三种猪腹泻病毒性病原多重RT-PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank中登录的猪流行性腹泻病毒(PEDV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪A群轮状病毒(GAR)的基因序列保守区,分别设计了3对引物。通过对引物浓度、退火温度等条件进行优化,建立了检测PEDV、TGEV和GAR的三重RT-PCR方法,并对其灵敏度、特异性进行了检测。该方法的最低检测量分别为PEDV 0.24pg、TGEV 2.3pg、GAR 1.5pg;特异性试验显示,它对猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪萨佩罗病毒、猪博卡病毒、猪环曲病毒、猪源大肠杆菌、猪链球菌2型、猪源沙门菌、空肠弯曲杆菌和金黄色葡萄球菌等均不产生非特异性扩增。利用该方法对采自四川省6个猪场的46份样品进行检测,结果,PEDV阳性率达76.1%,TGEV阳性率为19.6%,而GAR未被检出;表明同场样品中存在PEDV与TGEV的混合感染。同时用文献报道的单一RT-PCR法对上述样品进行检测,结果符合率均为100%。结果表明,建立的三重RT-PCR具有较高的灵敏度和特异性,可用于PEDV、TGEV和GAR的检测。     

鉴定“猪传染性胃肠炎”华株病毒为猪流行性腹泻病毒

自Doyle和Hutchings于1946年报告了美国在1945年发生的一种由病毒引起的猪传染性胃肠炎(简称TGE)后,接着一些国家用组织培养技术分离了病毒,并证明为冠状病毒[1、2、3、4、5、6、7、],迄今尚未证明不同猪传染性胃肠炎病毒株有血清型的差别。 1977年Wood报道:英国猪传染性胃肠炎的一部分是由一种在抗原性上和猪传染性胃肠炎病毒及猪轮状病毒不同的病毒株引起的[24]。1978年Pensaert和Debouck 报道了比利时四个猪场爆发的症状和流行病学与猪传染性胃肠炎相似的腹泻,并在电镜观察中见到多形性典型冠状病毒,但用初代猪肾细胞和次代猪甲状腺细胞培养物盲目传代时并未能分离出病     

动物病毒的消毒

病毒对各种消毒药的抵抗力差异很大,同属病毒之间的差异一般小于不同属病毒相互之间的差异。在兽医上有重要性的主要病毒属的毒株都被选来进行本试验。口蹄疫、猪水泡病和鸡新城疫的病毒未选用,因为它们已列入1974年颁布的(已证实有消毒药)的动物疾病条例汇编(The provisions of the Diseases of Animals(Approved Disinfectants)Order,1974 ]中,口蹄疫病毒和猪水泡病病毒对一系列消毒药具有敏感性最近已有报道(Sellers,     

猪乙型脑炎弱毒苗和猪细小病毒苗预防秋季初产母猪死胎免疫方法的研究

初产母猪死胎(包括木乃伊)是母猪繁殖障碍影响养猪生产的重要因素之一。四川、上海、黑龙江、浙江及广东等省市均有报道。1982～1984年,我所在秋季初产母猪死胎病因研究中,分离出乙型脑炎病毒一株,猪细小病毒3株,并对5个猪场进行了血清学调查,猪乙型脑炎阳性率平均为98.62％,猪细小病毒阳性率平均为60％。为此,我所于1984～1985年开展了免疫方法的研究。     

用醛化猪红细胞进行猫泛白细胞减少症病毒血凝试验

猫泛白细胞减少症(FPL )的病原是猫泛白细胞减少症病毒(FPLV),系细小病毒成员,又称为猫细小病毒(FPV)。本病在我国,据报道(张振兴等,1984)已成为当前最严重的猫病之一,本病可用血凝(HA)试验检测病猪粪便中的病毒而作出诊断。然而,应用新鲜猪红细胞作HA试验存在着不易长时间保存,不同个体的红细胞间有差异,以及有些个体的红细胞存在自凝现象等缺点。所以,我们进行了醛化猪红细胞的HA试验,得到了较好的效果。     

