猪支气管败血波氏杆菌PCR诊断方法的建立及应用

根据支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica)鞭毛蛋白基因的上游序列设计了1对引物fla1和fla2,扩增出大小为237 bp的目的基因片段,建立了快速检测支气管败血波氏杆菌的PCR方法。特异性和敏感性试验表明,该方法对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌和D型多杀性巴氏杆菌均无交叉性反应;最低能够检出112.5 pg的模板DNA。用该PCR法检测了从延边州采集的48份表现不同临床症状的猪鼻黏液;结果,检出支气管败血波氏杆菌阳性42例,阳性率为87.5%。同时与传统的细菌检查法、微量凝集法进行了比较;结果显示,该PCR法的检出率是细菌检查法的5.25倍,是微量凝集法的1.75倍。     

肺炎克雷伯菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为建立肺炎克雷伯菌TaqMan荧光定量PCR检测方法,根据肺炎克雷伯菌16SrRNA基因的保守序列设计特异性引物和TaqMan探针,通过反应条件优化和特异性、敏感性、重复性试验以及临床样品的检测,建立了肺炎克雷伯菌TaqMan荧光定量PCR。结果显示,该方法与猪肺炎支原体、猪鼻支原体、臭鼻克雷伯菌、鼻硬结克雷伯菌、多杀性巴氏杆菌、链球菌、葡萄球菌、大肠杆菌、沙门菌、肠球菌、乳杆菌、解淀粉芽胞杆菌、猪丹毒杆菌、奇异变形杆菌和化脓隐秘杆菌共15种细菌无交叉反应;标准品浓度在2.29×109~2.29×104 copies/μL范围内具有良好的线性关系,最低可检测到2.29×102 copies/μL的标准品阳性质粒;批内和批间变异系数均小于3%。临床样品的检测结果表明,该方法具有敏感性高、特异性好、稳定性强和检测快速的优点,可用于肺炎克雷伯菌感染的早期诊断、样品的快速检测以及肺炎克雷伯菌的定量分析。     

产毒素多杀巴氏杆菌在猪萎缩性鼻炎病因中的作用研究——给用醋酸处理或不处理的猪接种产毒素多杀巴氏杆菌引起的鼻腔病变比较

用产毒素多杀巴氏杆菌单独接种到未作任何处理的仔猪鼻腔,细菌被迅速清除,鼻甲骨不发生明显萎缩。对仔猪鼻腔用1％醋酸预先处理2天后,再接种产毒素多杀巴氏杆菌,该菌则可在鼻腔长期定居,引起严重的鼻甲骨萎缩;如再混合感染支气管败血波氏杆菌时,猪萎缩性鼻炎的病理变化和临床指征明显加重。试验结果表明,与支气管败血波氏杆菌一样,某些非传染因素也可促进产毒素多杀巴氏杆菌在猪鼻腔定居,从而导致持续性萎缩性鼻炎的发生。     

产毒素多杀巴氏杆菌在猪萎缩性鼻炎病因中的作用研究——支气管败血波氏杆菌和产毒素多杀巴氏杆菌对仔猪的实验感染

本试验用约8万个以上支气管败血波氏杆菌Ⅰ相活菌滴鼻感染1周龄仔猪,产生了严重的鼻甲骨萎缩,但不发展成持续性临床型萎缩性鼻炎。相反,仔猪先用致中等度鼻腔病变(约6万个活菌)甚至肉眼不明显病变(约5千个活菌)以下的支气管败血波氏杆菌滴鼻感染后,再接种产毒素多杀巴氏杆菌,则产生严重至完全的鼻甲骨萎缩,并有临床型病例出现,与自然感染发病相同,实验结果证实,产毒素多杀巴氏杆菌可以起到加剧支气管败血波氏杆菌引起的猪萎缩性鼻炎病演过程的作用。结论认为,这两种细菌在猪鼻腔的混合感染是持续性临床型萎缩性鼻炎的病因。     

