旋毛虫ES抗原致小鼠骨髓源树突状细胞吲哚胺2,3-双加氧酶表达的影响

为探讨旋毛虫排泄分泌(ES)抗原体外诱导小鼠骨髓来源的树突状细胞(DC2.4)在不同时间点对吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)的表达情况,将ES抗原(终浓度为15?g/mL,试验组)、重组小鼠IFN-γ(浓度为1 000 U/mL,阳性对照组)和RPMI 1640培养液(阴性对照组)加入到状态良好的树突状细胞中,并设无添加的空白对照组,分别刺激0、2、6、12、24 h后收集细胞,采用细胞免疫组织化学方法检测各组树突状细胞IDO的表达情况,实时荧光定量法检测各组IDO、IFN-γ、IL-10、TNF-αmRNA表达水平,W estern-blot方法检测各组IDO蛋白表达水平。结果显示,ES抗原、IFN-γ均能提高IDO在细胞质中的mRNA及蛋白表达水平,且与空白对照组呈显著性差异(*P0.05,*P0.01,***P0.001);随着刺激时间的增加,IDO、IFN-γ、IL-10、TNF-αm RNA及IDO蛋白表达量均显著上升,且与空白对照组呈显著性差异(***P0.001)。结果证实,ES抗原可刺激树突状细胞表达IDO,且存在一定的时间效应,可能与旋毛虫逃避宿主的免疫有一定关系。     

旋毛虫TsP53重组蛋白对小鼠的免疫保护性

将旋毛虫TsP53重组蛋白以20μg/只的剂量免疫小鼠3次后攻击感染旋毛虫肌幼虫200条/只。检查小鼠肠道旋毛虫7日龄成虫数、雌虫体外产新生幼虫数和感染35d后的肌幼虫数,并计算减虫率,同时用间接ELISA检测血清中抗TsP53重组蛋白的抗体应答。结果显示,TsP53重组蛋白免疫小鼠旋毛虫7日龄成虫、雌虫产新生幼虫的减虫率分别为14.34%和16.93%,与感染对照组和佐剂对照组相比差异不显著(P0.05);感染35d后肌幼虫减虫率为38.68%,与感染对照组和佐剂对照组相比差异显著(P0.05)。TsP53重组蛋白免疫小鼠在首次免疫后第7天出现抗体应答,可检测到抗TsP53重组蛋白的抗体,第3次免疫后第7天达到峰值,攻击感染后略有下降,但直到试验结束时仍然维持在较高水平,TsP53重组蛋白可诱导小鼠产生部分抗旋毛虫的免疫保护性。     

应用dsRNA干扰技术对旋毛虫Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因功能的初步研究

为研究旋毛虫Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的功能,通过电转法将dsRNA导入旋毛虫体内,应用实时荧光定量PCR和Western-blot检测经dsRNA-TsKaSPI电转法处理后肌幼虫TsKaSPI基因转录和表达水平。体外培养观察TsKaSPI基因沉默对肌幼虫存活的影响。将dsRNA导入后的幼虫经口接种小鼠,观察TsKaSPI基因沉默对幼虫存活、发育及雌虫生殖力的影响。实时荧光定量PCR和Western-blot检测结果显示,旋毛虫肌幼虫经30μg/mL dsRNA电转处理后TsKaSPI基因的转录和表达分别降低63.36%和69.24%(P0.05)。TsKaSPI基因在dsRNA-TsKaSPI转入肌幼虫后第1天转录水平明显降低,第2和第3天仍处于较低的水平。PBS组、dseGFP对照组和dsRNA-TsKaSPI处理组的肌幼虫死亡率分别为61%、58%、52%(P0.05)。将dsRNA电转处理的肌幼虫接种小鼠后6 d肠道成虫和35 d肌幼虫的减虫率分别为36.22%和31.87%。PBS组、dseGFP对照组和dsRNA-TsKaSPI处理组的感染小鼠收集到的雌虫新生幼虫量分别为49.20±5.93、49.40±4.62、50.80±4.32(P0.05)。结果表明,dsRNA可明显抑制Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的转录和表达及幼虫在小鼠体内的存活和发育。     

