猪生殖和呼吸系统综合征的血清学调查

采用IDEXX公司生产的ELISA试剂盒对 2 0 0 1年 8月至 2 0 0 2年 8月湖北、河南、福建、浙江等省的大中型猪场猪生殖和呼吸系统综合征 (PRRS)的流行情况进行了血清学调查。共检测84 4份血清 ,检出阳性 382份 ,阳性率为 4 5 .2 6 %。其中湖北省猪场的 6 6 1份血清 ,检出阳性 2 4 9份 ,阳性率 37.6 7%。 4 83份种猪血清 ,检出阳性 2 4 4份 ,阳性率 5 0 .5 2 % ,36 1份仔猪血清 ,检出阳性 14 1份 ,阳性率 4 0 .0 6 %。在被检的 5 0个猪场中 ,检出PRRS血清学阳性猪的猪场 4 1个 ,占 82 .0 0 % ,其中湖北省的 38个猪场 ,检出PRRS阳性的 2 9个 ,阳性率 76 .32 %。     

部分省市鸡白痢和鸡伤寒的单抗阻断ELISA血清学调查

采用单抗阻断ELISA法对我国部分省市不同品种、不同类型的鸡群进行了鸡白痢、鸡伤寒的血清流行病学调查。结果,在2309份鸡血清样品中检出阳性359份,阳性率为15.5%,不同鸡场鸡群感染率悬殊较大,从0到54.5%不等。表明,我国鸡群中鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌的流行呈现多样化。     

甘肃省酒泉地区猪伪狂犬病血清学检测

在甘肃省酒泉地区 15个未经猪伪狂犬病 (PR)疫苗免疫的规模化猪场采血清 2 5 4份 ,经PR斑点酶联免疫吸附试验 (Dot ELISA)检测 ,在 12个猪场检出PR抗体 ,检出阳性血清 48份 ,平均阳性率 18.9%。提示 ,在该地区部分猪场有猪伪狂犬病毒 (PrV)感染     

甘肃省奶牛副结核分枝杆菌的调查与分离鉴定

为进一步了解甘肃省某奶牛场牛副结核病的感染情况,采集该场227头奶牛血清进行ELISA抗体检测,结果,检出13头阳性奶牛,阳性率为5.73%。在13头抗体阳性奶牛中随机采集6头表现拉稀症状奶牛的直肠粪便,提取DNA进行荧光定量PCR检测,结果显示,6份粪便样品均为阳性。6份粪便样品用十六烷基氯化吡啶(HPC)处理后接种自行配制的Herrold's卵黄琼脂培养基,经过7～14周培养得到5株分离菌株。采用IS900特异性序列PCR鉴定和限制性内切酶分析(REA)鉴定,结果表明,5株分离菌株均为副结核分枝杆菌。采用IS1311特异性序列PCR-REA鉴定,结果表明,5株分离菌株均为C型MAP。     

河北省家畜弓形虫病的流行病学调查

应用间接血凝试验 (IHA)对河北省家畜弓形虫病进行了检测 ,共检测猪血清 1 3 0 0份 ,其中阳性血清 4 64份 ,阳性率达 3 5 .69% ;绵羊血清 2 2 2份 ,阳性 5 7份 ,阳性率 2 5 .68% ;山羊血清 10 0份 ,阳性 10份 ,阳性率 10 .0 0 % ;牛血清 3 0份 ,阳性 8份 ,阳性率 2 6.67% ;马血清 4 3份 ,阳性 1份 ,阳性率 2 .3 3 % ;骡血清 2 8份 ,阳性 1份 ,阳性率 3 .5 7% ;驴血清 3 3份 ,阳性 2份 ,阳性率 6.0 6%     

鸡白痢沙门菌等位基因特异性PCR检测方法的建立

根据鸡白痢沙门菌与鸡伤寒沙门菌的rfbS基因在第237和第598位碱基的不同,设计和合成了等位基因特异性PCR引物,建立了快速检测鸡白痢沙门菌的PCR方法,并应用该方法对鸡白痢沙门菌临床分离样品进行了PCR鉴定。结果显示,该PCR方法能够特异性地鉴定鸡白痢沙门菌,检测灵敏度达100 pgDNA。对35个经常规方法鉴定的鸡白痢沙门菌分离株应用等位基因特异性PCR方法进行鉴定,鉴定出33株鸡白痢沙门菌,符合率为94.3%。表明,建立的等位基因特异性PCR方法能够准确而快速地鉴定鸡白痢沙门菌。     

