猪凋亡细胞因子Fas、FasL、TNFRl和TNF-αSYBR Green Ⅰ real-time PCR检测方法的建立

分别针对猪凋亡细胞因子Fas、FasL、TNFR1、TNF-α基因以及看家基因β-actin的序列设计了1对特异性引物,构建含有各自引物扩增序列的重组质粒作为阳性标准品,建立了检测Fas、FasL、TNFR1、TNF-α及β-actin的SYBR Green Ⅰ real-time PCR方法.该方法线性关系好(r2≥0.995),敏感性高,初始模板的检出下限除TNFR1为1×102 copies/μL外,其他均为1×101 copies/μL;特异性强,扩增产物形成单一的特异性熔解峰;重复性好,组内与组间的变异系数均小于3%.应用所建立的方法对猪生殖与呼吸综合征病毒感染仔猪外周血单个核细胞中Fas、FasL、TNFRl和TNF-α mRNA的表达水平进行了检测.结果表明,建立的real-time PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好.     

鸡细胞因子实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

根据鸡IL-6I、L-1β、IFN-γ、TGF-β4 mRNA的保守序列设计特异性引物,提取经鞭毛蛋白刺激的鸡巨噬细胞HD11总RNA,并反转录成cDNA,建立了实时荧光定量PCR方法。结果显示,融解曲线均呈单一峰;同一份cDNA经过3个相同反应体系的实时荧光定量PCR扩增后,其扩增曲线基本重合。HD11细胞经鞭毛蛋白刺激后,前炎性细胞因子IL-6和IL-1β的相对表达量分别为14.90和29.09,与对照组相比显著升高(P0.05);而IFN-γ与抗炎性细胞因子TGF-β4的相对表达量无显著变化(P0.05)。应用该方法检测了3份沙门菌感染鸡血液样品异嗜白细胞中这4种细胞因子的表达水平,前炎性细胞因子IL-6、IL-1β的相对表达量分别为6.19和2.39,与对照组相比显著升高(P0.05);TGF-β4的相对表达量无明显变化(P0.05)。结果表明,建立的实时荧光定量PCR方法特异性强、重复性好,为定量检测鸡细胞因子的一种快速、准确的方法。     

猪圆环病毒1型real-time PCR检测方法的建立

为了建立一种定量检测猪圆环病毒1型(PCV1)的实时荧光定量PCR方法,根据PCV1基因序列设计了1对特异性引物,并构建含有PCV1基因片段的重组质粒,以系列稀释后的重组质粒作为模板建立了定量检测PCV1的SYBR GreenⅠreal-time PCR方法,并绘制标准曲线,进行特异性、敏感性和重复性试验。结果显示,该方法的标准曲线的决定系数为0.999,显示出优良的线性关系;最低可准确检测320copies/μL的核酸模板,重复性试验的变异系数小于2%;该方法对PCV2、猪细小病毒、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪瘟病毒等的检测结果均为阴性;对临床样品的检出率高于常规PCR方法。结果表明,建立的real-time PCR特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于PCV1的检测与定量分析。     

猪IFN-γ mRNA TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立一种检测猪γ-干扰素(IFN-γ)的荧光定量RT-PCR方法,针对猪IFN-γ基因和管家基因cyclophilin A(CyPA)的核苷酸序列分别设计了特异性引物和TaqMan荧光探针,以重组质粒pMD18-T-IFN-γ和pMD18-T-CyPA为标准品,进行实时荧光定量RT-PCR检测,并构建猪IFN一γ mRNA和CyPA的荧光定量RT-PCR标准曲线.结果表明,建立的方法在1×101～1×107copies/μL模板范围内具有良好的线性关系,相关系数r2均高达0.999,扩增效率均高于99.0%;可检测至少为100 copies的阳性标准品.该方法具有快速、敏感性高、特异性强和重复性好等特点,可应用于临床样品的检测.     

