中国蓝舌病病毒血清5型毒株的分离与鉴定

为掌握我国云南省蓝舌病病毒(BTV)的流行情况,笔者在云南省师宗县设定哨兵动物,定期从哨兵动物上采集血液进行BTV分离。2012年笔者通过"鸡胚-C6/36细胞-BHK细胞"接种的方式从哨兵牛上分离出1株BTV(毒株号:V084/YN/2012),电镜观察显示,病毒粒子无囊膜,直径约80 nm,表面分布有纤突。血清中和试验表明,分离的病毒为蓝舌病病毒血清5型(BTV-5),使用抗BTV-5型的多克隆抗体为一抗进行间接免疫荧光染色,进一步证实分离毒株为BTV-5型。设计特异性引物对V084/YN/2012毒株的Segment 2 (Seg-2)与Segment 3 (Seg-3)的ORF区进行RT-PCR扩增与克隆测序,序列分析结果显示,V084/YN/2012与BTV-5型参考毒株(RSArrrr/05)的Seg-2核酸序列相似度为95.4%,在系统发育树上聚为一簇,属Seg-2基因E型;Seg-3在系统发生树上属Eastern topotype型,与中国BTV-4型YTS4毒株聚为一簇,核酸序列相似度高达97.5%。病毒蚀斑与增殖曲线测定试验表明,V084/YN/2012与实验室保存的BTV-5型参考毒株(RSArrrr/05)在BHK21细胞上可形成形态大小相近的病毒蚀斑,二者在BHK21细胞上的增殖特性也基本一致。本研究确认了BTV-5型V084/YN/2012毒株在我国的分离,掌握了病毒Seg-2与Seg-3基因的遗传特征以及病毒在BHK21细胞上的增殖特性。研究结果为进一步开展中国BTV-5型的基因组测序、流行病学调查与致病性研究奠定了基础。     

广东某奶牛场蓝舌病病毒分离株血清型与基因型的鉴定

为了解广东省蓝舌病病毒(BTV)流行的主要血清型及基因型,于2013-2014年在广东省汕头市某奶牛场进行了蓝舌病病毒监测及病毒分离,同时扩增了分离株的VP7和VP2基因,采用生物信息学软件进行序列分析并构建系统进化树。结果显示,从64份BTV抗体阳性牛、山羊血液中分离到16株BTV,主要血清型为BTV-2、BTV-4、BTV-12和BTV-16。遗传进化分析表明,其中3个BTV-2分离株与我国台湾(AY493687)、日本(AB686224)、澳大利亚(JQ240322)的分离毒株的遗传关系较近;8个BTV-4分离株与1997年分离自我国云南的毒株(JX560414)同属一个进化分支;2个BTV-12分离株与印度毒株(KC662613)位于同一分支;4个BTV-16分离株与日本毒株(AB686225和AB686226)同在一个大分支上。本研究结果为丰富我国蓝舌病的流行病学资料和疫苗研制奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒LFD-RPA快速检测方法的建立

本研究根据非洲猪瘟病毒(ASFV)B646L基因保守序列设计nfo RPA特异性引物和探针,建立了ASFV核酸LFD-RPA快速检测法。结果表明,该方法特异性强,与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪A型塞内卡病毒(SVA)等病原核酸无交叉反应;最低可以检测到1.57×10~2copies/μL重组质粒pUC-B646L;检测时间短,其中RPA扩增20 min,LFD检测10～20 min。应用该法及OIE推荐的荧光PCR法对24个模拟样品进行检测,检测结果一致。对50份已知的临床样品核酸进行检测,阳性符合率为73.3%。上述结果表明,本研究建立的LFD-RPA快速检测方法操作简便,为ASFV现场快速检测提供了技术支持。     