两种旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂对小鼠免疫保护效果的评估

为评估旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂对BALB/c小鼠的免疫保护作用,选用2种重组表达的Serpin型和Kazal型旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂（TsAdSPI和TsKaSPI）,联合弗氏佐剂通过腹腔注射的方式单独免疫小鼠,用间接ELISA法检测免疫后小鼠特异性血清抗体Ig G以及Ig G亚型（IgG1和Ig G2a）的水平,用CCK-8法测定重组蛋白刺激后脾淋巴细胞的增殖情况,用ELISA法检测脾淋巴细胞培养液上清中细胞因子IFN-γ、IL-10、IL-12和IL-4的水平;使用旋毛虫肌幼虫攻击感染免疫后的小鼠,计算并分析小鼠肠道成虫减虫率及肠道病理变化,并评估TsAdSPI和TsKaSPI与ISA206佐剂联合免疫小鼠后对小鼠肠道成虫减虫率的影响。结果表明,与PBS组相比,2种重组蛋白所诱导的Ig G和Ig G亚型抗体水平均明显升高,IL-12、IFN-γ、IL-4和IL-10表达水平也均显著升高,且重组蛋白可诱导免疫小鼠脾淋巴细胞的体外增殖;攻虫结果表明,2种重组蛋白免疫后小鼠肠道旋毛虫成虫数量较PBS组显著减少且肠道病理变化减轻;2种重组蛋白联合免疫组的成虫减虫率高于单独免疫组。上述结果...     

感染旋毛虫后小鼠腹腔巨噬细胞NOD1样受体及相关细胞因子的表达动态分析

为了解感染旋毛虫后宿主巨噬细胞NOD1受体及其信号通路中关键分子与相关细胞因子的表达动态,将一定量旋毛虫肌幼虫经口感染小鼠,在感染后第0.5、4、7、14、21、28、35天分别取小鼠腹腔巨噬细胞,应用荧光定量PCR检测细胞中NOD1、RIP2、NF-κB mRNA表达量,Western-blot测定NOD1、RIP2、NF-κB蛋白表达量,ELISA测定细胞培养上清及血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的质量浓度。荧光定量PCR结果显示,感染旋毛虫后巨噬细胞中NOD1、RIP2、NF-κB的mRNA表达量变化趋势基本一致,均呈现"升高-降低-升高-降低-平稳"的态势,且分别在感染后第4和21天各具有1个mRNA表达量峰值,在第28～35天时mRNA水平降低并趋向稳定。Western-blot结果表明,NOD1、RIP2和NF-κB p-p65的蛋白质量浓度变化趋势与其mRNA表达量检测结果基本一致。ELISA结果显示,感染小鼠腹腔巨噬细胞培养上清和小鼠血清中TNF-α、IL-6的质量浓度与对照组相比变化明显(P0.01,P0.05),变化趋势与NOD1、RIP2和NF-κB的变化相似,IL-1β的质量浓度变化程度不明显。结果表明,旋毛虫感染可以引起小鼠NOD1受体的激活,在旋毛虫生活史的特定时期上调NOD1受体通路中关键分子RIP2和下游分子NF-κB的表达,促进细胞因子TNF-α和IL-6的分泌。试验证明,宿主NOD1受体参与了旋毛虫感染引起的免疫应答,为防治旋毛虫病和理解旋毛虫对宿主的感染机制提供了新的思路。     

旋毛虫cystatin-like基因重组蛋白诊断特性的鉴定

为鉴定旋毛虫肠道期肌幼虫cystatin-like基因重组蛋白的诊断特性,利用ELISA方法,以旋毛虫cystatin-like基因重组蛋白作为包被抗原,并以旋毛虫感染早期肠道6 h幼虫ES抗原作为阳性对照,用不同旋毛虫感染剂量、不同感染时间小鼠血清为一抗,检测血清中抗旋毛虫Ig G抗体的变化情况,利用Excel软件绘制出Ig G抗体消长规律曲线并进行数据分析,鉴定该基因重组蛋白作为诊断抗原时的敏感性及诊断效果。结果显示,在低剂量感染和高剂量感染时,该基因重组抗原分别从感染后第10天和第8天起可以稳定地检测出抗旋毛虫Ig G抗体;在感染后第11天至第45天一直呈"波峰波谷"式并维持较高水平;感染早期(第15~45天)低剂量感染组的Ig G抗体水平明显高于高剂量组。由此推断,旋毛虫cystatin-like基因重组蛋白具有很好的早期诊断特性,尤其对低剂量早期感染的诊断效果更佳,并推测该基因极有可能在旋毛虫感染早期对宿主的免疫抑制作用中起重要作用,其具体应用前景和生物学功能还有待于进一步研究。     

