H3亚型猪流感病毒血凝素基因在昆虫细胞中的表达及其间接ELISA检测方法的建立

根据GenBank上登录的H3亚型猪流感病毒HA基因序列设计了1对引物,经PCR扩增出HA基因目的片段,并将其克隆到pFastBacGP67C杆状病毒载体上,筛选阳性重组转座载体pFastBacGP67C-H3,转化至含有杆状病毒穿梭载体(bacmid)的DH10Bac感受态细胞,构建杆状病毒表达载体,获得重组转座子rBacmid-H3,在脂质体介导下转染处于对数生长期的sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBv-H3,将其感染sf9昆虫细胞,收获目的蛋白。经血凝试验、SDS-PAGE、Western-blot、免疫组织化学分析,结果表明,HA蛋白得到表达,且具有良好的免疫学活性。用表达的HA蛋白作为包被抗原,初步建立了H3亚型猪流感病毒的间接ELISA检测方法,通过对93份送检的疑似猪流感血清进行检测,结果显示,检出阳性率为46.24%。上述结果为建立快速、准确、简便的H3亚型猪流感鉴别诊断试剂盒奠定了基础。     

寨卡病毒NS1蛋白在杆状病毒系统中的表达及免疫原性分析

本研究旨在采用杆状病毒表达系统表达并纯化寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)NS1蛋白,并对其免疫原性进行鉴定。将ZIKV NS1基因克隆至杆状病毒载体pFastBac1中,构建重组转移载体,将其转化DH10Bac感受态细胞进行蓝白斑筛选。将鉴定正确的重组杆粒转染sf9细胞,获得重组杆状病毒,经SDSPAGE和Western-blot鉴定蛋白正确表达后,将其感染High5细胞,大量表达重组蛋白,并用镍柱亲和层析法进行纯化,将纯化后的ZIKV NS1蛋白免疫BALB/c小鼠,进行血清特异性抗体效价检测。最终结果显示,获得了纯度较高分泌表达的ZIKV NS1蛋白,并且血清特异性抗体效价实验表明,纯化的ZIKV NS1蛋白能够诱导小鼠产生特异性免疫反应,有很好的免疫原性。本研究为ZIKV疫苗和诊断试剂盒的研发奠定了重要的基础。     

非洲马瘟病毒VP7基因在重组杆状病毒中的表达及抗原性检测

利用pFastBacHTA质粒将非洲马瘟病毒(AHSV)血清4型的VP7基因重组入杆状病毒,并感染昆虫细胞Sf9。结果显示,VP7蛋白在真核细胞内获得了表达,但表达量较低。免疫印迹试验证实,VP7重组蛋白具有较好的免疫原性,将其作为检测抗原包被酶标板,初步建立了检测AHSV的间接酶联免疫吸附试验方法。     

番鸭细小病毒样颗粒的制备与鉴定

为在昆虫细胞中表达番鸭细小病毒主要结构蛋白VP3,并探讨重组蛋白VP3能否在昆虫细胞中自动组装成病毒样颗粒,高保真扩增VP3基因,克隆入杆状病毒转移载体pFastBac1中,获得重组转移质粒pFB-VP3,转化DH10Bac感受态细胞,经抗性、蓝白斑筛选及PCR鉴定,得到重组Bacmid DNA。将其转染昆虫细胞Sf9,制备重组杆状病毒rBac-VP3,利用SDS-PAGE、Western-blot、间接免疫荧光试验对重组蛋白的表达情况进行检测,负染电镜观察病毒样颗粒,并通过Western-blot对病毒样颗粒进行鉴定。SDS-PAGE和Western-blot结果表明重组蛋白大小正确。间接免疫荧光试验结果显示,重组蛋白获得了成功表达。利用负染电镜可观察到直径约20 nm的典型二十面体病毒样颗粒。Western-blot结果显示该病毒样颗粒由VP3蛋白组成。本研究首次成功利用杆状病毒/昆虫细胞表达系统制备了番鸭细小病毒样颗粒,为番鸭细小病毒病新型基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