猪传染性胃肠炎病毒对猪肾传代细胞的适应性观察

据报道猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)可在猪睾丸传代细胞(ST)、胎猪或新生猪甲状腺细胞、唾液腺细胞、肾细胞(ESK)、睾丸细胞(EST)等上繁殖。但我们尚未见到用猪肾传代细胞(IBRS_2)繁殖TGEV而提高其毒价的报道。 (一)材料和方法 1.种毒:Purdue毒株,1985年从美国动植物检疫局兽医诊断室引进,后用EST细胞繁殖,1987年3月测定毒价为10~2 TCID_(50)/0.05ml。     

猪嵴病毒重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条（RPA-LFD）快速诊断方法的建立与应用

自2007年在猪粪便中首次检测到猪嵴病毒(PKV)以来,该病毒已在世界范围内被广泛报道,并可能与仔猪的腹泻有关。本研究首次建立了以重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条(RPA-LFD)的技术来检测PKV的快速、可视化的诊断方法,并对此方法的敏感性、特异性及重复性进行了评价。结果显示,该方法具有良好的特异性,仅可以特异性扩增PKV,与其它主要猪病毒没有交叉反应;最佳反应时间和温度是RPA在37℃下20 min及LFD在室温下10 min;检测极限为1×10~2拷贝的PKV。利用本研究建立的RPA-LFD方法和常规RT-PCR方法同时检测20份猪的临床粪便样品,结果显示,RPA-LFD方法检测猪嵴病毒阳性率为60%,明显高于常规RT-PCR的50%。上述结果表明,RPA-LFD方法可应用于猪嵴病毒的快速检测。     

猪痢疾病原及免疫机理研究进展

猪痢疾是由猪密螺旋体引起的,以出血性和坏死性肠炎为特征的疾病(俗称为猪血痢)。8～14周龄的断奶猪易发,严重影响着养猪业的发展。本文仅就病原和免疫机理作一概述。 (一)病原 猪痢疾自Whiting(1921)首次报道以来,其病原在长达50年里一直不清,曾被怀疑的病原有沙门氏菌、螺旋体、弧菌、坏死梭杆菌、病毒、结肠小袋虫、变形虫、毛滴虫及其它原虫等。直至1971年,由Taylor和Alexander报告了一种致病性厌氧螺     

猪流行性腹泻病毒猪传染性胃肠炎病毒猪Delta冠状病毒和猪轮状病毒多重RT-PCR检测方法的建立

针对猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪Delta冠状病毒(PDCoV)和猪轮状病毒(PRoV)基因序列,分别设计特异性引物,扩增PEDV N基因(750 bp)、TGEV M基因(544 bp)、PDCoV N基因(183 bp)和PRoV VP6基因(329 bp)。经过对引物浓度、退火温度等反应条件的优化及特异性、敏感性、重复性试验,成功建立了快速鉴别检测PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV的多重RT-PCR方法。该方法仅对PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV检测为阳性,对口蹄疫病毒(FMDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪细小病毒(PPV)等主要病毒的扩增均为阴性。PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV重组质粒标准品的检出下限分别为1.57×10~2、1.57×10~3、1.57×10~2、1.57×10~2copies/L。相同条件下的重复性试验获得均匀一致的结果。应用所建立的方法检测2017—2018年采集自广西各地的270份腹泻病料,结果显示,PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV的阳性率分别为15.56%、11.48%、10.74%、1.85%,并且存在混合感染现象。上述结果表明,所建立的多重RT-PCR方法可用于PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV的快速鉴别检测及流行病学调查。     

猪的蓝耳病简介

猪的蓝耳病(Blue EarDisease)是由一种病毒(L-elystad Virus)引起猪的一种传染病。1987年美国农业部首次报道了此病,并定名为“猪生殖道及呼吸道症(SRRS)。此病传入欧洲后,又称为“蓝色流产病(BAD)”或“神秘生殖道症候群”(MRS)或“母猪神秘疾病(MSD)”等病名。此病最早由北美洲流行,后来传入德国、荷兰、比利时等国,目前正在西班牙、法国、英国等国家流行,造成母猪流产和死亡增加7％～10％,断奶前后的仔猪死亡率高达60％～80％的严重经济损失。     