旋毛虫对大白鼠垂直感染的实验研究

本研究以大白鼠为实验动物,采用人工感染的方式,观察了旋毛虫在大白鼠上能否垂直感染。试验观察了孕前及孕后不同孕期感染旋毛虫的大白鼠,检查了孕前感染的15只大白鼠所产仔鼠48只,孕后感染的19只大白鼠所产仔鼠117只,在所有的新生仔鼠中均未发现旋毛虫肌幼虫。但在部分仔鼠的血清中查到了旋毛虫抗体,而且旋毛虫抗体随新生仔鼠出生后时间的延长逐渐消失。     

旋毛虫TsGLS和TsGAD重组蛋白免疫保护作用的研究

为了评价旋毛虫TsGLS、TsGAD重组蛋白诱导小鼠的免疫保护效果,将TsGLS、TsGAD、TsGLS+TsGAD重组蛋白分别与佐剂混匀免疫BALB/c小鼠后,检测血清中特异性抗体水平变化,并检测重组蛋白体外刺激小鼠脾淋巴细胞所产生的细胞因子水平;在强化免疫小鼠后,通过攻虫试验检测并比较7 d成虫和35 d肌幼虫减虫率,以及免疫小鼠在攻虫后第7、14、21、35天产生的细胞因子水平。结果,各试验组小鼠血清中IgG1(Th2)为主的抗体水平上升,而且IL-4和IL-10水平在攻虫后第14天达到最高,IFN-γ和IL-12水平在攻虫后第7天达到最高。攻虫试验后TsGLS组、TsGAD组、TsGLS+TsGAD组的小鼠中旋毛虫成虫和肌幼虫减虫率分别为35.55%、49.24%、37.34%和47.05%、60.01%、46.55%。上述研究结果表明,TsGLS和TsGAD重组蛋白均能诱导小鼠获得免疫保护效果,且TsGAD重组蛋白免疫效果更佳。     

丙硫咪唑等药物对实验感染猪旋毛虫肌幼虫的杀虫效力试验

我们继7种抗蠕虫药物对实验感染大白鼠旋毛虫肌幼虫杀虫效力试验后,用筛选出的丙硫咪唑、丙氧咪唑、氧硫咪唑、甲苯咪唑等四种抗旋毛虫作用较好的药物,前后四批用43头猪,以不同给药方法,进行了对实验感染猪旋毛虫肌幼虫的杀虫效力试验,同时观察了几种药物的毒性反应。 材料与方法 (一)试验动物和人工感染 试验猪系从甘肃临洮县集市购买的长白和苏白杂种猪,体重5～10公斤,公母兼有。经一段时间饲养观察后,用采自疫区的旋毛虫病猪肉经大白鼠传     

旋毛虫p46000抗原基因的转录及表达特性鉴定

根据旋毛虫p46000抗原基因和葡萄糖3一磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因序列设计特异引物,以不同发育时期旋毛虫总RNA为模板进行SYBR Green染料法实时定量RT-PCR检测p46000基因转录情况.制作不同发育时期旋毛虫虫体及感染组织石蜡切片,采用免疫荧光染色技术检测p46000抗原的表达及定位情况.结果显示,p46000抗原基因在旋毛虫不同发育时期均有转录,但转录水平有明显差异,转录高峰集中于成虫和肌幼虫期,新生幼虫期明显低于其他时期.天然p46000抗原蛋白定位于杆状体和虫体表面,表达高峰集中于成虫、肠道期及成囊期肌幼虫.表明,p46000抗原基因的转录与表达具有一定的时空特异性.该基因在旋毛虫的寄生过程中尤其在早期感染中具有重要作用且可能与旋毛虫的免疫逃避有关.     