规模化猪场猪圆环病毒2型感染的血清学调查

用ELISA方法对甘肃省酒泉、张掖、武威、兰州、临夏、白银、定西 7市 (州 )及青海省大同地区的 12个规模养猪场或个体养殖户送检的 2 19份猪血清进行了猪圆环病毒 2型 (PCV2 )抗体检测。结果 ,抗体阳性血清 12 8份 ,其中母猪血清 75份 ,仔猪血清 5 3份 ;总抗体阳性率为 5 8.4 5 % ,母猪抗体阳性率为 6 3.2 5 % ,仔猪抗体阳性率为 5 2 .94 % ;同时对张掖市及大同地区的猪场进行了跟踪调查 ,张掖市 2、3、4和 6月份的阳性率依次为 12 .5 0 %、4 2 .11%、75 .0 0 %和 97.4 2 % ,青海大同地区 4月份和 8月份的阳性率依次为 12 .5 0 %和 85 .71%。表明两地的PCV2感染率随气候变暖而呈明显上升的趋势。     

广东省乳牛隐孢子虫病的流行病学调查

对广东省 10个奶牛场进行了隐孢子虫病的流行病学调查 ,并按大致 10 %的采样率采集了 10 87头乳牛的新鲜粪便 ,以饱和蔗糖漂浮法和改良抗酸染色法检查隐孢子虫卵囊 ,其中检出卵囊的阳性牛 92头 ,阳性率为 8.4 6 % ;有 7个场检出隐孢子虫卵囊 ,场阳性率为 70 %。这 7个奶牛场的卵囊阳性检出率分别是 10 .0 0 %、7.19%、6 .6 7%、9.80 %、6 .72 %、12 .76 %和 6 .72 %。调查发现 ,乳牛隐孢子虫的阳性率和感染强度与乳牛年龄呈负相关关系 ,而且可能与气候有关 ;所检出的隐孢子虫卵囊经形态学鉴定为鼠隐孢子虫 (Cryptosporidiummuris)。     

仔猪副伤寒血清抗体水平与其保护力的相关性研究

用已经建立的检测仔猪副伤寒血清抗体的Dot PPA ELISA ,对不同仔猪副伤寒抗体水平试验组 14头仔猪和对照组 4头仔猪进行了血清抗体效价测定 ,并以沙门菌强毒攻击受试猪 ,测定血清抗体效价与保护力的关系。试验结果表明 ,以Dot PPA ELISA检测的仔猪副伤寒血清抗体几何平均效价不低于 2 8.2 时 ,85 .7%的猪能够抵抗沙门菌强毒的攻击。试验初步确定以Dot PPA ELISA进行猪群免疫监测时 ,血清抗体的几何平均效价 2 8.0 为仔猪副伤寒的保护临界标准 ,该标准的确定为集约化猪场用Dot PPA ELISA检测仔猪副伤寒血清抗体 ,进行仔猪副伤寒的诊断、免疫监测及流行病学调查提供了科学依据     

Dot-ELISA检测犬瘟热病毒抗原的研究

用建立的三抗体夹心法Dot-ELISA检测犬瘟热病毒(CDV)抗原,其抗原最低检出量为1.15μg/mL(0.57625ng/点),经与常规ELISA对104份自然感染犬的血液白细胞样本,60份眼结膜分泌物样本,73份脾、肝、淋巴结等脏器样本进行检测,检出的阳性率分别为92.31%、66.67%、83.56%和90.72%、63.29%、81.86%;两种方法检出的总阳性率分别为83.54%(198/237)和80.17%(190/237),总阳性符合率为95.96%,表明两者呈高度正相关(r=0.92,P＜0.01).Dot-ELISA和AGID对样本检测总阳性符合率为24.89%,呈差异极显著(X2=340.89,P＜0.01).经电子显微镜观察验证比较,三抗体夹心法Dot-ELISA检测的可信度为94.74%.     