猪δ冠状病毒TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR方法的建立和应用

为了快速准确地检测猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV),本研究根据PDCoV基因序列保守区设计特异性引物和TaqMan-MGB探针,建立了一种特异性检测PDCoV的TaqMan-MGB荧光定量方法。结果显示,该方法特异性良好,对猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型等的检测结果均为阴性,无交叉反应;模板浓度在3.15×108～3.15×101copies/?L范围内具有良好的线性关系;敏感性高,最低检测限为10 copies/?L的模板;重复性好,批内和批间重复性试验变异系数分别为0.25%～1.06%和0.58%～1.27%;对临床样品的检测结果显示,本研究建立的荧光定量检测方法对PDCoV的阳性检出率(40%)高于常规PCR方法对PDCoV的阳性检出率(31.7%)。该方法的建立为PDCoV的实验室鉴别诊断及流行病学调查提供了快速、准确的检测手段。     

接种猪水泡病病毒(UKG株)以及科赛奇B_5病毒致使猪脑和脊髓的损伤

梅岛动物疾病中心(PIADC)和意大利Gagliardi等氏曾详述过接种猪水泡病病毒(香港株)后猪中枢神经系统(CNS)受损症状和与其有关的损伤。 本报告的目的在于描述无特异病原猪经静脉接种和同居感染UKG株猪水泡病病毒以及与其紧密相关的科赛奇B_5病毒所出现的神经学变化,并证实这两种病毒引起的损伤是否相似。     

猪博卡病毒5型SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据猪博卡病毒5型NS1基因序列设计引物,建立了基于SYBR GreenⅠ的用以检测猪博卡病毒5型的实时荧光定量PCR。用该方法检测猪博卡病毒5型NS1基因,在3.64×102~3.64×107 copies/μL范围内有很好的线性关系。扩增产物的熔解曲线仅出现单一特异峰,无引物二聚体,Tm值为(83.12±0.12)℃,对猪圆环病毒(PCV1和PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪输血传播病毒(TTV1和TTV2)的核酸均无阳性信号扩增,可重复性好,组内变异系数为0.35%~1.24%,组间变异系数为0.43%~1.46%。此方法的建立为定量分析猪博卡病毒5型感染猪的感染程度和靶器官提供了精确检测手段。     

PEDV-TGEV-RV三重PCR检测方法的建立

根据G en Bank中已登陆的猪流行性腹泻病毒(PED V)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(RV)的参考基因序列,设计3对引物分别用于扩增PEDV的N基因、TGEV的M基因、RV的VP7基因的目的片段;通过优化反应体系,建立了同时检测PEDV、TGEV、RV的三重PCR检测方法。敏感性和特异性试验的结果表明,该方法对这3种病毒的最低核酸检出量分别为39.5 pg(PEDV)、38.1 pg(TGEV)和51.6 pg(RV)。该方法可同时扩增477 bp(PEDV)、263 bp(TGEV)、355 bp(RV)的特异性基因片段,而对猪瘟病毒(CSF V)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和伪狂犬病病毒(PRV)等病毒的检测结果均为阴性。三重PCR与单一PCR的符合率为100%。上述结果表明,该方法的建立对于这3种病毒的临床快速检测与流行病学调查具有十分重要的意义。     

猪生殖与呼吸综合征病毒的分子生物学研究进展

猪生殖与呼吸综合征 (Ｐｏｒｃｉｎｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｄｒｏｍｅ ,ＰＲＲＳ)是由猪生殖与呼吸综合征病毒 (ＰＲＲＳＶ)引起的一种新ＲＮＡ病毒病。它以母猪发热、厌食和流产、死产、干尸化胎、产弱仔等繁殖障碍以及仔猪的呼吸道症状和高死亡率为特征。该病自 1987年首次在美国发现以来 ,先后流行于加拿大、德国、荷兰、西班牙、比利时、英国、法国、意大利、波兰、丹麦、马耳他等国家[1] ,现已遍及北美洲及欧洲 ,亚洲的日本、韩国、菲律宾及我国的台湾省也有疫情报道。近几年来 ,随着优良种猪的…     

