猪伪狂犬病病毒野毒株与疫苗株荧光定量PCR检测方法的建立和应用

根据伪狂犬病病毒gD、gE基因序列设计2对引物及其对应的探针,通过对引物、探针浓度的优化,建立了猪伪狂犬病病毒野毒和减毒活疫苗株荧光定量PCR检测鉴别方法,并评价其特异性、敏感性和重复性。结果显示,猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪流行性乙型脑炎病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪博卡病毒、猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒均无扩增曲线。野毒株均出现gD和gE基因扩增曲线,而疫苗株只出现了gD基因扩增曲线,表明该检测方法具有良好的特异性。建立的gD和gE基因标准曲线Ct值和模板终浓度在1×108～1×10 copies/μL范围内均具有良好的线性关系,灵敏度均可达1×10 copies/μL。对39份猪组织样品进行检测,荧光定量PCR检出5份样品猪伪狂犬病病毒gD、gE阳性,表明这5份猪组织样品为猪伪狂犬病病毒野毒感染。常规PCR检出5份猪伪狂犬病病毒阳性,经测序为野毒感染,2种方法符合率为100%。本研究建立的荧光定量PCR可用于猪伪狂犬病病毒的快速检测和流行病学调查。     

猪伪狂犬病病毒MQ18变异株的分离鉴定

为了解福建省猪伪狂犬病病毒(PRV)野毒株的病原学特性及分子遗传变异情况,本研究用羊胚胎鼻甲细胞(OFTu)从疑似暴发伪狂犬病猪场死亡的育肥猪中分离到1株病毒,该病毒能够产生典型的PRV细胞病变,病毒液接种小鼠(0.1 mL/只)及成年兔(0.5 mL/只)在48～60 h死亡,均表现出典型的伪狂犬病症状。经PCR试验、电镜观察及特异性血清间接免疫荧光试验鉴定为伪狂犬病病毒,命名为MQ18株;并对其进行病毒效价的测定及gC、gE基因核苷酸和氨基酸序列差异性分析。结果显示,分离株TCID50为10~(-7.71)/0.1 mL;将其gC和gE基因序列与国内外17个PRV参考毒株进行同源性比较,核苷酸序列同源性分别为93.5%～99.9%和97.8%～100%,氨基酸序列同源性分别为88.7%～99.8%和95.7%～100%;分子遗传进化树分析显示,gC和gE基因均与国内近6年分离的PRV变异株集聚在一起,属于同一个进化分支;与经典株相比,gC基因编码的氨基酸序列在第63～69位有1个AAASTPA的连续7个氨基酸插入,gE基因编码的氨基酸序列分别在第48位和第496位有1个天冬氨酸(D)的插入,与PRV变异株变异位点相一致。以上结果证实,从发病猪群中分离到1株PRV变异株,本研究结果为选择合适疫苗来防控猪伪狂犬病以及病原学研究提供了参考。     

猪流行性腹泻病毒变异毒株与经典毒株RT-PCR鉴别检测方法的建立及应用

为建立猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异毒株的快速RT-PCR检测方法,根据GenBank中PEDV S基因序列设计合成1对特异性扩增引物,通过优化反应条件,建立了检测PEDV变异毒株的RT-PCR方法。结果显示,建立的RT-PCR鉴别检测方法能特异性区分疫苗株CV777和PEDV变异毒株,仅能扩增出PEDV变异毒株826bp的目的片段,与猪传染性胃肠炎病毒、A群猪轮状病毒、猪嵴病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪瘟病毒及猪细小病毒均无交叉反应。敏感性试验结果显示,该方法能检测到的最低核酸质量为11.3pg。利用该方法对采集自广西部分地区的123份临床腹泻样品进行检测,临床腹泻样品中PEDV阳性率为67.5%,变异毒株占总PEDV毒株的86.7%(72/83)。结果表明,该RT-PCR鉴别诊断方法特异性强、灵敏度高、操作简单,为猪流行性腹泻的流行病学及病原诊断研究提供了可供借鉴的技术手段。     

伪狂犬病病毒野毒株与疫苗株的实时荧光定量PCR鉴别方法的建立

针对伪狂犬病病毒疫苗株基因组缺失的3.5kb片段,设计3套引物和探针,并用标准的伪狂犬病病毒野毒株和疫苗毒株进行测试,建立了一种新的快速鉴别伪狂犬病病毒野毒株和疫苗株的实时荧光定量PCR方法。该方法的检测极限可达10copies/μL,并与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒等不存在交叉反应现象,批内和批间重复性试验的变异系数分别为1.70%±1.07%和2.22%±1.02%,显示该方法具有良好的重复性。在对临床20份样品的检测时,该荧光定量PCR的阳性率为60%,普通PCR的阳性率仅为40%。结果表明,该方法具有特异性高、敏感性强的特点,是一种值得推广的快速诊断技术,可用于猪伪狂犬病的诊断和流行病学调查等。     

