家兔脑炎原虫性脑肉芽肿形成与PLCγ/PKC信号转导通路的关系

为了研究家兔脑炎原虫性脑肉芽肿形成与PLCγ/PKC信号转导通路的关系,以及星形胶质细胞的标志性蛋白-胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,应用普通染色、特殊染色、免疫组织化学技术和Westernblot技术分别对脑炎原虫性脑组织病变进行了观察,并分析了脑炎原虫性脑肉芽肿形成与PLCγ/PKC信号转导通路关键性蛋白的关系,以及GFAP在增生性星状胶质细胞中表达。结果显示,所有患病家兔的脑组织中均有数量不等的脑肉芽肿和非化脓性脑炎变化;免疫组化染色显示,成纤维细胞生长因子(FGF)、磷酯酶Cγ(PLCγ)、磷酸化的磷酯酶Cγ(P-PLCγ)和蛋白激酶C(PKC)的表达在肉芽肿的星形胶质细胞、血管内皮细胞和成纤维细胞中明显增高,呈强阳性反应。GFAP仅在星形胶质细胞中表达,特别是增生性星形胶质细胞呈强阳性反应,被染成深棕色。用Western-blot检测,患病家兔脑组织中的FGF、PLCγ、P-PLCγ和PKC信号转导通路的关键性蛋白的表达丰度明显高于健康家兔;患病家兔脑组织中星形胶质中GFAP的表达也明显高于健康家兔。结果表明,PLCγ/PKC信号转导通路通过强大的级联反应参与了家兔脑炎原虫性脑肉芽肿的形成,GFAP在星形胶质细胞中大量表达,是脑肉芽肿中星形胶质细胞增殖的物质基础,是增生性基因被激活的表现。     

ERK信号转导通路对家兔脑炎原虫性脑肉芽肿形成的影响

为了探讨ERK信号转导通路对脑炎原虫性脑肉芽肿形成的影响,应用普通染色、特殊染色、免疫组织化学技术和Western-blot技术分别对脑炎原虫性脑肉芽肿进行观察,分析脑炎原虫性脑肉芽肿形成与信号转导通路中神经生长因子(NGF)、酪氨酸蛋白激酶(TPK)、丝裂源活化蛋白激酶(MAPK)和细胞外信号调节激酶(ERK)等四种关键性蛋白的关系。结果显示,所有患病家兔的脑组织中均有数量不等的脑肉芽肿和非化脓性脑炎变化;免疫组化染色显示,NGF、TPK、MAPK和ERK的表达在肉芽肿中的星形胶质细胞、血管内皮细胞和成纤维细胞中明显增高,呈强阳性反应,染成深棕色;用Western-blot检测,患病家兔脑组织中的NGF、TPK、MAPK和ERK等信号转导通路关键蛋白表丰度明显高于健康家兔。以上结果表明,ERK信号转导通路通过强大的级联反应参与了家兔脑炎原虫性脑肉芽肿的形成,在脑肉芽肿形成过程中促进星形胶质细胞、血管内皮细胞和成纤维细胞增殖。     

兔脑炎原虫病快速诊断的临床病理学研究

为了在临床上能快速检出兔脑炎原虫,尽快诊断兔脑炎原虫病,对病兔进行了尿沉渣涂片的特殊染色、尿沉渣透射电镜的负染色、肾触片的特殊染色和肾病理组织学切片的比较观察。就尿沉渣涂片和肾触片的特殊染色而言,经光学显微镜检查,可从涂片和触片上的肾小管上皮细胞内检出兔脑炎原虫及其假囊,据此可对兔脑炎原虫病做出快速诊断。而对尿沉渣透射电镜的负染色和肾病理组织切片的检查,可与尿沉渣涂片检查结果相互印证,使临床诊断更加准确。结果表明,尿沉渣涂片和肾触片的特殊染色是临床上用于诊断兔脑炎原虫病的一种快速、准确和简便的新方法。     

脑炎原虫病兔血液中几种免疫指标的检测

为了调查脑炎原虫病兔血液中几种免疫指标的变化,采用E-玫瑰花环试验、流式细胞仪检测、间接ELISA试验和双向免疫琼脂扩散试验对12只病兔和12只对照兔血液中的T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞和IgG进行了测定。结果显示,脑炎原虫病兔与对照兔相比,E-玫瑰花环形成率增高,CD4+T细胞没有明显变化,但CD8+T细胞明显增多,CD4+/CD8+T细胞的比值变小,血液中IgG含量增高,双向免疫琼脂扩散时形成沉淀线的抗体稀释倍数增大。据此认为,脑炎原虫病兔的体液免疫和细胞免疫均增强,但以细胞免疫为主,CD4+/CD8+T细胞的比值变小可能与兔脑炎原虫所引起的隐性或慢性感染有关。     