猪细环病毒1型real-time PCR检测方法的建立

参考猪细环病毒1型(TTSuV 1)基因非编码区保守序列设计了1对特异性引物,构建含有TTSuV 1基因片段的重组质粒,以系列稀释后的重组质粒作为模板建立了定量检测TTSuV 1的SYBR GreenⅠreal-time PCR方法,并绘制标准曲线,进行特异性、敏感性和重复性试验。结果显示,该方法标准曲线的决定系数为0.999 5,表明具有优良的线性关系;最低可精确检测63copies/μL的核酸模板;重复性试验的变异系数小于2%;对TTSuV 2、猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型、伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪瘟病毒等均检测不到荧光信号。对临床样品的检出率高于常规PCR方法。结果表明,建立的real-time PCR检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于TTSuV 1的检测与定量分析。     

鸡Akirin2基因对传染性法氏囊病病毒VP2 DNA疫苗免疫反应的影响

为了探讨鸡Akirin2基因对传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2 DNA疫苗诱导的免疫反应的影响,将同时表达VP2蛋白和Akirin2蛋白的重组质粒免疫14日龄SPF鸡,14 d后加强免疫,最后以IBDV BC6-85强毒攻击。结果显示,Akirin2基因能够增强VP2 DNA疫苗诱导的特异性免疫反应,提高外周血淋巴细胞的增殖能力,影响细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-9、IL-10、IL-17和IL-18的表达水平。与单独免疫表达Akirin2蛋白或VP2蛋白的重组质粒对上述细胞因子表达的影响有一定差异。     

猪血凝性脑脊髓炎病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank中的猪血凝性脑脊髓炎病毒(HEV)S蛋白基因的保守序列设计合成1对特异性引物,经PCR扩增S基因并构建含有该基因片段的重组质粒,将该重组质粒作为阳性标准品,建立了检测HEV的SYBR Green Ⅰ real-time PCR方法。结果显示,该方法线性关系良好,相关系数为0.994;敏感性高,检测下限为1.6×104 copies/μL;特异性强,与牛冠状病毒、伪狂犬病病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒不发生交叉反应;并且重复性好,组内、组间的变异系数均小于2%。应用该方法对采集的20份疑似HEV感染病料进行检测,其中16份为阳性,而用常规PCR检测同样的样品,仅8份为阳性。表明建立的SYBRGreen Ⅰ real-time PCR方法具有快速、特异、敏感、重复性好等优点,可用于临床上HEV的检测及定量分析。     

羊传染性脓疱病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

针对羊传染性脓疱病毒(ORFV)B2L基因序列设计合成了1对引物,以含有该引物扩增序列的重组质粒作为阳性标准品,建立了检测ORFV核酸的SYBRGreenⅠreal-timePCR方法。结果显示,该方法线性关系良好,标准曲线的相关系数为0.999;检测灵敏度可达9.4×104copies/μL;与绵羊痘病毒(SPV)不发生交叉反应,具有良好的特异性;组内Ct值相同,组间变异系数小于2%。应用建立的方法检测20份疑似羊传染性脓疱病病料,结果17份为阳性,同时用常规PCR进行检测,结果仅10份为阳性。结果表明,建立的实时荧光定量PCR方法具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可初步用于ORFV的检测。     

牛传染性鼻气管炎病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为了检测牛传染性鼻气管炎病毒,本研究建立了牛传染性鼻气管炎病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法。通过设计特异性引物扩增病毒基因,将扩增的目的片段(119 bp)连接到pMD19-T载体中,构建重组质粒。将重组质粒作为阳性标准品,用于SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立。结果显示,特异性引物扩增的目的片段约为119 bp,符合预期的大小,经测序鉴定所扩增的目的片段正确。敏感性结果显示,用该方法检测阳性质粒标准品的最低限度为3.04 X101 copies/mL,是Nano-PCR的10倍。将牛病毒性腹泻病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛副流感病毒3型与牛传染性鼻气管炎病毒进行特异性检测。结果显示,只有牛传染性鼻气管炎病毒被检测到,其他病毒均未有特异性的扩增曲线,表明该方法的特异性良好。批内和批间重复变异系数均小于1%,显示该方法具有良好的重复性。用建立的方法对20份疑似IBRV的临床样品进行检测,并与Nano-PCR检测方法进行对比,结果显示本方法的阳性样晶率高于Nano-PCR检测方法。本研究建立的牛传染性鼻气管炎病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR方法特异性好、灵敏度高、重复性好,可用于牛传染性鼻气管炎病毒的检测。     