猪伪狂犬病病毒FJNP株的分离鉴定

从福建省某猪场采集的发病仔猪大脑和内脏病料中分离到一株病毒。病毒接种PK细胞的结果显示,PK细胞出现典型的细胞病变;PCR反应扩增出特异性的片段,与经典毒株闽A株一致;免疫荧光试验中出现绿色荧光;病毒接种家兔后引起典型的伪狂犬病症状并死亡。上述结果充分证实,本研究分离的毒株为伪狂犬病病毒,随之将其命名为伪狂犬病病毒FJNP株。本研究结果丰富了福建省伪狂犬病流行病学资料,为开发猪伪狂犬病病毒新型疫苗提供了依据。     

伪狂犬病病毒野毒株新型可视化环介导等温扩增检测方法的建立

利用环介导等温扩增(LAMP)与pH指示剂结合的方式建立伪狂犬病病毒(PRV)野毒株的快速检测方法,并优化反应体系。结果显示,该方法特异性良好、敏感性较高,检测限达100.5TCID50,与荧光定量PCR的敏感性一致。对52份临床样品进行检测,用荧光定量PCR检测出30份阳性样品,LAMP检测出27份阳性样品,二者的符合率为94.2%。结果表明,PRV野毒株新型可视化LAMP检测方法操作简便、结果判别明显、检测成本低,可预期应用于PRV带毒猪的快速筛查,这对于猪伪狂犬病的净化具有重要意义。     

猪伪狂犬病病毒环介导等温扩增检测方法的建立

针对猪伪狂犬病病毒gE基因保守区域设计并合成了4条引物,建立了伪狂犬病病毒的环介导等温扩增检测方法,并进行了特异性、敏感性和重复性试验。结果显示,该方法可特异性地检测猪伪狂犬病病毒强毒株,不能检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒和猪伪狂犬病病毒gE基因缺失疫苗株;该方法的最低检测量可达100个拷贝质粒DNA,比常规PCR方法的敏感性高10倍。试验表明建立的环介导等温扩增方法具有较高的特异性、敏感性和可重复性,可用于伪狂犬病病毒的快速诊断。     

变异猪伪狂犬病病毒自然感染仔猪的病理组织学研究

为了解伪狂犬病病毒(PRV)变异株对自然感染仔猪的组织病理损伤,对自然感染发病仔猪进行病理剖检、细菌分离、病毒PCR鉴定、病毒分离培养、病毒粒子观察、基因序列分析及病理组织学观察,证实该发病仔猪为典型的PRV病毒变异株感染发病。病理剖检和病理组织学检查结果显示,发病仔猪脑、心脏、肝、脾、肺、肾等主要器官组织可见典型的猪伪狂犬病剖检病变和病理组织学变化。脑实质中小血管扩张充血,大量胶质细胞浸润,形成明显的血管套和噬神经元现象;肝索紊乱、肝细胞坏死;全身免疫器官淋巴细胞减少等。同时发现PRV在发病仔猪全身分布广泛,且组织中病原含量与组织病理损伤程度密切相关。结果表明,自然发病仔猪感染的PRV变异毒株属于强毒株,具有较强的致病性。     

PRRSV高致病性毒株和经典毒株SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR鉴别方法的建立

根据猪生殖与呼吸综合征病毒高致病性毒株、经典毒株Nsp2基因序列的差异,应用Oligo软件设计了2对特异引物,建立了鉴别PRRSV高致病性毒株和经典毒株的SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR方法.用该方法检测JEV、CSFV、FMDV和PRCV均呈阴性,表明该方法特异性良好;敏感性试验结果表明,该方法的最低检出量为1 TCID50/0.1 mL;批内、批间重复性试验显示,其变异系数均低于0.3%,具有良好的重复性.应用该方法对人工感染动物进行检测,自感染后第3、5、7、10、14、21 d分别采集全血,检测结果均为阳性.证实,本试验所建立的SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可以快速、准确地鉴别PRRSV高致病性毒株和经典毒株.     

