传染性法氏囊病病毒在vero细胞上的适应增殖研究

传染性法氏囊病病毒在ｖｅｒｏ细胞上的适应增殖研究汪培林（四川省三台县畜牧局６２１１００）蔡宝祥李劲松（南京农业大学）鸡传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）的许多毒株既能适应于鸡胚源细胞，也能适应于许多哺乳动物细胞，但不同毒株在哺乳动物细胞上的增殖特性有所不...     

新型鸭呼肠孤病毒TH11株在BHK21细胞系中的增殖特性

为研究新型鸭呼肠孤病毒(novel duck reovirus,NDRV)在BHK21细胞系中的增殖规律,将NDRV野毒株TH11接种BHK21细胞系,连续传代3次后,观察病毒对细胞的致病变效应(CPE),并对病毒核酸及其蛋白的表达和病毒增殖特性进行了鉴定。结果显示,NDRV TH11株能够在BHK21细胞中有效增殖,并产生以细胞巨融合为主的典型CPE,病毒蛋白在细胞中也获得了良好表达,并与σC蛋白特异性抗体发生反应。一步生长曲线显示,TH11毒株感染BHK21细胞后第0~12小时为潜伏期,第12小时开始增殖,第12~36小时进入快速增殖期,第48小时病毒效价即达到最高,即TCID50为106.57/0.1mL,随后病毒的增殖随细胞的崩解而降低。上述结果为进一步研究NDRV的致病机理和研制细胞灭活疫苗奠定了基础。     

扫描电镜对马传贫病毒感染细胞的观察

我们用透射电镜对马传贫病毒的观察,基本上弄清了该病毒的二维结构及增殖方式,明确了其强、弱毒在形态上无明显差异。但该病毒的三维结构又是怎样的?它是如何在细胞表面上以“出芽”方式进行增殖的?整个细胞表面将以多大数率和面积增殖病毒?整个单层细胞有多少被感染?我们通过扫描电镜技术来研究这些问题。     

BST2敲除的MDCK细胞构建及H9亚型禽流感病毒增殖效果的观察

为提高细胞培养系统中禽流感病毒的增殖效率,通过构建缺失BST2编码序列的MDCK细胞系,探索BST2对H9亚型禽流感病毒在细胞系中增殖的影响。利用CRISPR/Cas9系统对MDCK细胞BST2主要功能区域进行基因编辑,获得MDCK-BST2-KO单细胞克隆,并检测细胞的增殖能力。通过慢病毒表达转染获得BST2表达细胞系,检测接毒后不同细胞系的BST2蛋白表达情况,并比较病毒的增殖情况。结果表明,利用CRISPR/Cas9系统成功获得MDCK-BST2-KO单细胞克隆,该细胞克隆生长能力与母细胞无差异但增毒能力增强,且BST2蛋白抑制H9亚型禽流感病毒在MDCK细胞中的增殖。     

鸡减蛋综合征病毒在鸭胚中增殖规律试验

鸡减蛋综合征病毒在鸭胚中增殖规律试验薛华平，郑莹，薛义山（皇岗动植物检疫局深圳５１８０４５）（深圳坑梓种鸡场）鸡减蛋综合征（ＥＤＳ－７６）病毒能在鸭胚、鹅胚上良好增殖，但对该病毒的接种时间、接种量以及收毒时间各处报道不一。为探索ＥＤＳ－７６病毒在鸭胚...     