牛疱疹病毒1型gE蛋白胞外区基因的杆状病毒表达及其表达产物的免疫反应性

为获得具有生物学活性的牛疱疹病毒1型(BHV 1)囊膜糖蛋白gE,采用PCR方法从BHV 1感染的牛肾细胞全基因组中扩增出约1.7kb的gE基因,再将1 176bp的gE胞外区基因片段克隆到新型杆状病毒载体pFastBac-LIC-Bse中,构建重组转移质粒pFB-gE。将pFB-gE转化到杆状病毒基因组的DH10Bac感受态细胞中,制备重组杆粒rBacmid-gE。将该重组杆粒的DNA转染昆虫细胞Sf9,获得与gE基因发生重组的杆状病毒。Western-blot分析及间接免疫荧光试验(IFA)的结果显示,重组杆状病毒在Sf9中表达了分子质量大小约为43ku的gE融合蛋白,该融合蛋白分别与小鼠抗His标签单克隆抗体和小鼠抗BHV 1多克隆抗体发生特异性结合,表明获得的gE融合蛋白具有良好的免疫反应性。本研究为进一步获得高特异性的诊断抗原奠定了基础。     

番鸭呼肠孤病毒σC编码基因在sf-9昆虫细胞中的表达

采用RT-PCR方法扩增了番鸭呼肠孤病毒S14株σC蛋白编码基因,将其克隆到pFastBacHTA载体上,经酶切鉴定及测序,筛选出阳性重组载体pFastBacHTA-σC;将pFastBacHTA-σC转化到DH10Bac感受态细胞中,通过蓝白斑和PCR筛选,获得重组转座子rBacmid-σC。在脂质体介导下将rBacmid-σC转染sf-9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBV-σC;SDS-PAGE和Western-blot分析表明,在sf-9细胞中表达了分子质量约37 ku的σC蛋白,该蛋白能与原核表达的σC蛋白免疫小鼠血清发生特异性免疫反应,这为以表达的σC蛋白为抗原的亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

表达猪圆环病毒2型SH1分离株Cap蛋白的重组杆状病毒的构建与鉴定

通过PCR方法扩增完整的猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因,随后将其克隆到Bac-to-Bac杆状病毒表达系统pFastBacTMHTB载体中,将筛选获得的阳性重组质粒pF-Cap转化至含有杆状病毒穿梭载体的DH10Bac感受态大肠杆菌中,经蓝白菌落筛选和PCR鉴定,获得重组表达载体rBac-Cap。在脂质体介导下转染处于对数生长期的Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rAc-Cap。Western-blot和间接免疫荧光试验结果表明,成功构建了表达PCV2Cap蛋白的重组杆状病毒,表达的蛋白具有良好的反应原性,这为进一步研究Cap蛋白的功能及免疫学特性奠定了基础。     

PRRSV中和表位串联Fc分子的表达与免疫原性鉴定

为融合表达猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）中和表位和Fc分子,首先合成PRRSVGP3和GP5的串联B细胞中和表位与鼠Ig G1-Fc的m Fc-GP35-Bp基因片段,将其克隆到pFastBac载体上,构建重组质粒pFastBac-m Fc-GP35-Bp,经蓝白斑筛选出重组杆粒Bacmid-m Fc-GP35-Bp,并转染昆虫Sf9细胞,获得重组杆状病毒rBV-m Fc-GP35-Bp。通过Western-blot分析重组蛋白的反应原性,免疫小鼠后,通过间接ELISA检验其免疫原性,病毒中和试验检测中和抗体水平。结果显示,m Fc-GP35-Bp蛋白在昆虫Sf9细胞中获得表达,且可分泌至上清;用m Fc-GP35-Bp蛋白免疫小鼠后,ELISA测定抗体效价可达1∶100 000,三免后第4周仍可检测到较高抗体水平;中和抗体效价介于1∶40和1∶80之间。结果表明,表达的重组m Fc-GP35-Bp蛋白具有良好的反应原性和免疫原性,可刺激机体产生中和抗体,与Fc分子融合表达延长了抗体在血清中存在的时间,本试验为PRRSV中和表位疫苗的研发奠定了基础。     