猪流行性腹泻病毒间接ELISA检测方法的建立

为建立快速检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的血清学方法,本研究以原核表达的猪流行性腹泻病毒AH2012株N蛋白为包被抗原,通过条件优化建立了一种快速的间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测方法。利用该ELISA检测猪流行性腹泻病毒血清时为阳性,而与猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒、口蹄疫病毒,猪圆环病毒2型、猪呼吸道冠状病毒的阳性血清均无交叉反应;批内和批间重复性试验的变异系数均小于5.55%;该方法与中和试验检测结果总符合率为88.75%。本研究建立的方法可以应用于我国猪流行性腹泻病毒的诊断、流行病监测以及疫苗研发时抗体水平的检测,为该病的防控提供一种有效的检测工具。     

猪圆环病毒3型RAA检测方法的建立及初步应用

为建立猪圆环病毒3型(PCV3)的快速简便检测方法,根据PCV3 Cap基因的保守序列设计多对引物和探针,建立了一种实时荧光RAA检测方法。通过筛选引物和优化试验条件,验证对常见动物疾病病毒的特异性,并与PCR方法在敏感性上进行比较。结果表明,PCV3与猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪A型塞内卡病毒(SVA)和口蹄疫病毒(FMDV)等核酸无交叉反应,可在39℃下20 min内快速特异完成。该方法灵敏度较高,最低检出浓度为10~2copies/μL。应用该方法对115份猪临床样品进行检测,检测结果与PCR方法一致。结果表明,该方法操作简单、快速灵敏、结果可靠,可用于PCV3的实验室检测和现场诊断。     

猪环曲病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立和应用

根据猪环曲病毒N基因保守序列设计特异性引物与TaqMan探针,建立猪环曲病毒荧光定量RT-PCR检测方法,并评价其特异性、敏感性和重复性。结果显示,该方法能检测猪环曲病毒,而对猪流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒、猪星状病毒、A群猪轮状病毒、猪博卡病毒、猪嵴病毒和伪犬病病毒等核酸的检测均无交叉反应,具有良好的特异性;建立的定量标准曲线Ct值和模板终浓度在109~102copies/L范围内有良好的线性关系,该方法检测灵敏度可达102copies/L;重复性试验的组内、组间的变异系数均小于2.5%。对88份猪粪便样品进行检测,荧光定量RT-PCR检出30份猪环曲病毒阳性,常规RT-PCR检出28份猪环曲病毒阳性,两种方法的符合率为93.34%。本研究建立的荧光定量RT-PCR可用于猪环曲病毒的快速检测和流行病学调查。     

免疫酶技术证实:国内的猪传染性胃肠炎病毒与比利时的CLV在血清学上相一致

1979年黄均健等用免疫荧光、中和试验、酶免疫试验和猪体交互保护试验等发现国内猪传染性胃肠炎病毒(简称TGE华株)与国外TGE M株、SH株和TO株不同,初步认为TGE华株可能是TGE新的血清型,但也不排除是一个新的冠状病毒的可能。M.Pensaert在1978年报道比利时发现一个与TGE不同的CLV(Corana-like virus)。我们用比利时的CLV抗血清制成的酶标记抗体染上了我国的TGE华株。现报告如下。     

关于猪水泡病病毒轻度和亚临床感染

有关猪水泡病病毒(SVDV)自然和实验感染的报告中指出,某些猪不表现临床症状,但能产生有意义水平的中和抗体(Nardelli等,1968;Mowat等,1972;Kubin,1973;Dawe等,1973;Burrows、Greig和Goodridge,1973;Burrows、Mann和Goodridge,1974)。这些报告的大多数,认为所涉及的猪是曾与临床病猪,因而与大量病毒有过接触,但有一部分猪只是接触过较少量的病毒。在自然爆发中,本病的发病率波动于25％(Nardelli等,1968)至65％(Anon,1973)之间。虽然在一个感染农场,总的发病率可能低,但对一个单栏来讲,则可达到90％或更高。