示,重组蛋白免疫新西兰大白兔能产生高效价的抗血清,提示StbA主要抗原表位区能刺激机体产生强大的免疫应答,StbA是一个有潜力的保护性抗原候选分子。     

猪瘟病毒E2重组蛋白纯化和复性条件的研究

对猪瘟病毒(CSFV) C株、LT株E2基因主要抗原区在pGEX系列表达载体中原核表达的融合蛋白进行了变性、复性和纯化回收试验。用建立的变性、复性和纯化方法,获得了可溶性的纯化蛋白E2,其纯度达70%,回收率为10%。对复性纯化的E2蛋白进行了免疫活性检测,结果表明,其比未纯化蛋白的免疫活性高20倍左右。     

禽呼肠孤病毒P17蛋白基因在大肠杆菌中的表达及其ELISA检测方法的建立

用设计合成的1对跨越禽呼肠孤病毒(ARV)P17非结构蛋白基因完整开放阅读框(ORF)的特异性引物,对ARV S1133株进行了RT-PCR扩增。扩增产物与pGEX-4T-1原核表达载体连接后,转化大肠杆菌BL21感受态细胞。经0.2 mmol/LIPTG诱导,表达的融合蛋白分子质量为42.4 ku,占菌体总蛋白的34%。表达产物P17蛋白经不同浓度尿素纯化后,纯度达到85%。Western-blotting显示,纯化的P17蛋白能与感染ARV的阳性血清反应,说明其具有抗原性。以此重组蛋白为包被抗原初步建立了用于鉴别检测ARV活病毒感染与灭活疫苗免疫的SPF鸡血清的ELISA。     

副猪嗜血杆菌血清5型间接血凝试验和间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立副猪嗜血杆菌(HPS)的血清学诊断方法,通过探索HPS荚膜多糖产生的最适体外培养条件,提取了HPS血清5型菌株的荚膜多糖(CPS),并以之为抗原分别建立了间接血凝试验(IHA)和间接ELISA两种抗体检测方法,对其特异性、敏感性和符合率进行了比较研究。结果表明,两种检测方法的特异性良好,但ELISA的敏感性是IHA的5~10倍,二者的阳性符合率、阴性符合率和总符合率分别为79.7%、55.2%和65.3%。用这两种方法检测了320份临床送检猪血清,IHA和ELISA的阳性率分别为40%和59%。结果证实,这两种方法适用于不同实验室条件下HPS的诊断和流行病学调查。     

野生鸡枞菌多糖的提取及其免疫活性分析

采用水提醇沉法获得鸡枞菌多糖,并对其总糖含量进行了测定;研究了不同剂量的鸡枞菌多糖对正常小鼠的免疫器官指数、血清溶血素水平、腹腔巨噬细胞吞噬功能及脾淋巴细胞增殖等免疫指标的影响。结果:鸡枞菌多糖得率为6.27%,总糖含量为94%;根据体重腹腔注射20mg/kg的鸡枞菌多糖可明显提高正常小鼠的溶血素水平(P<0.01)、脾指数(P<0.01)、胸腺指数(P<0.05)和巨噬细胞吞噬功能(P<0.01);体外试验中,与空白对照组相比,25μg/mL的鸡枞菌多糖可促进体外脾淋巴细胞增殖(P<0.05),12.5μg/mL鸡枞菌多糖对ConA或LPS引起的脾淋巴细胞增殖均有显著的协同作用(P<0.01)。结果表明,鸡枞菌多糖能显著增强小鼠的体液免疫和细胞免疫功能,有望成为一种新的天然免疫增强剂。     

光滑型布鲁杆菌抗体竞争ELISA检测方法的建立

用提纯的布鲁杆菌疫苗株M5-90光滑型脂多糖(S-LPS)作为包被抗原,以针对S-LPS C表位的单抗16C5为竞争抗体,建立了检测光滑型布鲁杆菌血清抗体的cELISA方法.通过对临床507份牛血清样本进行检测,结果经统计分析表明,cELISA与RBT和IDEXX公司的iELISA试剂盒符合率分别为84.7%和91.2%.其中142份样品与Svanova公司的cELISA试剂盒和黑龙江省动物监察所提供的iELISA试剂盒的符合率分别为97.2%和94.4%.κ统计显示,该cELISA方法与RBT、IDEXX公司的iELISA试剂盒、Svanova公司的cELISA试剂盒和黑龙江省动物监察所提供的iELISA试剂盒的κ值均大于0.5,符合率很高.该cELISA方法为布鲁菌病的检测提供了一种有效的血清学方法,并且能够有效地排除常见的革兰阴性菌引起的假阳性结果.     