兔圆小囊及肠道组织中抗菌肽的免疫组织化学和免疫电镜细胞化学定位

采用免疫组织化学和免疫电镜细胞化学技术观察了兔圆小囊及其他肠道组织中产抗菌肽细胞的分布定位.免疫组织化学观察发现,产抗菌肽细胞在兔圆小囊的黏膜上皮、圆顶上皮以及淋巴组织的滤泡生发中心、圆顶区和帽区均有分布;在兔感染多杀性巴氏杆菌后,圆小囊及其他肠道组织中的抗菌肽免疫组织化学阳性细胞数量明显增多,阳性反应增强.免疫电镜细胞化学观察结果显示,除肠道黏膜上皮细胞、异嗜性白细胞、巨噬细胞中存在抗茵肽免疫组织化学阳性反应信号外,在淋巴细胞内也发现阳性反应信号,尤其是在圆小囊淋巴组织中的DNES细胞内发现抗菌肽免疫组织化学阳性反应信号.表明圆小囊的DNES细胞和淋巴细胞均可产生抗菌肽.     

17β-雌二醇对海马组织结构和GFAP表达的影响

为研究17β-雌二醇对脑的保护作用机制,以去卵巢大鼠为动物模型,采用甲苯胺蓝染色、免疫组织化学染色和透射电镜技术,观察了17β-雌二醇对海马组织结构和胶质纤维酸性蛋白表达的影响。结果显示:①与对照组、假手术组和去卵巢后补充雌激素组比较,在去卵巢组中,海马CA1～3区、齿状回神经元数量显著减少(P<0.05),CA4区神经元数量减少不显著(P>0.05);海马CA1～4区、齿状回星形胶质细胞数量增加不显著(P>0.05);海马CA1～4区、齿状回胶质纤维酸性蛋白表达增加,除CA4区与去卵巢后补充雌激素组之间无显著差异外(P>0.05),其余均差异显著(P<0.05);海马CA1区神经元、胶质细胞线粒体肿胀,神经元突触和突触囊泡减少,轴突变性;②与去卵巢组比较,去卵巢后补充雌激素组海马CA1～3区、齿状回神经元数量明显增加(P<0.05);海马CA1～4区、齿状回星形胶质细胞数量减少不显著(P>0.05);海马CA1～3区、齿状回胶质纤维酸性蛋白表达显著降低(P<0.05);保持了海马CA1区神经元和胶质细胞超微结构的正常。结果表明,17β-雌二醇能通过增加神经元数量,降低星形胶质细胞胶质纤维酸性蛋白表达,保持神经元和胶质细胞正常的超微结构,实现对海马的保护。     

犬眼睑鳞状上皮细胞癌的组织病理学诊断

对一例自然患病犬眼睑增生组织进行组织病理学观察,以确定增生组织的病理学类型。对病犬进行血常规及生化检查,取手术切除增生组织标本,经福尔马林溶液固定后,进行常规石蜡包埋、切片、HE染色、SABC法免疫组织化学试验,并利用NIS-Elements高清晰度彩色图文分析系统记录观察结果。结果显示,血常规及生化检查白细胞浓度偏高;HE染色镜检,可在增生组织内见到明显的角化珠和细胞间桥。免疫组织化学检测结果显示,细胞角蛋白、上皮膜抗原、S-100蛋白均为阳性。结果表明,该眼睑增生组织为鳞状上皮细胞癌。     