PRRSV GP3蛋白和PCV-2Cap蛋白在杆状病毒囊膜表面的共展示及展示蛋白的小鼠免疫试验

为了研制以杆状病毒表面展示系统为基础的猪繁殖与呼吸综合征和猪圆环病毒病双价基因工程亚单位疫苗,利用杆状病毒表面展示技术构建展示猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP3蛋白和猪圆环病毒2型(PCV-2)Cap蛋白的重组杆状病毒BacSC-Dual-ORF3-ORF2,并对该重组病毒进行Western-blot分析、激光共聚焦显微镜观察、免疫金电子显微镜检测、动物免疫试验、血清中和试验以及淋巴细胞增殖试验。结果显示,重组杆状病毒表达了重组GP3蛋白和Cap蛋白;该重组杆状病毒感染昆虫细胞Sf-9后在细胞膜上展示了重组GP3蛋白和Cap蛋白,并且重组蛋白展示在杆状病毒囊膜上。动物免疫试验表明,重组杆状病毒免疫小鼠产生了抗PRRSV和抗PCV-2的特异性抗体,免疫小鼠血清中抗PRRSV和抗PCV-2的中和抗体效价分别达到1∶9.6和1∶13.6。淋巴细胞增殖试验表明,该重组杆状病毒能诱发较强的细胞免疫应答。结果表明,表面展示PRRSV GP3蛋白和PCV-2Cap蛋白的重组杆状病毒已构建成功,这为下一步应用该重组杆状病毒作为双价亚单位疫苗预防PRRSV和PCV-2的共感染奠定了基础。     

猪瘟病毒NS3蛋白的重组表达及其单克隆抗体的制备

以含有猪瘟病毒(CSFV)石门株全长cDNA的重组质粒pOKShimen为模板,经PCR扩增获得NS3基因,利用原核表达载体pMAL-c2X、pET32a以及杆状病毒表达载体pFastBacH T B表达CSFV石门株NS3基因,获得3种重组蛋白:MBP-NS3、His-NS3和rNS3。Western-blot分析及间接免疫荧光试验证实,这3种不同载体表达的NS3蛋白均能被猪瘟阳性血清所识别。利用直链淀粉树脂柱对重组蛋白MBP-NS3进行纯化后,用其免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0细胞融合,用间接ELISA筛选,获得2株能稳定传代并分泌针对抗CSFVNS3蛋白单克隆抗体的细胞株,命名为1D10和1H10。Western-blot分析及间接免疫荧光试验结果证明,这2株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体均可识别CSFVNS3蛋白。     

H5N1亚型高致病性禽流感病毒NP基因在昆虫细胞中的表达及其表达产物的生物学活性

根据GenBank上登录的H5N1亚型高致病性禽流感病毒(HPAIV)核蛋白(NP)基因序列设计引物,通过PCR扩增出A/Goose/HLJ/QFY/04(H5N1)毒株的NP基因片段,将其克隆到pFastBacGP67B杆状病毒载体上,将筛选的阳性重组转座载体pFastBacGP67B-NP转化至含有杆状病毒穿梭载体的DH10Bac感受态细胞,经蓝白斑筛选和PCR鉴定,构建了杆状病毒表达载体,获得了重组转座子(rBacmid-NP),在脂质体介导下转染对数生长期的Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒(rBv-NP).SDS-PAGE分析、Westernblotting检测、免疫组化分析和ELISA试验结果表明,分子质量约为54 ku的重组核蛋白得到了高效表达,该表达蛋白具有良好的生物学活性.     

A群猪轮状病毒G5型OSU株VP7基因的克隆及其重组杆状病毒的鉴定

利用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出A群猪轮状病毒(PRV)G5型OSU株长度约为1.0kb的基因片段,将其克隆到pMD 18-T载体上进行测序鉴定,证明为该PRV的VP7蛋白基因,与已发表的该PRV VP7基因序列的同源性为99.8%.将该基因黏端克隆至表达载体PblueBAChisC质粒中,酶切及PCR鉴定表明获得了PRV-VP7蛋白基因与PblueBAChisC质粒的阳性重组子.纯化该重组质粒并与线性杆状病毒DNA分子Bac-N-Blue共转染昆虫细胞sf9,5 d后收获重组病毒.通过对重组杆状病毒DNA分子的酶切及PCR鉴定,确定PRV-VP7基因已正确插入.将经3次蚀斑筛选纯化后的该重组杆状病毒接种于sf9细胞大量增殖后,获得了重组杆状病毒PRV-VP7蛋白的真核表达.     

猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2融合基因在重组杆状病毒中的表达

将猪细小病毒分离株LJL12 VP2基因和猪瘟病毒多肽基因E290克隆至真核表达载体pMel Ba-cA,将该重组质粒与Bac-N-Blue DNA共转染昆虫细胞,并对表达产物进行分析,构建了表达猪瘟病毒T细胞表位和猪细小病毒VP2融合蛋白的重组杆状病毒。结果显示,获得了含VP2基因和E290基因的重组质粒pM-VP2-E290,昆虫细胞sf9的表达产物经SDS-PAGE、Western-blot检测后确定所表达的蛋白质分子质量大小约为67 ku,且具有天然蛋白的抗原特性。免疫电镜观察可见表达产物形成的病毒样颗粒。证实,成功构建了同时含有PPV VP2基因和CSFV特异性T细胞表位基因的重组杆状病毒,并在昆虫细胞中得到了高效表达。     

蓝舌病毒1型VP2基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达

为了研制蓝舌病新型亚单位疫苗,将蓝舌病毒1型(BTV1)VP2基因克隆到pFastBacHTB载体中,得到重组转座载体pVP2,并转化至DH10Bac感受态细胞,获得了重组杆粒rVP2。然后采用脂质体转染法转染Sf9昆虫细胞,通过克隆筛选获得重组杆状病毒。SDS-PAGE分析结果显示,获得了约110ku的表达产物,与预期结果相符。Western-blot结果显示,目的蛋白能被BTV1感染的山羊阳性血清识别。结果表明,经杆状病毒体系表达的可溶性重组VP2蛋白具有良好的反应原性,为进行蓝舌病新型亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

蓝舌病病毒NS3蛋白的截短表达及其多克隆抗体制备

首先利用RT-PCR技术扩增获得了蓝舌病病毒1型(BTV1)NS3基因的截短片段,将其克隆至表达载体pET-30a中,构建重组表达质粒pET-NS3,转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞后用IPTG诱导表达,可溶性分析显示,重组NS3蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式表达。纯化重组表达的NS3蛋白,免疫新西兰白兔制备抗NS3蛋白的多克隆抗体,利用免疫印迹和细胞免疫荧光试验检测该抗体的特异性及NS3蛋白在BTV感染细胞内的分布。结果显示,制备的抗NS3多克隆抗体不仅可与重组表达的NS3蛋白反应,而且可与BTV1感染细胞中的天然NS3/NS3A蛋白发生特异性反应;在BTV1感染的BHK21细胞以及KC细胞中均检测到了NS3/NS3A蛋白的特异性表达,且分布于整个细胞质中。本研究成功表达了BTV重组NS3蛋白并制备了相应的特异性抗体,为进一步研究NS3蛋白的特性和功能奠定了基础。     

禽网状内皮组织增生病病毒gp90基因在杆状病毒中的表达及其产物的活性分析

以质粒pMD18T-env为模板,利用PCR技术扩增禽网状内皮组织增生病病毒的gp90基因,酶切、纯化后,克隆至载体pFastBacHTA中,构建了重组供体载体pFgp90,并将其转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,使gp90基因整合到Bacmid穿梭载体中,获得重组穿梭载体Bacmidgp90.通过脂质体介导将其转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBacgp90.抗gp90蛋白小鼠超免疫血清介导的Western-blot分析和间接免疫荧光试验(IFA)结果显示,gp90蛋白被正确表达,分子质量约为45 ku;gp90蛋白在变性和自然状态下均能够被识别,具有良好的生物活性.     