产毒素多杀巴氏杆菌和支气管败血波氏杆菌在猪萎缩性鼻炎中的流行病学研究

从发生临床型萎缩性鼻炎的7个猪场的319头猪的鼻腔分离多杀巴氏杆菌,其中获得A型20株,内有产毒素株5株,D型85株,内有产毒素株76株。产毒素菌株占总分离株的77.1％(81/105)。各年龄的猪均有产毒素株感染。另从临床型萎缩性鼻炎阴性的3个猪场共95头猪的鼻腔分得A型多杀巴氏杆菌1株和D型12株,后者仅1株产生毒素。从此10个猪场的不同年龄猪的鼻腔均分离到支气管败血波氏杆菌,此菌阳性检出率为47.8％(196/412),其感染率与萎缩性鼻炎的发生率无关。调查结果表明,产毒素多杀巴氏杆菌与临床型萎缩性鼻炎的发生有关,支气管败血波氏杆菌感染有助于产毒素多杀巴氏杆菌在猪鼻腔定居,二者混合感染导致猪发生严重的持续性萎缩性鼻炎。饲养管理不良可以促进产毒素多杀巴氏杆菌的传播,加重疫情的发展。     

猪四种呼吸道病原菌四重PCR检测方法的建立与应用

为建立可同时快速检测猪支气管败血波氏杆菌(Bb)、副猪嗜血杆菌(Hps)、胸膜肺炎放线杆菌(App)和多杀性巴氏杆菌(Pm)的四重PCR方法,根据Bb的fla基因、Hps的16S rRNA基因、App的apxⅣ基因和Pm的特异性基因KMT1设计4对特异性引物,基于TaKaRa公司的Premix Taq PCR预混酶,对四重PCR的引物浓度和退火温度进行优化,确定该四重PCR的反应体系和反应条件,通过对特异性及同一种病原菌不同血清型检测的通用性、敏感性和重复性评价,建立快速检测猪这4种呼吸道病原菌的四重PCR方法,同时应用该方法对81份临床样本进行检测,检测结果与这4种病原菌单项PCR检测以及4种病原菌的分离鉴定结果进行比较。结果表明,该方法能同时对这4种病原菌进行检测,特异性和通用性好、重复性好,对这4种病原菌DNA的最低检测质量浓度为20 pg/L,对这4种细菌的最低检出量分别为1×10~3CFU/mL的Pm,1×10~2CFU/mL的Hps、Bb和App,敏感性高。81份临床样本的四重PCR检测结果和单项PCR检测结果一致,PCR检出率明显高于细菌分离鉴定结果。本研究成功建立了可同时检出猪支气管败血波氏杆菌、副猪嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌和多杀性巴氏杆菌的四重PCR方法,该方法可用于临床样本的快速检测以及这4种病原菌的鉴别检测。     

溶血性曼氏杆菌和多杀性巴氏杆菌双重PCR检测方法的建立及应用

本研究旨在建立溶血性曼氏杆菌与多杀性巴氏杆菌的双重PCR检测方法,从而为临床上同时检测这两种病原的感染提供一种更加方便、快捷、准确的工具。根据溶血性曼氏杆菌lkt基因和多杀性巴氏杆菌sp6基因分别设计引物,优化条件后进行特异性和敏感性的评价,并对180份临床样本进行了检测。结果显示,溶血性曼氏杆菌和多杀性巴氏杆菌引物的最佳终浓度分别为10和20pmol/L。该方法的特异性较好,对其他无关病原不检出。对溶血性曼氏杆菌和多杀性巴氏杆菌的检测限分别为56和22pg,与独立PCR相同。该方法对临床样本的检测结果表明,溶血性曼氏杆菌和多杀性巴氏杆菌的检出率分别为51.67%和47.78%。研究结果表明,本研究建立的双重PCR诊断技术具有特异性好、敏感度高等特点,为临床上溶血性曼氏杆菌和多杀性巴氏杆菌的快速检测、鉴定以及混合感染的流行病学调查提供了有用的工具。     

化脓隐秘杆菌和溶血性曼氏杆菌双重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为建立化脓隐秘杆菌(T.pyogenes)和溶血性曼氏杆菌(M.haemolytica)快速核酸检测方法,本研究根据化脓隐秘杆菌和溶血性曼氏杆菌16S rRNA保守序列设计2对特异性引物及2条TaqMan探针。经对反应体系和反应条件进行优化,建立了化脓隐秘杆菌和溶血性曼氏杆菌双重TaqMan荧光定量PCR检测方法。特异性结果显示,该方法与金黄色葡萄球菌、停乳链球菌、肠炎沙门菌和大肠杆菌等22种常见细菌无交叉反应;敏感性试验结果显示,该方法对化脓隐秘杆菌和溶血性曼氏杆菌质粒标准品的最低检出浓度分别为31 copies/μL和65 copies/μL,且变异系数小于3%。对45份临床肺样品的检测结果显示,化脓隐秘杆菌和溶血性曼氏杆菌的阳性率分别为15.5%和24.4%。本研究建立的双重荧光定量PCR方法为牛羊化脓隐秘杆菌和溶血性曼氏杆菌感染的检测提供了敏感、快速的方法。     