犬五种典型肿瘤的病理学诊断

本研究分别对5例犬类恶性肿瘤进行病理学分析。通过石蜡切片的HE染色及免疫组织化学方法进行病理学诊断及分析。疑似甲状腺癌病犬的病理组织学观察发现甲状腺癌细胞的体积比正常细胞大,存在包膜和血管侵犯。免疫组织化学结果显示TG、Galectin-3阳性,而CT呈免疫阴性,判定肿瘤内甲状腺滤泡癌;疑似恶性神经鞘瘤病犬的病理组织学观察神经组织可见波浪状,梭形细胞界限不清浅染,核细长间深染。免疫组织化学结果显示S-100、波形蛋白、GFAP、NSE和巢蛋白呈较强阳性表达,确诊为恶性外周性神经鞘瘤;疑似脑膜瘤病犬的病理组织学观察发现,脑膜瘤右叶硬膜下增厚,出现巨细胞,核异形、深染,发现小型结节有钙化斑,PSA染色阳性。免疫组织化学结果显示Vim呈较弱阳性表达,S-100呈阳性表达,结蛋白阴性,最后确诊为脑膜瘤(颗粒细胞型);疑似甲状腺癌病犬的病理组织学观察发现甲苯胺蓝染色后呈阴性且CD117、HLA-DR呈阳性表达,初步诊断为造血细胞源性恶性肿瘤;疑似肾母细胞瘤病犬的病理组织学观察发现肺转移组织发现类似胚胎肾小球、肾小管组织。GFAP、NF阴性表达,CD10、CK、Vim和SMA为阳性表达,确诊为肾母细胞瘤。     

绵羊胎盘滋养层细胞的体外培养与鉴定

为建立一种稳定、方便地获得较高纯度的绵羊绒毛膜滋养层细胞的方法,为后续的细胞转染和RNA干扰试验提供细胞学基础,采用组织块法培养滋养层细胞,消化差速法纯化细胞,相差显微镜观察滋养层细胞的形态学特点,应用常规HE染色和免疫组织化学染色、透射电镜及PCR技术鉴定细胞来源。结果显示,倒置相差显微镜下,可见细胞为上皮样细胞形态,呈片状铺展生长。免疫组织化学染色显示,细胞角蛋白染色阳性细胞占90%以上,波形蛋白染色呈阴性;透射电镜可观察到滋养层细胞所特有的结构;台盼蓝排斥试验检测细胞活力,存活率超过95%,细胞活力良好。常规RT-PCR技术可扩增出滋养层细胞所分泌的特有的干扰素蛋白-1基因片段。证实该方法可以有效获得较高纯度的、具有生物学活性的绵羊绒毛膜滋养层细胞,为本实验室后续的体外研究提供试验基础。     

旋毛虫HSP70基因的原核表达及其免疫原性

利用RT-PCR方法扩增旋毛虫HSP70基因,将其扩增产物克隆到pEASY-Blunt Simple载体中,经限制性酶切后与pET-28a(+)载体连接,进一步转化至感受态细胞Transetta(DE3)中,用IPTG诱导表达重组旋毛虫HSP70。以纯化的重组HSP70制备多克隆抗体,并对HSP70进行免疫印迹分析及免疫组织化学染色。结果表明,重组质粒的鉴定和DNA测序均正确;SDS-PAGE和Western-blot分析结果显示,在70ku处获得一目的条带;免疫组织化学染色结果显示,该HSP70具有很好的免疫原性。证实,成功构建了重组表达质粒pET28a-HSP70,为深入研究旋毛虫HSP70的功能奠定了基础。     

胚兔牙板发育的形态学观察

用光镜、电镜及特殊染色方法 ,对胚兔 15～ 2 5日龄的胚胎发育阶段牙板 (dentallaminae ,DL)进行形态学观察 ,表明胚兔在发育过程中DL来源于外胚层衍化的上皮 ,在可能发生牙齿部位 ,外胚、间充质这些细胞的相互作用 (胚胎诱导 ) ,为DL发生创造条件 ,使口腔黏膜上皮向间充质组织增生的DL形成牙胚 ;在牙胚形成的过程中 ,DL的牙源性上皮细胞存在着增生与凋亡 ,以调控牙胚发育生理性的稳定及牙齿的数目、形态的异常 ,进一步表明胚兔DL在发育过程中存在着形成牙齿遗传的潜能及细胞凋亡现象 ,为研究人类DL形成、分化、结构及颌骨内牙源性肿瘤和牙畸形提供动物模型。     

犬肝细胞肝癌和猫胆管型肝癌的病理组织学诊断

采用2015版W H O肝癌组织学分类方法,对临床上犬和猫的肝癌进行病理学分析。通过石蜡切片的常规染色(HE染色)及免疫组织化学方法进行组织学鉴定。犬的病理学检查结果为肝脏组织的外部多处坏死出血与肝硬化。我们进一步应用HE染色的方法对肝组织进行染色,观察到其病理改变为细胞有异型,3层的细胞排列成柱状,梁索状和腺泡状,细胞异型性明显,核仁显著,最后确诊为为肝细胞癌。猫的病理学检查结果为胆管上的肥大部分,胆管的纤维组织显著增加,是狭窄胆管胞膛,黏膜红色。在狭窄的部位,胆管扩张。胆管上皮增生管状腺,纤维增加,淋巴细胞浸润。胃、十二指肠、结肠黏膜固有层淋巴细胞浸润,纤维分生固有层淋巴细胞浸润。最后确诊为肝胆管癌。     