H5亚型禽流感病毒反应原性差异及ELISA检测方法的研究

在获得禽流感病毒多克隆抗体及H5亚型特异性单克隆抗体的基础上,建立了H5亚型特异性抗原捕捉ELISA检测方法。通过分析不同单克隆抗体与不同禽流感毒株的反应性差异,筛选高特异性和高敏感性的H5亚型单克隆抗体。优化反应条件,确定包被抗体、检测抗体及酶标抗体的最佳工作浓度,进行敏感性、特异性、重复性及稳定性分析,并与斑点ELISA、H5N1多重RT-PCR或病毒分离鉴定的结果相比较,同时使用该方法对野外样品进行了检测。结果表明,该方法敏感、特异,具有良好的重复性和稳定性,可用于检测临床样品、鸡胚培养物及细胞培养物中的H5亚型禽流感病毒。     

应用复合PCR方法检测沙门菌的研究

参照文献报道的沙门菌Repeatse和hisJ基因片段的引物序列 ,设计并合成了 2对引物 ,对沙门菌属和非沙门菌属的标准菌株及分离菌株进行了复合PCR扩增反应。结果 ,沙门菌PCR产物均出现 199bp与 4 95bp的特异性DNA扩增条带 ,而非沙门菌均未出现扩增条带 ,证明这 2对引物具有沙门菌属特异性。将提取的沙门菌DNA做梯度稀释 ,测定该复合PCR体系的敏感度。结果表明 ,此体系可检出 10 3CFU/mL菌液提取的DNA模板。应用上述方法 ,对进境鱼粉阳性样品进行了检测 ,均出现阳性结果。本研究表明 ,复合PCR是一种特异、敏感、快速的沙门菌检测方法 ,可应用于口岸系统鱼粉、肉骨粉的日常检测。     

IBDV H1株VP2基因的原核表达及其产物的复性

应用RT-PCR技术从传染性腔上囊病病鸡总RNA中克隆出1 461 bp的VP2基因,将其克隆于pET-28a载体,筛选并构建了pVP2表达载体。经IPTG诱导,在其宿主菌BL21(DE3) 中成功表达了53．7 ku的蛋白,SDS-PAGE和Western-blotting分析结果显示,VP2表达产物以包涵体形式存在,可与鸡IBDV抗血清及1株IBDV单抗发生特异性反应。将VP2表达产物进行纯化和复性,用复性前后的蛋白分别与特异性多抗进行Dot-ELISA检测,结果,复性后蛋白的反应活性比复性前增强了10倍;用复性后的蛋白与IBDV单抗进行Dot-ELISA,结果显示,VP2蛋白与单抗1H4、1E12、583、EA6、3C7反应强( );与4E4、1H11反应中度( );与4E5、3C4、 1E11、3H9反应较弱;而与EC6、3D12、1A1无反应。     

住肉孢子虫病免疫学诊断方法的研究

本文以间接血凝试验(IHA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、荧光抗体试验(IFA)、斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA)等4种免疫方法诊断水牛、黄牛和猪的住肉孢子虫病,检出率分别为77.6％(其中水牛为93.4％,黄牛为65.9％),96.1％(其中猪为59.2％,小牛及青年牛为71.4％,成年牛为97.5％),97.5％和97.8％。其中应用IFA、Dot-ELISA诊断家畜住肉孢子虫病,在国内尚未见有报道。试验表明,免疫学诊断技术是当前对家畜住肉孢子虫病进行生前诊断的主要方法。     

牛新孢子虫病和弓形虫病的流行病学调查

为了调查我国牛新孢子虫和弓形虫的感染情况,应用新孢子虫酶联免疫吸附试验(ELISA)和弓形虫间接血凝试验(IAT)分别检测了来自国内10个省(市、自治区)的262份乳牛、10份肉牛和40份水牛血清。结果显示,乳牛新孢子虫的抗体阳性率为17.2%,弓形虫的抗体阳性率为2.3%,没有检测到既有新孢子虫抗体又有弓形虫抗体的乳牛血清。各牛场所检乳牛血清的新孢子虫抗体阳性率在0~34.4%之间。在水牛和肉牛血清中未检测到新孢子虫抗体和弓形虫抗体。流产乳牛血清的新孢子虫抗体阳性率为20.2%,未流产乳牛为16.1%,其中血清抗体阳性乳牛主要在妊娠中晚期流产。各个年龄段乳牛血清的抗体阳性率差异不显著(P>0.05)。不同妊娠胎次的乳牛血清抗体阳性率差异不显著(P>0.05)。确认新孢子虫病在国内大部分牛场存在。     