猪流行性腹泻病毒细胞适应毒LJB-03株在三种Vero细胞上增殖效果的比较

为探究猪流行性腹泻病毒(PEDV)细胞适应毒LJB-03株在3种Vero细胞上的增殖特性,分别以正常Vero细胞、适应无血清培养基的Vero细胞和稳定表达跨膜丝氨酸蛋白酶2 (TMPRSS2)的Vero/TMPRSS2细胞(繁殖PEDV时无须添加胰酶)为宿主细胞,繁殖PEDV LJB-03株,观察这3种细胞接毒后的病变特点和病变时间,利用空斑法比较其增殖特性,并以间接免疫荧光和电镜技术鉴定病毒的增殖。结果表明,PEDV LJB-03株在正常Vero细胞和适应无血清培养基的Vero细胞上增殖时需添加的胰酶最佳质量浓度为7ug/m L;在这3种细胞上增殖时的最佳感染复数均为0.01;PEDV LJB-03株在3种细胞上效价达到峰值的时间均为36 h,其中在正常Vero细胞上病毒效价最高为7.17×10~7PFU/m L,在Vero/TMPRSS2细胞上病毒效价为3.33×10~7PFU/m L,在无血清Vero细胞上的病毒效价为2.85×10~7PFU/m L。综上所述,正常Vero细胞上PEDV LJB-03株的病毒效价可达其他2种细胞的2倍以上,但在培养病毒时正常Vero细胞需添加胰酶和血清,因此,适应无血清培养基的Vero细胞与Vero/TMPRSS2细胞在培养PEDV LJB-03株时更具有潜力。     

猪传染性胃肠炎病毒的血凝作用

将猪传染性胃肠炎病毒（ＴＧＥＶ）Ａ株在ＩＢＲＳ２细胞上增殖，培养物经差速离心浓缩后与鸡红细胞出现了高凝集价（２８），这种凝集作用能被兔抗ＴＧＥＶ高免血清所抑制。试验的最适反应条件为体积分数０．５０％红细胞４℃作用１ｈ。通过反复试验，建立了一种简单实用的血凝抗原制备方法，病毒培养液不需浓缩可直接应用。     

小反刍兽疫病毒H基因过表达对病毒增殖的影响

为研究小反刍兽疫病毒H基因过表达后对病毒增殖的影响,根据G en Bank中小反刍兽疫病毒疫苗株Nigeria 75/1 H基因序列,设计1对引物扩增H基因全长编码区序列,并将其连接至真核表达载体p EGF P-C 3上,经鉴定正确后转染CHS-20细胞,并通过R T-PCR、荧光观察及W estern-blot分别在m RNA和蛋白水平检测H基因的表达。结果表明,H基因在CHS-20细胞内得到了表达。将p EGFP-C3-PPRV H重组质粒、空载体p EGFP-C3转染CHS-20细胞,待H基因表达后,接种PPRV Nigeria 75/1,病毒增殖一定时间后,以β-actin作为内参基因,采用相对荧光定量RT-PCR法研究病毒增殖量的变化。结果表明,相对于未转染及转染空载体p EGFP-C3的细胞,转染p EGFP-C3-PPRV H重组质粒的细胞PPRV增殖量得到了提高,且差异显著(P0.05),这说明在CHS-20细胞中过表达PPRV H基因能促进PPRV增殖。     

BHK细胞及其克隆细胞系对三株口蹄疫病毒敏感性的变化

试验发现,各实验室保存的BHK单层和悬浮细胞对三株口蹄疫病毒的敏感性是不同的。文中比较了各亲本细胞群及其克隆细胞系的敏感性。结果发现,所检查的细胞群都是由若干支持口蹄疫病毒增殖能力不同的细胞类型构成的,细胞群中敏感和非敏感细胞的相对数目是该细胞群中总敏感性的决定因素。     

姜黄素抑制PEDV感染Vero细胞的作用研究

为探究姜黄素是否具有抑制猪流行性腹泻病毒（PEDV）感染的作用,本研究以Vero细胞为实验对象,分别设置阴性（空白）对照组、PEDV感染组、姜黄素处理组、姜黄素预处理后感染PEDV组,在PEDV感染后观察细胞病变,利用RT-qPCR、Western-blot、IFA技术和病毒滴度测定法检测PEDV在Vero细胞中的增殖情况。结果显示,与阴性对照组相比,PEDV感染Vero细胞后有明显细胞病变,即细胞拉丝、细胞核固缩并空泡化。与PEDV感染组相比,姜黄素预处理后显著抑制了病毒在细胞内的增殖（P<0.05）,降低了病毒感染后的滴度（P<0.05）,显著上调了Vero细胞抗病毒细胞因子IFN-α、IFN-β的分泌水平及MX1、ISG15、ZAP的转录水平（P<0.05）。与阴性（空白）对照组相比,PEDV感染后抗病毒细胞因子IFN-α、IFN-β的分泌水平明显上调（P<0.05）,但MX1、ISG15、ZAP的转录水平无显著变化（P>0.05）;姜黄素处理后除IFN-α分泌水平无明显变化外,IFN-β分泌水平及MX1、ISG15、ZAP转录水平均显著上调（P&l...     