刺五加多糖对鸡血液免疫相关细胞因子mRNA表达水平的影响

本研究通过实时荧光定量PCR方法,观察皮下注射刺五加多糖(ASPS)对雏鸡血液免疫相关细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、IL-1β、IL-6、iNOS和TNF-αmRNA表达水平的影响,从而通过分子水平对ASPS的免疫增强作用进行评价。1日龄海兰褐公雏饲养至7日龄时选取150只,随机分为3组,每组50只。第1组和第2组为ASPS低剂量组和高剂量组,分别用ASPSL和ASPSH表示,两组分别皮下注射100 mg/mL和200 mg/mL的ASPS;第3组为空白对照组,注射等量灭菌生理盐水。所有组每天注射1次,ASPS和生理盐水均为0.2 mL,连续注射3 d。免疫后的第7、14、21、28天分别取血液分离淋巴细胞,提取淋巴细胞中的总RNA,反转录成cDNA,以进行荧光定量PCR检测。结果显示,在ASPS作用下,Th1类细胞因子(IFN-γ、IL-2)和Th2类细胞因子(IL-4、IL-10) mRNA的表达量呈现不同的变化趋势,IFN-γ和IL-2较早开始增多,并在免疫后第21天时达到峰值后下降,而IL-4和IL-10变化较晚,但是持续增多,并在免疫后第28天达到峰值。同时,ASPS能够不同程度地增加IL-1β、IL-6、iNOS和TNF-αmRNA表达量,尤其是IL-6,相比于其他细胞因子,IL-6的mRNA相对表达量变化幅度最大,免疫后第21、28天各组表达水平接近,ASPSH组的相对表达量最高,达到5左右。结果表明,ASPS能够不同程度地促进IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、IL-1β、IL-6、iNOS和TNF-α等8种细胞因子的mRNA表达,但是表达的变化幅度、变化趋势以及变化时间均有不同。     

猪传染性胃肠炎病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为了建立一种定量检测猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的实时荧光定量PCR方法,用RT-PCR扩增TGEV的M基因片段,构建含有TGEV M基因片段的重组质粒。用系列稀释后的重组质粒为模板,基于SYBR GreenⅠ来进行检测TGEV的实时荧光定量PCR扩增。结果显示,扩增效率为103.0%,相邻扩增曲线之间间距均匀,所有产物的熔解曲线具有单一整齐的峰,标准曲线具有优良的线性关系,最低可准确检测63copies/μL的核酸模板,重复性试验的变异系数小于3%。用建立的PCR对3种常见猪源RNA病毒的检测结果均为阴性,对65份临床样品的检出率高于常规PCR。结果表明,建立了一种灵敏度高、特异性强、重复性好的检测TGEV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,可用于TGEV的定量检测和猪传染性胃肠炎的早期快速诊断。     

山羊IFN-γ和TNF-α基因SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank中山羊γ-干扰素(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的基因序列,设计特异引物扩增目的基因。将IFN-γ、TNF-α基因克隆至p MD-19-T载体,得到各自阳性克隆质粒,以2种阳性质粒为标准品建立标准曲线并进行熔解曲线分析以及灵敏性、特异性和重复性试验。应用所建立的方法检测刀豆蛋白A(Con A)刺激健康山羊外周血单核细胞(PBMC)后不同时间点IFN-γ、TNF-α基因转录量。结果表明,当质粒标准品稀释度为1×10~9copies/L~1×10~5copies/L时,扩增曲线的Ct值与浓度间具有良好的线性关系,相关系数分别为0.999和1.000;熔解曲线分析表明,产物为特异性单峰且重复性较好。IFN-γ在第2小时和第48小时这两个时间点出现mRNA转录高峰,在第2小时检测到IFN-γ转录量为1.26×10~5copies/L,第48小时检测到转录量为8.56×10~4copies/L;TNF-α在0~24 h呈现下调的表达趋势,第48小时出现mRNA转录高峰,转录量为2.73×10~5copies/L;研究结果将为IFN-γ、TNF-α的定量分析提供技术平台。     