猪伪狂犬病病毒流行毒株gC基因的分子特征及其对小鼠的毒力试验

为了阐明猪伪狂犬病病毒(PRV)流行毒株gC基因的分子特征及其对小鼠的毒力,对来自不同年代分离的6株PRV流行毒株进行了gC基因分子变异特征分析,通过接种BALB/c小鼠检验毒株的毒力。对临床病例分离的6株PRV和30个Gen Bank下载的gC基因序列进行分析表明,这6株PRV与2012年以后流行的毒力增强的变异毒株处于同一分支;这些毒株的氨基酸同源性为98.7%~100%,而与经典的PRV-SC毒株的氨基酸同源性仅为93.2%~94.0%。PRV毒株g C蛋白第52~70位氨基酸为高变区,尤其第64~70位出现7个氨基酸(AAASTPA)插入。对gC蛋白糖基化位点分析表明,PRV变异毒株较经典毒株增加了6个O-连接糖基化位点,且gC蛋白B细胞表位出现3处突变,分别为P69R、P80Q和N83G。gC蛋白上硫酸乙酰肝素结合域(HBD)出现2处突变,分别为HBD1第5位氨基酸由经典毒株的P突变为Q,HBD3的第3位氨基酸由Y突变为C。用分离的6株PRV接种BALB/c小鼠试验显示,PRV-HRB和PRV-SH毒株半数致死量(LD50)均为1×10~(3.21)/mL,PRV-DL、PRV-JL及PRV-GZL的LD50为1×10~(3.75)/mL,PRV-JF的LD50为1×10~(4.32)/mL。上述结果阐明了PRV流行毒株g C基因的分子特征及其对小鼠的毒力,为该病毒的致病机制研究提供了科学依据。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GDr180疫苗株与其他毒株PCR-HRM鉴别检测方法的建立

为建立一种快速鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)疫苗株GDr180株与其他毒株的PCR-HRM检测方法,比对NCBI登录的PRRSV全基因序列,筛选GDr180株与其他株的差异位点。PCR反应体系在加入LC Green染料及3′端封闭的探针下进行不对称PCR扩增,在HRM功能模式下进行PCR产物的熔解曲线分析。结果显示,GDr180株PCR产物的熔解曲线探针峰Tm值为72.64±0.39℃,而PRRSV其他株的探针峰Tm值为65.63±0.69℃或无探针峰,两者差异极显著。用本方法引物扩增非PRRSV如猪流行性腹泻病毒(PEDV)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒(PCV)和猪轮状病毒(Po RV)无特异性目的条带,标准品检测灵敏度为1 000 copies/L。本研究建立的PCR-HRM是一种高通量、经济、简便和可靠的用于鉴别PRRSV GDr180株与其他毒株的方法。     

猪流行性腹泻病毒强毒株和疫苗株多重RT-PCR鉴别检测方法的建立及应用

为建立猪流行性腹泻病毒(PEDV)的快速鉴别检测方法,针对PEDV基因序列设计3对特异性引物。第1对引物扩增野毒株(经典株、变异株)和疫苗株ORF3基因198 bp和148 bp片段;第2对引物扩增经典株和疫苗株S基因429 bp片段;第3对引物扩增变异株S基因274 bp片段。经过反应条件的优化,建立了能够同时检测并区分PEDV经典株、变异株及疫苗株的多重RT-PCR检测方法。该方法可以特异地检测PEDV,而与猪的其他重要病原FMDV、CSFV、PRRSV、TGEV、PRo V、PCV2、PRV无交叉反应;对重组质粒标准品的检出下限为2.62×10~2copies/L;重复试验获得了均匀一致的结果。应用该方法检测336份临床病料,PEDV阳性的120份,其中变异株96份、疫苗株21份、变异株和疫苗株混合感染3份。结果表明,本研究所建立的多重RT-PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,可用于PEDV经典株、变异株和疫苗株的快速鉴别检测和流行病学调查。     

美洲型与欧洲型PRRSV多重TaqMan荧光定量RT-PCR鉴别检测方法的建立及应用

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲型经典毒株、高致病性变异毒株以及欧洲型毒株基因组的序列差异,设计2对特异性引物和3条TaqMan探针,经过反应条件的优化,建立了能同时检测并区分PRRSV美洲型经典毒株、变异毒株以及欧洲型毒株的多重荧光定量RT-PCR方法。该方法线性关系好,标准曲线的相关系数均达到0.999以上;特异性强,只有PRRSV出现阳性反应,而与口蹄疫病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型均无交叉反应;敏感性高,经典毒株、变异毒株、欧洲型毒株的检出下限分别为1.13、1.37、1.39copies/μL,均比普通RT-PCR敏感100倍;重复性好,组内及组间变异系数均小于1.5%。应用所建立的方法对采集的282份临床病料进行检测,结果 PRRSV阳性101份,其中95份为变异毒株、6份为经典毒株、4份为变异毒株和经典毒株混合感染,未检测到欧洲型毒株。结果表明,本研究建立的多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法可为PRRSV的快速鉴别诊断及流行病学调查提供有效的技术手段。     