禽呼肠孤病毒S1133株在LMH细胞系中增殖特征的研究

为研究禽呼肠孤病毒(ARV)在鸡肝癌细胞(LMH)中的增殖特性,本研究将ARV S1133毒株感染LMH细胞,连续传代3次,观察细胞病变(CPE),通过RT-PCR鉴定病毒,并进一步研究病毒的增殖特性。结果显示,ARV S1133毒株能够在LMH细胞中很好地增殖,并出现典型的CPE。一步生长曲线结果显示,S1133感染LMH细胞后的前12 h为潜伏期,12 h~24 h为快速增长期,第24小时的效价达到最大,TCID50为10-9.2/0.1 m L。本研究为进一步研究ARV的致病机理和研制细胞灭活疫苗提供了良好的操作平台。     

霉形体对新城疫、鸡传染性支气管炎病毒疫苗株体外增殖的影响

霉形体是组织细胞培养中常见的污染物,它可引起病毒增殖改变,即有的病毒增殖被抑制,有的增殖反而增强,但也有的无明显变化。据报道,国内实验室现行使用的细胞中霉形体污染情况严重;国内用鸡胚和鸡胚细胞培养制造的活疫苗也被霉形体污染,而且证明其污染来源为鸡胚。但实际中霉形体污染对疫苗株病毒增殖的作用尚不清楚。本试验在鸡胚培养中,研究了自疫苗中分离的鸡毒霉形体对新城疫病毒Ⅰ系、Ⅱ系、LaSota系和鸡传染性支气管炎病毒H_(120)株增殖的影响。     

犬肾传代细胞与犬肺巨噬细胞杂合体的获得与鉴定

通过细胞融合技术获得了１３个犬肾传代细胞（ＭＤＣＫ）与大肺巨噬细胞（ＤＬＭ）杂合细胞株，其中２株（分别命名为ｋＭＨ—１和ｋＭＨ—２）对犬瘟热病毒（ＣＤＶ）强毒敏感。对ＫＭＨ—１鉴定结果表明该细胞在外观上与亲本细胞ＭＤＣＫ相似，呈现上皮细胞样形态，２５世代细胞在２４～１４４小时之间为对数生长期，群体倍增时间为２３．６小时，染色体众数为７７条，呈现近二倍体样核型。该细胞对ＣＤＶ强毒和弱毒敏感，并产生典型的多核巨细胞样细胞病变（ＣＰＥ），同时也能支持传染性犬肝炎病毒（ＩＣＨＶ）的增殖，产生而萄串样ＣＰＥ，说明杂合细胞ｋＭＨ—１保留了双亲细胞的遗传特性，经传到７８代仍保持低代次细胞特性。     

禽网状内皮组织增殖病

禽网状内皮组织增殖病匡宝晓徐福南（南京农业大学动物医学院２１００９５）禽网状内皮组织增殖病（ＲＥ）是由反转录病毒科的禽网状内皮组织增殖病病毒（ＲＥＶ）引起的鸡、鸭、火鸡和其他禽类的一组综合征，包括致死性网状细胞瘤、矮小综合征以及淋巴组织和其他组织的慢...     

伪狂犬病病毒感染小鼠骨髓间充质干细胞的增殖特性

体外分离培养小鼠骨髓间充质干细胞,用伪狂犬病病毒感染骨髓间充质干细胞,通过细胞病变观察、毒力测定、PCR及间接免疫荧光试验,评估了伪狂犬病病毒在间充质干细胞内的增殖情况。结果显示,经体外分离培养并鉴定的间充质干细胞感染伪狂犬病病毒后,产生典型的细胞病变;经毒力测定细胞内伪狂犬病病毒的TCID50效价较高;经PCR从间充质干细胞内成功扩增出伪狂犬病病毒的特异性片段;间接免疫荧光试验显示间充质干细胞内分布有特异性荧光。表明,该细胞适应伪狂犬病病毒在其上增殖繁衍,具有作为伪狂犬病病毒致细胞病变机理、潜伏感染及致病等机制平台的潜质。     