H5亚型禽流感病毒HA1基因在Sf9昆虫细胞中的表达及其抗原性检测

利用pBlueBacHis2杆状病毒载体在昆虫细胞Sf9中表达H5亚型禽流感病毒(AIV)的 HA1基因。Western-blotting证明HA1在昆虫细胞中得到了表达,其产物具有抗原性;且不与 H7、H9 AIV的抗血清发生交叉反应,具有良好的特异性。Dot-ELISA结果显示,表达蛋白可以在非变性条件下与相应抗体作用,同样具有良好的抗原性。试验结果证明,表达的H5亚型AIV的 HA1蛋白,为检测禽类体内是否感染H5亚型AIV和监测免疫禽类血清H5抗体水平提供了优良的检测抗原。     

牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌双重PCR检测方法的建立

为快速检测牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌,根据GenBank中的布氏杆菌OMP31基因序列(JF918757)及副结核分枝杆菌ISMav2基因序列(AF286339)设计、合成2对特异性引物,通过对PCR条件的优化,建立了快速鉴别检测牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌的双重PCR方法。经对建立的方法进行特异性和敏感性试验,结果表明,分别扩增出602、246bp的特异性牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌DNA目的条带,作为对照的双芽巴贝斯虫、大肠杆菌、沙门氏菌、弓形虫、链球菌、牛放线菌的DNA及其混合物均未扩增出任何条带。牛布氏杆菌与副结核分枝杆菌的最低检测限分别为1.92和2.51pg;牛肉样品中人工污染的牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌的检测敏感性分别为6×104和7×104 CFU/mL。该双病原检测体系的成功建立为牛布氏杆菌病及副结核病的检测、鉴定和流行病学调查提供了有力的技术支持。     

鹅细小病毒NS2基因以及VP1与VP3非重叠序列基因的真核表达

采用pBlueBacHis2A系统筛选鹅细小病毒(GPV)的检测抗原,利用PCR扩增和双酶切方法分别构建了含有NS2基因和VP1与VP3非重复序列基因的重组质粒pBlueBacHis2A-GPV-NS2、pBlueBa-cHis2A-GPV-VP(1-3),分别转染sf9细胞,得到重组病毒,分别表达出了54 ku的NS2融合蛋白和24 ku的VP(1-3)融合蛋白。Western-blotting和Dot-ELISA检测结果证实,表达产物具有特异性;间接免疫荧光试验证实,重组蛋白在细胞中获得了表达。     

猪和野生动物源大肠杆菌及沙门菌中磺胺类药物耐药基因的检测

对从四川省10个规模化猪场和16种野生动物的粪样中分离鉴定出的67株大肠杆菌、57株沙门菌进行了药敏试验。结果,猪源和野生动物源分离菌对磺胺类药物的耐药率分别为72.0%(72/100)和29.2%(7/24)。根据GenBank中登录的序列,设计了3对特异性引物,对磺胺类药物的耐药基因Sul1、Sul2、Sul3进行了三重PCR检测。在这124株细菌中,Sul1基因的检出率最高,为47.6%(59/124),Sul2基因的检出率为17.7%(22/124),Sul3基因的检出率为18.5%(23/124)。药敏试验结果与基因检测结果的符合率为89.9%。     

H9N2禽流感病毒HA2基因重组杆状病毒的表达

从pMD18-T-HA阳性质粒扩增了H9N2亚型禽流感病毒的HA2基因,将扩增到的 HA2基因克隆至昆虫杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A中。将其与杆状病毒共转染于Sf9昆虫细胞,经蚀斑筛选纯化重组杆状病毒,用其感染Sf9昆虫细胞,并优化表达条件。SDS-PAGE和 Western-blotting分析表明,表达产物的分子质量约为27 ku。Dot-ELISA分析表明,表达的HA2 融合蛋白可与鸡抗H9N2亚型血清发生特异性反应,而与H5和H7亚型抗血清间无交叉反应。