H3N8亚型马流感病毒VLPs的构建及其生物学特性分析

为了构建含H3N8亚型马流感病毒HA蛋白和M1蛋白的病毒样颗粒疫苗,把A/equine/Xinjiang/3/2007(H3N8)的HA基因和M1基因克隆到杆状病毒穿梭载体pFastBac Dual中,将得到的重组穿梭质粒pFBD-XJ3HA-M1转化至DH10Bac感受态细胞,与杆状病毒骨架质粒Bacmid进行重组从而获得重组杆状病毒转座子rBac-XJ3HA-M1,然后将其转染Sf9昆虫细胞,包装重组杆状病毒rBV-XJ3HA-M1。通过PCR鉴定、细胞免疫组织化学试验、Western-blot分析以及血凝试验证明,HA蛋白和M1蛋白在昆虫细胞中能够有效表达,且表达产物具有良好的反应活性,表达的HA蛋白具有血凝活性。电镜观察发现,HA蛋白和M1蛋白能够稳定形成病毒样颗粒。上述研究结果为研制马流感亚单位疫苗提供了技术储备,也为马流感病毒蛋白的功能研究奠定了基础。     

猪细小病毒AV30 VP2基因在昆虫细胞中表达及其免疫原性鉴定

本研究选用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统构建含有猪细小病毒AV30未优化、优化后衣壳蛋白VP2基因的重组杆状病毒,感染sf9、HF细胞表达VP2蛋白。首先,扩增PPV AV30得到VP2基因,测序后由公司根据昆虫细胞嗜性进行基因优化。同时构建并收获未优化、优化重组杆状病毒r BacVP2。其感染HF细胞后,进行Western-blot及IFA实验分析表明,未优化、优化VP2蛋白在昆虫细胞中正确表达,分子质量约为64 ku,并具有良好的反应原性。电镜观察,未优化、优化VP2蛋白均自我组装成VLP,与PPV AV30病毒粒子大小形状相似。最后,用VP2-VLP免疫BALB/c小鼠,能刺激小鼠产生抗PPV的特异性抗体。免疫后的小鼠脾脏淋巴细胞在PPV AV30病毒的刺激后,出现显著的增殖情况,同时产生了Th1和Th2型相关细胞因子。本研究成功构建了VP2-VLP,并在小鼠实验中显示了良好的免疫效果,为以VP2为表位载体的嵌合型病毒样颗粒疫苗进一步研制奠定了基础。     

山羊地方性鼻内肿瘤病毒SU蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

为获得纯化的山羊地方性鼻内肿瘤病毒(enzootic nasal tumor virus of goats,ENTV)表面蛋白(surface protein,SU protein)和抗SU蛋白的多克隆抗体,根据Gen Bank已登录的ENTV Shaanxi株SU基因序列,设计合成1对特异性引物,PCR扩增SU基因并将其连接于原核表达载体p ET-28a(+)中,构建重组质粒p ET-28a-SU,经鉴定正确后转化大肠杆菌Rosetta(DE3)株进行诱导表达,并进行SDS-PAGE分析。重组菌经IPTG诱导后成功表达出分子质量为43 ku的重组蛋白。将诱导表达的蛋白经镍柱亲和层析纯化、复性后免疫小鼠制备多克隆抗体。Western-blot分析结果表明,原核表达纯化的SU蛋白能够与制得的小鼠抗SU蛋白多克隆抗体特异性结合。上述结果表明,本试验成功获得了纯化的ENTV SU蛋白和小鼠抗ENTV SU蛋白的多克隆抗体,为进一步研究SU蛋白在ENTV感染过程中的作用和建立诊断方法提供了材料。     

番鸭呼肠孤病毒σNS蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

为制备番鸭呼肠孤病毒(MDRV)YB株σNS蛋白的多克隆抗体,首先经RT-PCR扩增了σNS基因的完整编码序列,并成功构建了重组表达质粒pET-YB-σNS。将其转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后,SDS-PAGE显示成功高效表达出分子质量约为58ku的融合蛋白。该融合蛋白以包涵体和可溶性蛋白两种形式存在,表达时的最佳诱导时间、IPTG诱导浓度、诱导温度分别为4h、1mmol/L和37℃。通过对包涵体和可溶性蛋白进行尿素洗涤纯化和(或)Ni 2+柱亲和层析纯化,得到了高纯度的重组蛋白。分别对纯化前、后的重组蛋白进行Western-blot分析,结果显示两者均可以与MDRV阳性血清发生特异性反应,表明它们具备良好的反应原性。将纯化后的可溶性σNS蛋白免疫家兔,制备的多克隆抗体ELISA效价达1∶32 000。上述研究结果为后续MDRVσNS蛋白功能研究奠定了基础。