PR8流感病毒突变株的制备及其在鸡胚上生长特性的研究

在前期发现流感病毒WSN株的NS2或NP蛋白突变使病毒在细胞上增殖能力明显提高的基础上,研究了这些突变是否会使PR8病毒效价在鸡胚上进一步提高的可行性,通过反向遗传操作技术获得了NS2E67S和NPP277A两株PR8突变病毒。经过比较突变病毒与野生病毒在鸡胚中的增殖能力,发现NS2E67S突变病毒在鸡胚上增殖后的效价与HA抗原表达量均明显提高,而NPP277A突变病毒在鸡胚上的增殖能力不及野生PR8病毒。该研究结果将对进一步研究病毒基因变异与宿主互作机制奠定基础,有可能通过NS2E67S突变病毒对改良流感疫苗具有重要的应用价值。     

猪传染性胃肠炎病毒在ST细胞中增殖规律的研究

通过孔板培养系统以及微载体和转瓶培养系统,研究了感染复数(MOI)、病毒感染时间(TOI)和病毒维持液对细胞生长和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)繁殖的影响。结果表明,MOI影响细胞生长速率和单位细胞病毒产量,TOI影响细胞对病毒的敏感程度以及胞内病毒的增殖速率;丰富的维生素、氨基酸等物质有利于病毒效价的提高;采用微载体和生物反应器系统生产TGEV,病毒效价可达11.3lgTCID50/0.2mL,比方瓶培养系统提高约100倍。     

适合猪圆环病毒2型敏感复制的PK15细胞株的克隆与鉴定

为了有效提高猪圆环病毒2型(PCV2)在PK15细胞中增殖的效价,采用有限稀释法将PK15细胞进行克隆,通过间接免疫荧光方法筛选对PCV2敏感的克隆细胞.结果表明,通过克隆后获得1株对PCV2高度易感的细胞PK15-B1,该细胞接种PCV2后培养3 d,病毒的TCID50达10-7.0/mL,病毒效价和生产速度明显高于...     

猪瘟病毒免疫的细胞学研究进展

猪瘟 (Ｈｏｇｃｈｏｌｅｒａ ,ＨＣ或Ｃｌａｓｓｉｃａｌｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒ ,ＣＳＦ)是造成养猪业巨大经济损失的主要传染病之一。尽管在最近几年 ,由于分子生物学技术的发展和应用 ,对猪瘟病毒 (ＨＣＶ )的研究有了很大进步 ,但还存在着许多亟待解决的问题 ,如ＨＣＶ病毒粒子的结构、感染的分子基础、非结构蛋白的功能、病毒在细胞中增殖及其与宿主细胞的关系、免疫应答机制等。尤其在 2 0世纪70年代后期 ,出现猪瘟免疫失败的现象 ,使人们研究的重点开始转向对ＨＣＶ感染和免疫机制的研究。为此 ,本文将从ＨＣＶ在细胞中的增殖、病毒与…     

稳定表达人TMPRSS2基因BHK细胞系的建立及其对新城疫弱毒增殖效率评价

为提高细胞培养系统中新城疫病毒的增殖效率,通过构建TMPRSS2过表达的BHK细胞系,探索其对新城疫弱毒增殖的影响。本研究将TMPRSS2基因克隆于噬菌体载体pHAGE中,构建重组质粒pHAGE-TMPRSS2。将重组质粒pHAGE-TMPRSS2以及辅助包装质粒psPAX2和pMD2G共转染至293T细胞并收集上清。将包装好的慢病毒感染BHK细胞,通过Blasticidin加入筛选和有限稀释法将单克隆细胞扩大培养。经RT-PCR和Western-blot鉴定,结果表明,TMPRSS2在BHK细胞中获得了稳定的高表达。接种新城疫弱毒后通过TCID50测定显示,TMPRSS2过表达BHK细胞系能支持较高水平的病毒增殖。