BTV-2型3型4型7型12型HPCE检测方法的建立

为了建立同时鉴别检测蓝舌病毒(BTV)2型、3型、4型、7型及12型的快速方法,针对BTV不同血清型的VP2基因保守区,采用Ge XP原理,设计了5对特异性嵌合引物和1对通用引物,优化建立了可单管同步鉴别BTV2型、3型、4型、7型及12型的HPCE方法。该方法仅对BTV 2型、3型、4型、7型、12型的病毒核酸有扩增,对BTV的其他基因型以及小反刍兽疫病毒、口蹄疫病毒均无扩增,特异性好。敏感性试验结果显示:该方法对单一病毒核酸的最低检测量为100～1 000 copies/μL;对五种血清型病毒混合核酸的最低检测量为100 copies/μL。组内重复试验与组间重复试验结果均一致,重复性好。临床样品和模拟样品检测结果显示,本研究建立的HPCE方法与OIE推荐的套式RT-PCR敏感性一致,且该方法可以特异、敏感、快速地鉴别蓝舌病毒(BTV)2型、3型、4型、7型及12型。     

水泡性口炎病毒双重荧光RT-PCR鉴别检测方法的建立

为建立水泡性口炎病毒印第安纳型(VSV-IND)和新泽西型(VSV-NJ)的快速鉴别检测方法,本研究根据水泡性口炎病毒2种血清型相对保守的L基因为靶序列,分别设计2对型特异性引物和2条不同荧光基团修饰的探针。经过对反应体系的优化,建立了能够同时检测VSV-IND和VSV-NJ的双重荧光RTPCR方法。该方法能准确鉴别VSV两种血清型,与口蹄疫病毒(FMDV)、蓝舌病病毒(BTV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪水泡病病毒(SVDV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)等灭活抗原核酸无非特异性扩增,特异性强。与普通RT-PCR相比,反应快速、灵敏度高。Ct值的变异系数小于3%,重复性好。利用所建立方法对126份临床样品进行检测,结果与普通RT-PCR相同。上述结果表明,本研究建立的方法为VSV-IND和VSV-NJ的同时鉴别检测提供了一种快速、特异和敏感的方法。     

非洲猪瘟病毒荧光RPA快速检测方法的建立及初步应用

本研究根据非洲猪瘟病毒(ASFV)基因组中序列保守稳定的B646L基因设计特异性引物和探针,建立了敏感、特异、高效的ASFV核酸RPA快速检测法。结果显示,该方法特异性强,能准确检测ASFV核酸,与猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV)、猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪A型塞内卡病毒(SVA)等灭活病毒核酸无交叉反应;敏感性高,本试验中最低可检测到2×101copies/uL;检测时间短,15 min即可完成反应;重复性好。采用ASFV灭活抗原和猪血液制备模拟临床猪血样品,能检出灭活抗原的稀释度为1∶12 800,应用该方法对200份进口冻猪产品及供港猪场420份猪抗凝血进行检测,结果均为阴性,与OIE推荐的实时荧光PCR法检测结果相同。本研究建立的RPA快速检测法操作简便,尤其适合ASFV现场快速检测。     

CDV和CPV及CCV多重纳米PCR检测方法的建立与应用

参考Gen Bank上登录的犬瘟热病毒(CDV)N基因序列、犬细小病毒(CPV)VP2基因序列和犬冠状病毒(CCV)M基因序列的保守型片段分别设计特异性引物,建立了CPV(193 bp)、CDV(500 bp)和CCV(780bp)的多重纳米PCR(nano-mPCR)检测方法,同时考查所建立nano-mPCR检测方法的特异性和敏感性。结果表明,该方法特异性和敏感性良好,对CPV、CDV和CCV的最低核酸检测量分别为1.39×10~2、6.0×10~2和6.7×10~2copies/L,其敏感性比普通PCR高100倍。临床样品的检测结果表明,nano-mPCR的建立为CDV、CPV和CCV的单独或混合感染进行早期快速、灵敏、准确的鉴别诊断提供了新方法。     

鹅细小病毒和鸭瘟病毒复合PCR检测方法的建立

根据GenBank中的鹅细小病毒(GPV)和鸭瘟病毒(DPV)基因序列,分别设计合成了针对GPVVP3和DPV UL6基因片段的2对引物,以GPV-GZ1株鹅胚尿囊液和DPV-SD株鸭胚尿囊液的核酸提取物混合液作为模板,经优化反应条件,成功建立了检测GPV和DPV 2种病毒的复合PCR方法.特异性试验结果显示,该方法对GPV-GZ2株与DPV-SC株病毒核酸的扩增均获得550 bp和376 bp的2条特异性目的片段,而对鹅副黏病毒、鸭肝炎病毒、鸭源沙门菌、鸭源巴氏杆菌和鸭疫里默氏杆菌的核酸扩增结果均为阴性;敏感性试验结果显示,该方法对GPV核酸的最小检出量为1.66 Pg,对DPV核酸为0.166 Pg;对人工感染雏鹅的肝组织进行PCR扩增,结果可检测到相应的特异性病毒核酸片段.表明,建立的复合PCR方法具有特异性强、敏感性高、快速简便等特点,可用于GPV或/和DPV临床感染病例的联合检测与鉴别诊断.     