小白鼠对旋毛虫感染的自然抵抗力研究

本文研究了普通小白鼠对旋毛虫感染的自然抵抗力。结果表明感染后第1天开始出现成虫,一直持续到感染后第28天。第10天成虫回收率最高达96.67％。雌雄成虫比为2:1左右。成虫的平均大小:雄虫为1.13～1.64×0.04～0.06mm,雌虫为3.20～3.60×0.05～0.06mm。最迟感染后第17天开始出现卷曲的肌幼虫,第21天幼虫开始包囊化。第28天幼虫回收率达高峰。每克横纹肌平均荷虫量为11200条,每条饲喂的幼虫可产生448条幼虫。研究结果提示普通小白鼠对旋毛虫感染的自然抵抗力不强。     

旋毛虫新生幼虫的体外培养

(一)材料与方法 1.实验动物:实验用Wistar系大白鼠购自兰州医学院动物室,体重180～250g;昆明系小白鼠由本所动物饲养场提供。 2.旋毛虫虫株:实验用旋毛虫为本实验室用大白鼠传代保存的河南新野猪源旋毛虫。 3.新生幼虫的收集:给大白鼠经口感染7000～8000条肌幼虫后第6天剖杀;取小肠剪成2～3cm     

旋毛虫肌幼虫抗原的SDS-PAGE及EITB分析

本文应用SDS-PAGE及酶联免疫电转移印迹(EITB)技术对旋毛虫肌幼虫可溶性抗原进行了初步分析。结果SDS-PAGE可显示15条多肽带。感染旋毛虫猪血清可特异性地识别6种多肽抗原。本项研究为进一步分析、分离旋毛虫功能性抗原打下了基础。     

旋毛虫肌幼虫及成虫表面抗原对小鼠的免疫保护作用

将感染旋毛虫肌幼虫的大鼠剖杀，收集３日龄成虫及４０日龄以上肌幼虫。将洗净的肌幼虫和成虫于含有０．２５％溴化十六烷基三甲基胺（ＣＴＡＢ）及２％脱氧胆酸钠的ＰＢＳ中培养２．５小时，离心取上清，经透析、浓缩即为表面抗原。将肌幼虫及成虫表面抗原按不同剂量与等体积弗氏完全佐剂乳化后免疫小白鼠，每次腹腔注射０．２ｍｌ，共免疫３次，每次间隔１周。攻击感染后剖检结果表明，肌幼虫及成虫表面抗原均具有较好的免疫原性，免疫鼠体内成虫及肌幼虫数均显著少于对照鼠。     

旋毛虫43 ku ES抗原基因表达水平的实时荧光定量PCR检测

根据GenBank中旋毛虫43 ku ES抗原基因(Ts43)序列设计引物和探针.以管家基因18 SrRNA为内参基因,对旋毛虫总RNA进行归一化处理,根据循环阈值(Ct值)的变化计算Ts43基因的表达量,建立检测旋毛虫Ts43表达量的实时荧光定量PCR方法,并用该方法测定旋毛虫不同寄生时期Ts43基因的表达水平.结果显示,旋毛虫Ts43基因在各寄生时期均有表达,成虫和新生幼虫Ts43基因的表达水平相对于其他寄生时期的虫体低,该基因表达量在感染后第18 d开始逐渐上升,于感染后第30 d达到高峰,而后开始逐渐下降,但感染后第58 d的虫体Ts43基因表达水平仍高于成虫和新生幼虫.结果表明,Ts43基因的表达与保姆细胞的形成有较大关系.     

绵羊人工感染旋毛虫试验

在动物旋毛虫病流行病学中,由于绵羊的食物特性和饲养方式与猪不同,故不像猪那样感染,传播旋毛虫病原而对公共卫生造成严重威胁,但一些地区曾有因食用涮羊肉而爆发人旋毛虫病的报道。因此,有关学者曾在这方面进行了有益的探讨。为了解西北地区放牧绵羊感染旋毛虫的状况,我们用猪源旋毛虫肌幼虫对绵羊进行了人工感染试验,并在此基础上,用ELISA检测了内蒙、青海、宁夏和甘肃4省区部分地区放牧羊血清旋毛虫抗体。     