山羊血琼脂和血清琼脂培养细菌的效果试验

在兽医微生物检验用血液琼脂或血清琼脂培养基的制备中，多采用牛、马、绵羊或兔血。笔者曾用山羊血或血清琼脂培养基培养巴氏杆菌，取得了满意的培养效果。为了判定山羊血在培养基中的应用价值，又以大肠埃希氏菌、多杀性巴氏杆菌和葡萄球菌为试验菌，进行了试验。１　试验材料１．１　试验菌　大肠埃希氏菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌，均由山东农业大学动物科技学院中心实验室提供。１．２　营养琼脂　上海试剂厂生产，批号９６０７０２；新鲜猪胃和鲜牛肉由茌平县肉联厂提供。１．３　羊血　选健康山羊和绵羊，无菌操作自颈静脉采…     

丹毒丝菌属荧光定量PCR检测方法的建立

为建立高效快速的丹毒丝菌属荧光定量PCR(SYBR Green real-time PCR)检测方法,根据丹毒丝菌属16S r RNA基因保守序列设计特异性引物,通过优化确定最佳反应条件,并进行敏感性、特异性、重复性试验以及临床样品的检测,建立了丹毒丝菌属荧光定量PCR检测方法。结果显示,标准品浓度在1.06×106~1.06×101copies/L范围内具有良好的线性关系,最低可检测到1.06×10-2 copies/L的标准品阳性质粒;该方法与副猪嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌等22种细菌和病毒无交叉反应;批内和批间的变异系数(CV)均小于3%。对临床样品的检测结果表明,该方法具有敏感性高、特异性强、稳定性好、准确度高和检测快速等优点,可用于猪丹毒杆菌感染的早期诊断、样品的快速检测与定量分析。     

兔波氏杆菌和巴氏杆菌混合感染的诊断与防治

近年来 ,在甘肃省兰州市近郊兴建了一些规模化养兔场 ,由于饲养管理粗放 ,环境卫生差 ,消毒不严格 ,由条件性致病菌混合感染引起的兔黏液性口鼻炎给兔场造成了很大的经济损失。笔者于 2 0 0 1年 10月至 2 0 0 3年 3月在其中的 3家兔场通过现场调查和实验室检验 ,分离出了支气管波氏杆菌、巴氏杆菌、大肠埃希氏菌和沙门菌等条件性致病菌。通过隔离、消毒和注射兔瘟、兔巴氏杆菌和支气管波氏杆菌灭活疫苗 ,及采取其他针对性防治措施 ,较为彻底地控制了条件性致病菌对兔的侵害。1　发病情况兰州市西固区某兔场饲养种兔 10 0 0只 ,青年兔及仔兔 …     

鸡传染性喉气管炎TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为了建立一种鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)的快速诊断方法,基于ILTV g B基因设计特异性探针和引物,建立一种基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR(qPCR)方法。结果显示,ILTV qPCR方法的标准曲线为y=-3.892 9x+44.607,线性相关值(R²)为0.998 8。该方法的最低检测限为1.0×10 copies/μL,批内与批间重复性检测的变异系数均小于5.64%,且与其他鸡源病原体无交叉反应。临床样本检测结果显示,该qPCR方法的检测阳性率为98.7%,而普通PCR的检测阳性率为92.61%。以上结果表明,该方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可用于ILTV的疫病监测和流行病学调查,为ILTV感染的预防和诊断提供了有力工具。     

多重PCR在多杀性巴氏杆菌荚膜定群中的应用

为了修订行业标准《猪巴氏杆菌病诊断技术》(NY/T 564-2002),改进多杀性巴氏杆菌荚膜定群方法,制备了多杀性巴氏杆菌分群抗血清,并建立了多重PCR,对53株菌同时用血凝方法及多重PCR进行定群。经正向间接血凝试验测定,制备的各型血清仅与对应型抗原发生凝集反应,表明血清具有较高的特异性,可作为多杀性巴氏杆菌的荚膜定群抗血清。53株多杀性巴氏杆菌均扩增出了相应的预期片段,PCR结果与Carter氏间接血细胞凝集试验结果相一致。结果表明,可将多重PCR增添至行业标准中,用其代替原有血清学方法进行多杀性巴氏杆菌荚膜定群。     