日本脑炎病毒基因Ⅰ型与Ⅲ型复合RT-PCR鉴别方法的建立

为建立一种简单快捷的鉴别日本脑炎病毒(JEV)基因Ⅰ型与基因Ⅲ型的方法,根据基因Ⅰ型和基因Ⅲ型JEV的保守序列,分别设计合成了针对基因Ⅰ型和Ⅲ型JEV的RT-PCR引物P1、P3和P2、P3,以JEV SA14-14-2和CZ1株的核酸提取液为模板,通过对反应体系及条件的优化,建立了一种可快速鉴别JEV基因Ⅰ型与Ⅲ型的复合RT-PCR方法,并用建立的方法对27份临床样品进行了检测。结果显示,以设计合成的引物进行复合RT-PCR扩增,得到与基因Ⅰ型JEV预期相符的381bp的特异性条带,得到与基因Ⅲ型JEV预期相符的550bp的特异性条带,而对猪瘟病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒及猪伪狂犬病病毒核酸的扩增结果均为阴性。敏感性试验结果显示,该方法对基因Ⅰ型和基因Ⅲ型JEV的最小检出量分别为1.0pg/μL和10pg/μL。利用建立的复合RT-PCR方法对27份临床样品进行检测,结果5份为基因Ⅰ型,2份为Ⅲ型,与核苷酸序列分析结果一致。结果表明,建立的复合RT-PCR方法具有特异性强、敏感性高、快速简便等特点,可用于检测及鉴别基因Ⅰ型与基因Ⅲ型JEV。     

猪瘟病毒RT-LAMP检测方法的建立

利用逆转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP),建立了猪瘟病毒快速检测方法,同时评价了该方法的灵敏性和特异性。结果,根据猪瘟病毒5′端非编码区的一段保守序列设计的LAMP引物能够在65℃下1h内实现目标核酸区段的大量扩增,检测结果可直接用肉眼判断。结果表明,该检测体系具有极高的特异性,只能检测到目标病毒,与其他类似病毒如猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、传染性胃肠炎病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型的核酸等无交叉反应,可检测到1×10-3稀释度的目标病毒核酸量,比普通RT-PCR的灵敏性高10倍。     

通用型猪流感病毒PCR-DHPLC检测方法的建立

应用PCR技术结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术,建立通用型猪流感病毒的快速筛检方法。查找、分析猪流感病毒M基因的保守区,设计了1对特异性引物。RT-PCR扩增后经变性高效液相色谱技术分析研究方法的特异性、敏感性和应用性。DHPLC法能特异性检出H1N1、H5N1和H3N2亚型猪流感病毒,与猪瘟病毒、口蹄疫病毒、猪流行性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型无交叉反应。对构建的含有M基因的重组质粒,该方法的检出下限为100copies核酸。对210份存档猪流感鼻拭子样品,DHPLC法与商业化定量PCR的检测结果完全一致。DHPLC技术为临床大批量猪流感样品的监测提供了一种新的、自动化、高通量的核酸分析平台。     

番鸭细小病毒与鹅细小病毒PCR鉴别诊断方法的建立

根据番鸭细小病毒(MDPV)和鹅细小病毒(GPV)基因组的非同源序列各设计了1对引物MDPVF1/R1和GPVF1/R1,建立了一种PCR方法,用该PCR方法分别对GPV、MDPV、鸭瘟病毒(DPV)、鸭肝炎病毒(DHV)、鸭呼肠孤病毒(DRV)、犬细小病毒(CPV)和猫泛白细胞减少症病毒(FPLV)的病毒培养物及其核酸进行扩增。结果,引物MDPVF1/R1仅特异性扩增出MDPV的900 bp核酸片段,引物GPVF1/R1仅特异性扩增出GPV的465 bp核酸片段。表明,建立的PCR方法可用于GPV和MDPV的鉴别诊断。     