低温胁迫对旋毛虫肌幼虫海藻糖及海藻糖酶的影响

为探究旋毛虫肌幼虫体内海藻糖酶（TsTRE）和海藻糖在抵抗低温胁迫中的作用,将旋毛虫肌幼虫置于37℃环境中培养1 h后,移至不同温度的环境中,通过qRT-PCR方法筛选出最佳胁迫温度,再在最佳胁迫温度下,应用qRT-PCR和Western-blot方法检测不同培养时间下TsTRE的基因转录水平与蛋白表达水平的变化,用3,5-二硝基水杨酸法检测TsTRE活性,用蒽酮比色法检测旋毛虫肌幼虫体内海藻糖含量的变化,免疫荧光检测TsTRE在虫体内的分布情况。结果显示,在最佳胁迫温度4℃下,可引起TsTRE基因转录水平、蛋白表达水平和酶活性显著下降,均在1 h时达到最低值,其分别下降约64.96%、68.89%和36.98%(P<0.01),随着低温胁迫时间的增加,TsTRE基因转录水平和蛋白表达水平整体呈“W”型趋势;而海藻糖含量则与之相反,呈“M”型趋势,在3 h达到最高值（P<0.01）,约是对照组的1.6倍;TsTRE主要分布于旋毛虫肌幼虫全身表皮、中肠、后肠及生殖原基内,且低温处理组较对照组诱导的绿色荧光信号明显减弱（P<0.01）。以上研究揭示,在低温胁迫下,旋毛虫肌...     

肌旋毛虫谷氨酰胺酶基因的原核表达及其免疫荧光定位研究

采用RT-PCR方法从旋毛虫肌幼虫中扩增出谷氨酰胺酶(TsGls)基因全长序列,将其克隆到表达载体pET-32a(+)中,测序验证后转化到表达宿主菌Rosetta(DE3)pLysS中,用IPTG诱导表达重组蛋白TsGls。以纯化的TsGls蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,并对旋毛虫肌幼虫中的TsGls进行免疫荧光定位。结果显示,成功构建了重组质粒pET-32a(+)-TsGls;经SDS-PAGE分析,重组TsGls蛋白的分子质量约为72 ku;制备的多克隆抗体效价可达1.024×10~6;Western-blot分析结果显示,多克隆抗体与重组TsGls具有较强反应性;免疫荧光定位显示,TsGls蛋白存在于旋毛虫肌幼虫皮下组织。上述研究结果为进一步研究旋毛虫谷氨酸依赖型抗酸机制奠定了基础。     

用旋毛虫人工感染山羊的试验研究

据国内文献报道,居民因吃涮羊肉曾发生多起人患旋毛虫病的病例。有关绵羊人工感染旋毛虫的试验已有报道(窦兰清,1989)。近些年来,在我国南方等大中城市,居民中吃涮山羊肉及烤山羊肉串的人数也日益增多,是否存在旋毛虫感染的潜在因素?山羊能否感患旋毛虫?迄今尚未见有关报道。作者用传代鼠保种的猪源旋毛虫肌幼虫进行了感染山羊的实验研究,以期对我国旋毛虫病流行地区开展山羊旋毛虫的调查及检验等工作,提供参考。 (一)材料和方法 1.虫源与试验动物:旋毛虫取自河北省旋毛     

猪旋毛虫病时间分辨荧光免疫层析试纸条的研制

应用旋毛虫混合排泄分泌蛋白（ES）和家兔IgG分别偶联铕（Eu）纳米颗粒（EuNPs）制备2个荧光探针,即EuNPs-ES探针和EuNPs-Rabbit IgG探针。将小鼠抗猪IgG与山羊抗家兔IgG分别包被于检测线与质控线上,制备时间分辨荧光免疫层析试纸条。采用15头不同剂量人工感染旋毛虫猪的全血评估研制的试纸条性能。结果显示,用试纸条检测感染200、400、1 000、10 000条旋毛虫肌幼虫的猪全血样品时,结果均为阳性。而使用集样消化法消化对应的猪膈肌样本时,低剂量（200条）未全部检出。以上结果表明,本研究中建立的时间分辨荧光免疫层析试纸条方法相比于集样消化法具有更高的灵敏度,且操作简便,仅需5～10 min即可出结果,本研究成功建立了一种用于现场快速检测旋毛虫病的方法。