桃柁酚对金黄色葡萄球菌生物膜及icaA表达的抑制作用

为研究桃柁酚对金黄色葡萄球菌生物膜及icaA表达的抑制作用,用微量肉汤稀释法测定桃柁酚对10株金黄色葡萄球菌浮游菌和生物膜的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度,并利用激光共聚焦显微镜观察桃柁酚抑制生物膜的情况;通过实时荧光定量RT-PCR技术检测桃柁酚对细菌生物膜形成过程中相关基因的水平变化;采用斑点免疫印迹法检测细胞间多糖黏附素在生物膜形成过程中的作用。结果显示,桃柁酚对金黄色葡萄球菌浮游菌和生物膜的最小抑菌浓度值范围分别为1～2μg/mL和4～16μg/mL;能杀灭和清除已形成的生物膜;桃柁酚可通过影响agr和sar调控系统,抑制细胞间多糖黏附素合成基因icaA的表达进而抑制细胞间多糖黏附素的合成。表明桃柁酚能有效抑制金黄色葡萄球菌浮游菌和生物膜,是一种抑制金黄色葡萄球菌生物膜的有效药物。     

口蹄疫病毒的纯化及鉴定

通过PEG 6 0 0 0沉淀 ,差速离心和蔗糖密度梯度离心等方法提取纯化了口蹄疫完整病毒粒子 (FMDV ) ,经 30g/L磷钨酸负染后电镜观察 ,FMDV 14 6S为中心黑染的圆形颗粒 ,与中心透亮的FMDV空衣壳有明显区别 ,SDS PAGE和Western blotting试验结果表明 ,FMDV 14 6S电泳出现VP1、VP2、VP3三条结构蛋白带 ,其中VP1和VP3与阳性血清发生反应出现 2条明显的条带。     

旋毛虫单克隆抗体特性鉴定

将两株抗旋毛虫单克隆抗体（ＭｃＡｂ）杂交瘤细胞（Ｄ４,Ｅ２）所分泌的ＭｃＡｂ,经纯化后电泳分析,其重链分子质量为５５ｋｕ,轻链分子质量为２９ｋｕ,符合ＩｇＧ抗体的特点。两株ＭｃＡｂ与旋毛虫阳性猪血清所针对的旋毛虫抗原决定簇相同,都不与猪的其它寄生虫发生交叉反应,与抗原的相对亲和力Ｅ２＞Ｄ４,ＭｃＡｂ亲和层析纯化抗原的分子质量为４９ｋｕ,经免疫斑点染色证明为糖蛋白。     

罗非鱼源无乳链球菌双重PCR快速检测方法的建立

根据GenBank中罗非鱼源无乳链球菌荚膜多糖的cpsF基因和CAMP因子的cfb基因序列,设计2对特异性引物,通过对反应体系和反应条件优化,并进行特异性试验、敏感性试验及人工感染罗非鱼组织样品检测,建立了快速检测无乳链球菌的双重PCR方法。结果显示,仅无乳链球菌能扩增出cpsF和cfb两条特异性条带,而海豚链球菌、金黄色葡萄球菌、鮰爱德华氏菌、嗜水气单胞菌、杀鲑气单胞菌、豚鼠气单胞菌、嗜麦芽寡养单胞菌无条带检出;经敏感性试验,最小模板检出量为7.632×10-2ng/μL;同时对30尾人工感染无乳链球菌的罗非鱼肝和肾组织中细菌DNA进行双重PCR检测和细菌分离鉴定,检出的阳性结果一致。证实,所建立的方法具有快速、特异、灵敏的优点,适用于对罗非鱼等无乳链球菌的感染病例进行流行病学监测。     

寨卡病毒NS1蛋白在杆状病毒系统中的表达及免疫原性分析

本研究旨在采用杆状病毒表达系统表达并纯化寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)NS1蛋白,并对其免疫原性进行鉴定。将ZIKV NS1基因克隆至杆状病毒载体pFastBac1中,构建重组转移载体,将其转化DH10Bac感受态细胞进行蓝白斑筛选。将鉴定正确的重组杆粒转染sf9细胞,获得重组杆状病毒,经SDSPAGE和Western-blot鉴定蛋白正确表达后,将其感染High5细胞,大量表达重组蛋白,并用镍柱亲和层析法进行纯化,将纯化后的ZIKV NS1蛋白免疫BALB/c小鼠,进行血清特异性抗体效价检测。最终结果显示,获得了纯度较高分泌表达的ZIKV NS1蛋白,并且血清特异性抗体效价实验表明,纯化的ZIKV NS1蛋白能够诱导小鼠产生特异性免疫反应,有很好的免疫原性。本研究为ZIKV疫苗和诊断试剂盒的研发奠定了重要的基础。