鸡传染性支气管炎病毒real-time PCR检测方法的建立

针对鸡传染性支气管炎病毒(IBV)N基因片段设计并合成了1对引物,将构建的重组质粒作为阳性标准品,成功建立了检测IBV核酸的SYBR GreenⅠreal-time PCR检测方法。结果显示,该方法的线性关系好,标准曲线的相关系数达0.998 3;最低可以检测到1×101 copies/μL的核酸模板;与常见禽源病毒新城疫病毒、传染性喉气管炎病毒、传染性法氏囊炎病毒、马立克氏病病毒均不发生交叉反应,重复性试验的变异系数小于3%。应用建立的方法对人工感染IBV的20只试验鸡的40份气管和肾样品中的病毒核酸进行检测,结果显示,攻毒后第5和第7天肾中病毒含量高于气管,证实了临床表现与病毒载量之间的关系。结果表明,建立的real-time PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可以用于IBV的病原检测及定量分析。     

牛轮状病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立快速特异的定量检测牛轮状病毒的荧光定量PCR方法,本研究从牛轮状病毒NCDV株DNA中扩增的VP6基因片段(211 bp)并克隆于pMD19-T载体(p MD19-T-VP6)作为重组质粒标准品,建立了SYBR Green I荧光定量PCR检测方法。结果表明,VP6片段长211 bp,经鉴定所构建的重组质粒成功;用该质粒测得real-time PCR的最低检测量为15.39 copies/L。用该方法检测猪传染性胃肠炎病毒、牛细小病毒、猪流行性腹泻病毒及伪狂犬病病毒的结果均为阴性,表明其具有良好的特异性。重复性试验结果表明,批内和批间重复变异系数均小于3%,表明该方法具有良好的重复性。以上结果表明,本研究建立的基于VP6基因的牛轮状病毒qRT-PCR检测方法具有特异、灵敏、快速等特点,可用于牛轮状病毒的早期诊断。     

鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白FliC的表达纯化及其生物学特性的研究

为研究鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白FliC的生物学特性,利用PCR方法扩增鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白FliC基因,构建重组表达质粒p ET-32a-FliC,经大肠杆菌Rosetta(DE3)表达、镍离子亲和层析法纯化后用SDS-PAGE和Western-blot方法分析。重组蛋白与巨噬细胞RAW264.7共孵育,ELISA和CCK-8法分别检测巨噬细胞细胞因子和巨噬细胞增殖情况。重组蛋白免疫小鼠后不同时间点检测血清抗体效价和细胞因子水平。结果显示,鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白FliC在大肠杆菌中呈可溶性表达,且可获得纯度较高的重组鞭毛蛋白。50 ng/m L和500 ng/m L重组鞭毛蛋白可刺激巨噬细胞增殖,同时促进巨噬细胞分泌IL-1、IL-4、IL-6、IL-8、IFN-γ和TNF-α。重组蛋白免疫小鼠后效价在第3周达到1∶128 000,同时小鼠血清细胞因子的分泌量呈倒V型变化。研究结果为后续进一步研究FliC蛋白在细菌感染、侵袭和免疫方面的作用研究提供了参考数据。     

猪IFN-γ mRNA竞争性RT-PCR定量检测方法的建立

无菌分离的猪外周血单个核细胞(PBMC),经ConA体外刺激培养15 h后提取细胞总RNA。以此总RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增到了435 bp的IFN-γ基因。把扩增到的IFN-γ基因与pMD18-T载体连接,构建了pMD-IFN435重组质粒。用另一对引物对重组质粒pMD-IFN435内部进行PCR扩增,得到了257 bp(含PstⅠ酶切位点)的基因片段,将此基因片段连接到pMD18-T载体上构建了pMD-IFN257重组质粒。将pMD-IFN257双酶切(PstⅠ SalⅠ)后回收的目的片段与pMD-IFN435双酶切(PstⅠ SalⅠ)后回收的目的片段连接,得到了含有367bp目的片段的重组质粒pMD-IFN367,即内标准DNA模板。以定量后的pMD-IFN367与2倍梯度稀释的pMD-IFN435进行竞争PCR扩增,建立了能够准确、方便定量检测猪IFN-γmRNA的标准竞争曲线的线性回归方程(y=0.414x-1.864)。     