多杀性巴氏杆菌prfA基因的序列分析与原核表达

为探索多杀性巴氏杆菌的致病机理,采用PCR方法分别扩增了家兔源和禽源多杀性巴氏杆菌C51-17、Pm898、Pm8916、Pm901、Pm9616、PmZM、PmQin菌株的prfA基因,并对其进行序列分析。将C51-17株的prfA基因克隆到质粒pET30a中,将重组表达载体pET30a-prfA转化到大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞中,经IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE分析和Western-blot分析。结果显示,这7株菌株与GenBank登录的3株多杀性巴氏杆菌之间prfA基因在核苷酸水平上的同源性为95.6%~100%,在氨基酸水平上的同源性为98.9%~100%。诱导表达的重组蛋白PrfA的分子质量约为45.6ku,与预期的大小一致,以可溶性形式表达。重组蛋白PrfA可与家兔抗多杀性巴氏杆菌阳性血清反应,具有良好的反应原性。     

兔F型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及其致病性

对从山东某獭兔养殖场病死仔兔肺中分离的1株疑为巴氏杆菌菌株进行了菌落形态学观察及培养特性、革兰氏染色、生化反应、仔兔致病性回归试验、小鼠毒力试验,并采用PCR方法对该分离株进行了种属及荚膜血清型鉴定。结果显示,该分离菌株革兰氏染色阴性,生化试验及PCR鉴定结果显示为F型多杀性巴氏杆菌,能引起獭兔仔兔肺出血、坏死,并致部分仔兔死亡。表明该分离菌株为比较少见的兔F型多杀性巴氏杆菌。     

对用煌绿滴鼻法检测兔巴氏杆菌隐性感染的异议

由于家兔自身常常隐性感染巴氏杆菌,因此许多书刊都介绍,用于巴氏杆菌病试验的家兔需在试验前数日以0.3～0.5％的煌绿溶液滴鼻,观察有无化脓性鼻炎反应。如果滴鼻后出现脓性鼻涕流出,该兔即为隐性感染巴氏杆菌阳性,不能用于试验;反之为阴性,可用于试验。1986年以来,我们用此法检测试验兔数批80余只,滴鼻后阳性率很高,且反应强烈,脓性鼻涕浓稠、量多,且有约50～60％的阳性兔逐渐不食、消瘦、呼吸困难而死亡。主要剖解病变为一侧或两侧呈化脓性肺炎或格鲁布性肺炎;而未用煌绿滴鼻的同圈饲养兔子则表现正     

对《煌绿激发试验引起死亡初报》一文的不同看法

兔巴氏杆菌病(Pasteurellosis cuniculum)又称兔出血性败血症或兔传染性鼻炎,其病原体为多杀性巴氏杆菌,通常存在于健康兔的上呼吸道及消化道内。当家兔抵抗力强,外界环境良好时,不易致病。当外界环境恶劣,饲养管理不良,家兔体质差,抵抗力减弱时,此菌乘机活动,引起发病。统计资料表明,该病是引起9周龄至6月龄的兔死亡的最主要原因。为了预防和治疗目的,必需做出生前或病前诊断。煌绿滴鼻试验是多种:日刊介绍的诊断兔巴氏杆菌病的一种方法。《中国兽医科技》(原《兽医科技杂志》)1982年第11期刊登宋兆敏的《煌绿激发试验引起死亡初报》(以下简称《初报》)的文章,对煌绿滴鼻进行了否定,使兽医临床莫衷一是,不知其可。工作的需要,要求我们做兔巴氏杆菌病生前诊断、病前诊断、所以对《初报》进行了研究、推敲,认为其所谓“假阳性”理由不能成立,致死滴鼻兔不能排除药物以外的     