猪细环病毒1型real-time PCR检测方法的建立

参考猪细环病毒1型(TTSuV 1)基因非编码区保守序列设计了1对特异性引物,构建含有TTSuV 1基因片段的重组质粒,以系列稀释后的重组质粒作为模板建立了定量检测TTSuV 1的SYBR GreenⅠreal-time PCR方法,并绘制标准曲线,进行特异性、敏感性和重复性试验。结果显示,该方法标准曲线的决定系数为0.999 5,表明具有优良的线性关系;最低可精确检测63copies/μL的核酸模板;重复性试验的变异系数小于2%;对TTSuV 2、猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型、伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪瘟病毒等均检测不到荧光信号。对临床样品的检出率高于常规PCR方法。结果表明,建立的real-time PCR检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于TTSuV 1的检测与定量分析。     

禽呼肠孤病毒纳米PCR检测方法的建立与应用

为建立一种快速、敏感的禽呼肠孤病毒(ARV)检测方法,针对ARV S3基因的保守区域设计1对特异性引物,建立了ARV纳米PCR检测方法。结果显示,该方法特异性好,仅从ARV核酸样品可检测到约332 bp的特异性目的条带,而对新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性囊病病毒、鸡毒支原体、马立克病病毒、传染性喉气管炎病毒、鸭瘟病毒、禽腺病毒Ⅳ型、减蛋综合征病毒、H9亚型禽流感病毒和鸡大肠杆菌等其他病原的检测结果均为阴性。敏感性试验结果显示,该纳米PCR方法能检测到的最低核酸质量浓度为56 pg/L,其灵敏度是普通PCR的10倍。ARV核酸被重复检测3次,结果均一致。应用建立的纳米PCR和病毒分离鉴定方法对临床送检的30份样品进行检测,两种方法的符合率为100%。以上结果表明,成功建立了ARV的纳米PCR检测方法,具有更高的敏感性和良好的特异性,可用于ARV感染的临床诊断及流行病学调查。     

猪圆环病毒3型RAA检测方法的建立及初步应用

为建立猪圆环病毒3型(PCV3)的快速简便检测方法,根据PCV3 Cap基因的保守序列设计多对引物和探针,建立了一种实时荧光RAA检测方法。通过筛选引物和优化试验条件,验证对常见动物疾病病毒的特异性,并与PCR方法在敏感性上进行比较。结果表明,PCV3与猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪A型塞内卡病毒(SVA)和口蹄疫病毒(FMDV)等核酸无交叉反应,可在39℃下20 min内快速特异完成。该方法灵敏度较高,最低检出浓度为10~2copies/μL。应用该方法对115份猪临床样品进行检测,检测结果与PCR方法一致。结果表明,该方法操作简单、快速灵敏、结果可靠,可用于PCV3的实验室检测和现场诊断。     

蓝舌病病毒10型和20型及23型多重RT-PCR检测方法的建立

为建立可同时鉴别检测蓝舌病病毒(BTV)10型、20型及23型的方法,本研究针对这三型病毒VP2基因保守区,设计合成了3对特异性引物,经过条件优化,建立了单管同时鉴别BTV 10型、20型、23型的多重RT-PCR方法。结果显示,该方法可同时扩增出BTV 10型696 bp、BTV20型293 bp和BTV 23型356 bp三条特异性的片段,对BTV其他基因型以及小反刍兽疫病毒(PPRV)、口蹄疫病毒(FMDV)的核酸均无扩增;该方法最低可检测1.696×103copies/L的BTV10、1.375×103copies/L的BTV20和1.317×103copies/L的BTV23。利用建立的多重RT-PCR方法对67份临床样品进行检测,结果与OIE推荐的BTV套式RTPCR方法符合率为100%。本研究建立的多重RT-PCR检测方法特异性好,具有较强的检测敏感性,可用于蓝舌病病毒血清型的鉴别。     