牛细小病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立检测牛细小病毒的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,本研究通过提取牛细小病毒(ATCC VR-767)核酸,扩增NS1基因片段(大小约为171 bp),将NS1基因片段克隆到pMD19-T载体中,并将重组质粒p MD19-T-NS1/DH5α作为标准样品,用于建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法。研究结果显示,扩增基因片段长约171 bp,符合目的基因大小,经鉴定所构建的重组质粒正确。用该质粒测得SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR的最低检测量为53.3 copies/uL。用该方法检测牛细小病毒、牛轮状病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛呼吸道合胞体病毒和猪细小病毒,结果显示,只有牛细小病毒可以被检测到,而其他病毒均未被检出,表明该方法具有良好的特异性。重复性试验结果表明,批内和批间重复变异系数均小于1%,表明该方法具有良好的重复性。结果表明,本研究建立的基于NS1基因的牛细小病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法具有良好的特异性、灵敏性、重复性,可用于牛细小病毒感染的检测。     

鸡IFN-γ基因的原核表达及其表达产物的抗NDV活性

设计了1对特异性引物,从含有广西三黄鸡IFN-γ基因的重组质粒pMD18-ChIFN-γ中扩增出鸡的IFN-γ基因,将该基因插入到原核表达载体pGEX-4T-1中构建成重组表达质粒pGEX-ChIFN-γ,并将其转入到大肠杆菌BL21中,IPTG诱导表达的融合蛋白经SDS-PAGE和Western-blot分析,其分子质量约为42.4 ku,表明鸡IFN-γ基因在原核细胞中得到了表达。采用NDV国内参考强毒株F48E9对复性后的IFN-γ进行了活性测定;结果显示,IFN-γ的抗病毒活性为1.33×104U/mL。     

长白猪γ-干扰素基因的原核表达与分析

以含长白猪IFN-γ基因的质粒载体为模板,用原核表达引物扩增了长白猪IFN-γ基因,将其定向克隆至原核表达载体pET28b的EcoRⅠ和XhoⅠ位点,构建了长白猪IFN-γ基因的原核表达载体pET28b-PoIFN-γ。经酶切、PCR鉴定,表明所构建的重组质粒为特异性长白猪IFN-γ基因原核表达质粒。将该重组质粒转化大肠埃希氏菌BL21(DE3)细胞,阳性菌落筛选、SDS-PAGE分析以及Western-blotting分析表明,成功构建了表达重组猪IFN-γ的大肠埃希氏菌基因工程菌株。亚细胞定位分析表明,目的蛋白经原核表达后主要以不溶性包涵体形式存在,其他少量可溶性目的蛋白存在于细胞浆中。     

羊IL-2和OrfV-F1L基因疫苗联合免疫小鼠的免疫应答研究

为评价pVAX1-IL-2和pVAX1-F1L联合免疫小鼠诱导的体液和细胞免疫应答,分别将p VAX1-F1L+pVAX1-IL-2、pVAX1-F1L、pVAX1空载体、PBS对照组通过后腿肌肉注射的方式免疫KM系小鼠,采用ELISA方法检测免疫小鼠血清中OrfV特异性抗体以及Th1型(IL-2、IFN-γ和TNF-α)、Th2型(IL-4、IL-6和IL-10)细胞因子;MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖反应。结果显示,pVAX1-F1L+pVAX1-IL-2联合免疫组小鼠血清抗体效价及IL-2、IFN-γ和TNF-α细胞因子水平均显著高于pVAX1-F1L组,与p VAX1组、PBS组相比差异极显著(P0.01);pVAX1-F1L+pVAX1-IL-2联合免疫组小鼠血清IL-4、IL-6和IL-10细胞因子水平均显著高于pVAX1组和PBS组,与pVAX1-F1L组相比差异不显著(P0.05);且pVAX1-F1L+pVAX1-IL-2免疫组的脾淋巴细胞增殖水平高于pVAX1-F1L组、pVAX1组和PBS组(P0.01)。结果表明,p VAX1-IL-2和pVAX1-F1L联合免疫小鼠,能诱导小鼠产生OrfV特异性体液免疫和细胞免疫,p VAX1-IL-2诱导的免疫反应以细胞免疫应答为主,且能促进Th1型细胞因子的分泌。