猪源多杀性巴氏杆菌的分离与鉴定

2014年3月至2015年2月从来源于全国15个省份的180份临床猪肺组织样品中共分离到71株多杀性巴氏杆菌,分离率为39.4%。利用PCR技术对所分离的多杀性巴氏杆菌进行荚膜血清型鉴定,其中A型菌株41株(占57.8%),D型菌株27株(占38.0%),F型菌株3株(占4.2%),71株多杀性巴氏杆菌中包括1株D型产毒素多杀性巴氏杆菌(占1.4%),说明当前在我国猪群中流行的多杀性巴氏杆菌主要为A型和D型菌株。应用PCR检测多杀性巴氏杆菌23种毒力基因,结果显示:多杀性巴氏杆菌毒力基因的数量大多分布在15~19之间,平均携带个数为17.5个;23种毒力基因中,ptfA,fimA,hsf-2,sodA,sodC,ompA,ompH,oma87,plpB,exbB,tonB,Fur,hgbB的检出率在90%以上,而toxA基因的检出率极低(1.4%),并且在猪源多杀性巴氏杆菌中未检测到t bpA的存在;分析毒力基因在不同血清型菌株中的携带及分布情况发现,A型的平均毒力基因携带数为18.2个,D型为16.4个;不同毒力基因在不同血清型的多杀性巴氏杆菌中的分布也存在一定的差异,其中唾液酸代谢酶基因nanB、透明质酸酶基因pmHAS及黏附基因tadD和pfhA在A型多杀性巴氏杆菌中的检出率高于其在D型多杀性巴氏杆菌中的检出率(P0.01);而黏附基因hsf-1在D型多杀性巴氏杆菌的检出率显著高于其在A型多杀性巴氏杆菌中的检出率(P0.01)。对所分离菌株的16SrRNA基因进行测序,并与NCBI上公布的10株多杀性巴氏杆菌16S rRNA基因进行进化树分析,结果显示:71株多杀性巴氏杆菌主要分为2个亚群,亚群Ⅰ和HB03及3480的亲缘关系较近,而亚群Ⅱ则与HN06、Pm70、36950等菌株的亲缘关系较近;遗传进化的结果说明,多杀性巴氏杆菌的亲缘关系与其来源、血清型及其导致的疾病种类并没有表现出特定的亲缘关系。     

兔多杀性巴氏杆菌外膜蛋白ompH2基因的克隆与原核表达

为克隆和表达兔多杀性巴氏杆菌外膜蛋白ompH2基因,并对其表达产物的反应原性进行研究,用设计的1对特异性引物对兔多杀性巴氏杆菌CVCC500株总DNA进行ompH2基因的PCR扩增。将PCR片段克隆至pMD18-T载体中,进行测序。随后,将该基因克隆到原核表达载体pET-30a(+)中,将重组表达质粒pET30a(+)-ompH2转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG进行诱导。测序分析证明,得到了1条大小为1 052bp的基因片段,与国内外报道的兔多杀性巴氏杆菌ompH2基因的核苷酸序列相似性达99%以上。重组表达质粒的酶切鉴定、PCR扩增和测序分析表明,重组表达载体构建成功。SDS-PAGE检测结果证实,该基因可以在大肠杆菌中表达,表达产物为分子质量约47ku的融合蛋白。Western-blot分析表明,表达的重组蛋白ompH2具有反应原性。为研究兔多杀性巴氏杆菌外膜蛋白ompH2的免疫学活性奠定了基础。     

猪持续性萎缩性鼻炎病因的确定

湖北省某大型养猪场下属的5个商品猪场育成猪发生了严重的持续性萎缩性鼻炎,临床发病率在A场为5.5％(60/1084),B场15.7％(95/607),C场12.8％(126/981),D场9.1％(65/713),E场6.7％(72/1070)。采取D场4个年龄组的猪鼻拭子进行了支气管败血波氏杆菌和多杀巴氏杆菌的分离鉴定。这两种细菌的感染率在繁殖母猪均为6.7％(1/15),这些采样母猪的哺乳仔猪各为33.3％(10/30)和40.0％(12/30),断乳小猪各为93.3％(28/30)和46.7％(14/30),有典型症状的育成猪各为40.0％(12/30)和36.7％(11/30)。在分得的47株多杀巴氏杆菌中,11个A型株有2株产生皮肤坏死毒素,36个D型株全都产生这种毒素。另外,有些多杀巴氏杆菌分离株的糖发酵能力与文献记载稍有不同。流行病学和细菌分离鉴定的结果表明,该大型养猪场发生的持续性萎缩性鼻炎是由支气管败血波氏杆菌和产毒素多杀巴氏杆菌菌株混合感染引起的。