西藏环状病毒荧光定量RT-PCR与常规RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立西藏环状病毒(TIBOV)群特异性核酸检测方法,本研究根据云南师宗新分离的TIBOV(YNSZ/V290/2019)毒株和GenBank中登录的TIBOV毒株VP6基因序列的保守区,设计并合成特异性引物和探针,建立了荧光定量RT-PCR和常规RT-PCR检测方法,并分别进行了特异性、灵敏性和临床样品的检测。试验结果表明,两种检测方法均可特异性地扩增TIBOV及检出特异荧光信号,而对帕利亚姆血清群病毒(PALV)、蓝舌病病毒(BTV)、流行性出血病病毒(EHDV)、广西环状病毒(GXOV)、阿卡斑病毒(AKAV)、云南环状病毒(YNOV)、非洲马瘟病毒(AHSV)和牛流行热病毒(BEFV)无扩增和无有效荧光信号检出,具有较好的特异性。灵敏性试验结果显示,荧光定量RT-PCR检测TIBOV核酸的下限可达10 copies/μL,常规RT-PCR的检测下限为10~2copies/μL。临床样品检测显示,两种方法均能检测出库蠓样品中的TIBOV核酸,常规RT-PCR扩增产物经测序和BLAST比对分析显示,库蠓样品中检测到的TIBOV与NCBI数据库中TIBOV(DH13C120、XZ0906、D181/2008)毒株VP6基因序列相似度均在95%以上。荧光定量RT-PCR因其更高的灵敏度和实效性,能用于大量临床样品的快速检测,而常规RT-PCR可以对扩增产物进行胶回收测序,进一步了解待测病毒的遗传信息。两种方法相互辅助,可以为TIBOV的早期诊断、快速检测、流行病学调查和实验研究等提供有效的技术方法。     

PCV2-PRV-PRRSV-CSFV多重PCR检测方法的建立

根据GenBank中已发表的猪圆环病毒2型(PCV2)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪瘟病毒(CSFV)的有关基因序列,设计4对引物分别用于扩增PCV2的ORF2基因、PRV的gH基因、PRRSV的ORF7基因和CSFV的5′UTR基因的目的片段,建立了同时检测4种病毒的多重PCR。敏感性和特异性试验结果表明,该方法对这4种病毒的最低核酸检出量分别为48.1pg(PCV2)、29.6pg(PRV)、54.2pg(PRRSV)和62.8pg(CSFV)。该方法可同时扩增440bp(PCV2)、359bp(PRV)、321bp(PRRSV)和186bp(CSFV)的特异性片段,而对牛流行性腹泻病毒、猪流行性腹泻病毒和猪细小病毒的检测结果均为阴性。多重PCR与单一PCR的符合率为100%。结果表明,该方法可用于这4种病毒的临床快速检测与流行病学调查。     

流行性出血病病毒一步法RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立流行性出血病病毒(EHDV)群特异性核酸检测方法,本研究根据GenBank中登录的EHDV毒株内衣壳结构蛋白VP7基因的保守区,设计并合成1对特异性引物,建立了一步法RT-PCR检测方法,并分别进行了特异性、敏感度和临床样品的检测试验。结果表明,该方法能特异性地检出不同地区分离的不同血清型EHDV,而对蓝舌病病毒(BTV)、中山病病毒(CHUV)和赤羽病病毒(AKAV)无交叉反应,具有较好的特异性;不同血清型的EHDV最低检出量级为1×10~2copies/uL。同时,该方法能有效地从临床抗凝血样品中检测出EHDV核酸,与病毒分离试验结果进行比较,符合率为100%。说明所建立的方法特异性强、敏感性高、可靠性好,可用于EHDV的快速检测、流行病学调查和试验研究。     

聚合酶链反应检测猪细小病毒的研究

利用聚合酶链反应(PCR),对从猪细小病毒(PPV)三株强毒及 两株弱毒的细胞培养产物中提取的核酸进行扩增。通过琼脂糖电泳,均得到了约158bp(碱基对)的特异性核酸片段。与该病毒本身的二个含20bp的寡核苷酸引物之间的核酸长度相等。而对与PPV具有基因同源性的犬细小病毒(CPV)及与PPV临床症状相似的非相关病毒如日本乙型脑炎病毒(JEV)、伪狂犬病毒(PRV)作同样处理,未得到核酸带。并且通过筛选裂解蛋白的方法,建立了一种快速提取DNA的方法,初步制定了快速检测PPV的程序。