不同免疫途径对蛋用鸡分泌型免疫球蛋白A细胞分布的影响

用鸡新城疫弱毒疫苗通过饮水、滴鼻和肌肉注射免疫蛋用鸡，以葡萄球菌Ａ蛋白辣根过氧化酶和兔抗鸡分泌型免疫球蛋白Ａ（ＳＩｇＡ）间接组织化学染色，显示消化道相关淋巴组织（ＧＡＬＴ）和呼吸道相关淋巴组织（ＲＡＬＴ）中ＳＩｇＡ细胞的生成及分布。结果表明，滴鼻和饮水免疫组蛋用鸡ＧＡＬＴ和ＲＡＬＴ中产生ＳＩｇＡ细胞较早且多，并于首免后２８ｄ达最高峰，一直持续到首免后５６ｄ。肌肉注射组蛋用鸡ＳＩｇＡ细胞在各相应部位数量较少，且持续时间较短。     

乳牛流产胎儿中新孢子虫的鉴定

在血清学调查的基础上,进行了流产胎牛体内新孢子虫的鉴定。取新孢子虫血清抗体阳性乳牛的流产胎牛的脑、心、肺、脾、肝等组织进行病理学检查,经HE染色观察到脑组织中存在类似于新孢子虫包囊样结构,经免疫组织化学染色排除刚地弓形虫包囊的存在,确认该包囊为新孢子虫包囊。同时提取流产胎牛脑组织DNA,应用新孢子虫特异性引物Np6/Np21进行PCR扩增,扩增出的特异性目的条带的序列与新孢子虫标准株Nc-1的gene 5序列的一致性为98%。首次证实我国大陆流产胎牛脑组织中存在新孢子虫。     

H3N8亚型马流感病毒人工感染马的病理学观察及抗原定位

为验证鸡胚传代对H3N8亚型马流感病毒致病性的影响,利用F3代马流感病毒经鼻腔感染2匹蒙古马,应用苏木素-伊红染色和免疫组织化学染色方法,对1例临床症状明显的马进行了病理组织学观察和抗原定位。结果表明,该人工感染马镜检病变明显,鼻黏膜、气管、肺、心肌、肝、肾和脾等组织器官均出现不同程度的充血、淤血、水肿,并伴以各实质细胞的变性、坏死以及炎性细胞的渗出和增生。其中呼吸系统病变最为严重,肺表现为支气管性间质性肺炎。免疫组织化学染色结果显示,病毒抗原主要存在于呼吸系统的黏膜上皮组织中,初步证明了马流感病毒F3代对马具有致病性。     

樱桃谷鸭心肌细胞的分离培养与传代研究

为寻找一种经济、可重复的鸭心肌细胞最适培养技术,利用胰蛋白酶消化法和差速贴壁法分离樱桃谷鸭心肌细胞,并对培养条件和生长特性进行摸索。用台盼蓝染色法检测培养细胞的活性,用HE染色法检测培养细胞的形态,并用抗α-actin蛋白免疫组织化学染色法鉴定培养的心肌细胞。结果表明,通过差速贴壁法分离的心肌细胞在前3代可观察到节律性搏动,α-actin染色阳性,心肌细胞数量较大,活力高,形态呈梭形、星形和多角形。证实,通过酶消化法和差速贴壁法分离到的鸭心肌细胞,可连续传代至12代,细胞纯度及数量能满足心肌细胞研究的需要,为一种可行的鸭心肌细胞培养方法。     

一株猪源脑心肌炎病毒的分离与鉴定

将江苏省某规模化猪场疑似脑心肌炎仔猪病料接种BHK-21细胞,并采用间接免疫荧光试验(IFA)、基因序列测定和动物人工感染试验进行鉴定,结果显示,BHK-21细胞接种病料样品后盲传3代出现细胞病变,病毒TCID50为10-9.2/mL;用脑心肌炎病毒(EMCV)单克隆抗体-IFA检测,在感染细胞的胞浆中可见特异性荧光;分离物的PCR扩增产物的基因序列与GenBank中的EMCV VP1基因的同源性为85.7%~99.8%;BALB/c小鼠人工感染该分离株后出现明显的临床症状和EMCV的典型病理变化,免疫组织化学试验证明,试验鼠脑组织中含有EMCV抗原,商品仔猪人工感染后未出现明显的临床症状及病理变化,证明该分离病毒为EMCV(NJ08株),且对BALB/c小鼠具有较强的致病作用。     

急性犬瘟热伴发寄生性肠炎的病理形态学观察

为从病理学方面调查急性犬瘟热与寄生性肠炎的关系,通过免疫组织化学、苏木精伊红和过碘酸雪夫氏染色等方法,对12例急性犬瘟热伴发腹泻的病例进行了病理组织学研究。结果表明,6例腹泻主要是由球虫引起的,2例由隐孢子虫所致。犬球虫主要存在于病犬的空肠和回肠黏膜的上皮细胞内,在脱落的肠上皮细胞和被破坏的肠绒毛所形成的黏液内,也能检出大量的球虫。最常见的球虫形态为滋养体和裂殖体,滋养体多位于上皮细胞内或细胞间,断面呈不整圆形,核位于中央,被苏木精深染,原生质淡染呈细网状,质膜明显;裂殖体多呈不整圆形,内有香蕉状的裂殖子,位于变性的肠上皮细胞内,含有较多的糖原颗粒,用过碘酸雪夫氏染色时呈红色。隐孢子虫主要位于肠上皮细胞和肠腺上皮细胞的纹状缘,引起微绒毛破坏和细胞脱落。用抗犬瘟热病毒核衣壳蛋白单抗染色检查,小肠黏膜上皮细胞、隐窝的腺上皮细胞、浸润在肠黏膜固有层的淋巴细胞、巨噬细胞和集合淋巴结的树突状细胞均呈强阳性反应。据此认为急性犬瘟热的寄生性腹泻是在犬瘟热病毒引起肠黏膜抵抗力降低的基础上发生的。     

昆明屠宰猪戊型肝炎病毒感染情况的调查

为了解云南省昆明市屠宰猪戊型肝炎病毒(HEV)感染情况,对68份从农贸市场和屠宰场采集的猪肝样品,应用免疫组织化学染色、RT-PCR分别对HEV的抗原和核酸进行了检测,并对肝样品进行了组织病理学观察。免疫组织化学染色结果表明,83.8%(57/68)的肝呈HEV抗原阳性。组织病理学观察发现,47.1%的肝组织出现炎性细胞浸润,22.1%的肝出现肝细胞变性、坏死,20.6%出现肝细胞萎缩。Mal-lory三色染色法染色结果显示,有25%的猪肝存在不同程度的结缔组织增生。RT-PCR结果显示,有1份肝呈HEV核酸阳性,阳性率为1.5%。进化分析表明,这株病毒属4b基因亚型,与广西猪源、越南人源毒株的同源性最高,证实HEV的流行具有地理分布的特征。     

猪瘟兔化弱毒牛肾细胞疫苗的研究——牛肾细胞培养及其生物学性状的观察

用牛肾上皮细胞培养猪瘟兔化弱毒,生长繁殖良好,并不断从细胞中释放出来,猪瘟兔化弱毒在牛肾细胞上培养,不引起肉眼可见病变,用免疫荧光法可在接毒后6小时从胞浆中发现特异性荧光,接毒后18小时,可用家兔在细胞培养物中检出病毒。用带毒细胞传代,能促进兔毒在牛肾细胞上的适应能力,细胞传代后经3个多月培养,其间多次换液,不接毒,细胞收液的病毒滴度可稳定的达到1:20000,用盖玻片作带毒传代细胞单层培养,用姬姆萨染色镜检,可在许多细胞浆中发现原生小体样紫色颗粒,用H·E染色,可在胞浆中发现嗜伊红包涵体样颗粒,初步认为猪瘟兔化弱毒在牛肾细胞上培养,可产生包涵体。用牛肾细胞大瓶旋转培养猪瘟兔化弱毒,能生产疫苗,并可多次接毒、收毒,收毒次数达20余次,疫苗毒价可达1:50000,少数批次可达1:100000,对猪有良好免疫力,本试验1987年10月在云南生药厂已完成中试生产,先后冻干疫苗5批,一次效检50000倍合格的占80％,20000倍合格的占20％,各项检验指标符合规程要求,区域试验注射各种猪只40000余头,证明安全有效,疫苗在-18～-20℃保存1年,未见毒价下降。