猪伪狂犬病病毒SX-2018变异株的分离鉴定及其致病性研究

本研究从疑似暴发伪狂犬病(pseudorabies,PR)猪场死亡的仔猪中分离到1株病毒,经组织病理学剖检、PCR试验、Western-blot分析,将其鉴定为伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV),遂被命名为SX-2018,该病毒在MDCK细胞上具有较强的适应性。将SX-2018株gE基因的序列与国内外21株PRV参考序列进行同源性比较,结果显示,SX-2018株gE基因与国内外参考毒株的核苷酸序列同源性为97.1%～99.9%,氨基酸同源性为94.5%～100%。遗传进化分析显示,SX-2012株与我国近几年新分离的猪伪狂犬变异毒株处于同一分支;并且与经典株相比,gE蛋白在第48位和第492位各有1个天冬氨酸的插入。为了进一步探讨SX-2018毒株的致病性,将SX-2018株和Min-A株分别感染BALB/c小鼠,分析两组小鼠的发病特征和组织损伤情况;结果显示,SX-2018组的小鼠死亡时间早于Min-A组;并且Min-A组小鼠的肺脏主要表现为间质性肺炎,而SX-2018组的小鼠以出血性肺炎为主。荧光定量PCR分别检测两组小鼠肺脏内PRV gI基因和炎症相关因子的变化;结果显示,SX-2018组小鼠肺组织内的gI基因以及炎症相关因子的mRNA水平显著地高于Min-A组小鼠。以上结果表明,本文成功分离到1株PRV变异毒株,并且与PRV经典株Min-A株相比,新分离的变异毒株可以诱导不同程度的病理损伤和炎症反应。     

猪伪狂犬病病毒HLJ8株的分离与鉴定

2013年黑龙江省某猪场发生仔猪死亡并且伴有神经症状,采集死亡猪脑组织,经PCR检测、病毒电镜观察,确诊为伪狂犬病病毒(PRV)感染,遂将该毒株命名为HLJ8。进一步对病毒gE基因的序列分析表明,该毒株与2012年的中国分离株在同一个相对独立的分支中,氨基酸序列的同源性在94%~100%之间;与2011年之前分离的毒株的亲缘关系较远。小鼠毒力试验结果表明,高剂量(1×103 PFU/mL)的HLJ8株可以引起小鼠死亡以及皮肤瘙痒等典型的PRV感染症状,但其毒力略低于经典强毒株PRV SC株。     

伪狂犬病病毒感染小鼠骨髓间充质干细胞的增殖特性

体外分离培养小鼠骨髓间充质干细胞,用伪狂犬病病毒感染骨髓间充质干细胞,通过细胞病变观察、毒力测定、PCR及间接免疫荧光试验,评估了伪狂犬病病毒在间充质干细胞内的增殖情况。结果显示,经体外分离培养并鉴定的间充质干细胞感染伪狂犬病病毒后,产生典型的细胞病变;经毒力测定细胞内伪狂犬病病毒的TCID50效价较高;经PCR从间充质干细胞内成功扩增出伪狂犬病病毒的特异性片段;间接免疫荧光试验显示间充质干细胞内分布有特异性荧光。表明,该细胞适应伪狂犬病病毒在其上增殖繁衍,具有作为伪狂犬病病毒致细胞病变机理、潜伏感染及致病等机制平台的潜质。     

伪狂犬病病毒野毒株新型可视化环介导等温扩增检测方法的建立

利用环介导等温扩增（LAMP）与pH指示剂结合的方式建立伪狂犬病病毒（PRV）野毒株的快速检测方法，并优化反应体系。结果显示，该方法特异性良好、敏感性较高，检测限达 10~(0.5) TCID_(50)，与荧光定量PCR的敏感性一致。对52 份临床样品进行检测，用荧光定量PCR检测出30份阳性样品，LAMP检测出27份阳性样品，二者的符合率为94.2%。结果表明，PRV野毒株新型可视化LAMP检测方法操作简便、结果判别明显、检测成本低，可预期应用于PRV带毒猪的快速筛查，这对于猪伪狂犬病的净化具有重要意义。     

猪伪狂犬病病毒JSZ株的分离鉴定及其病毒核酸的分布规律

用猪伪狂犬病病毒(PRV)特异性引物对江苏省某猪场疑似猪伪狂犬病的病死仔猪组织病料进行了PCR鉴定,结果可扩增到特异性的条带.用该病料接种PK-15细胞,24 h即出现细胞病变,PCR和间接免疫荧光试验结果均证明所分离病毒为PRV.用该PRV分离株接种兔后出现奇痒症状并麻痹致死;接种仔猪后出现持续发热,肌肉震颤等症状.通过对自然感染PRV病死仔猪脏器进行PCR检测,发现PRV在仔猪体内广泛分布,其中以脾的检出率最高,可达100%;对人工感染猪的直肠和鼻腔棉拭样品进行PCR检测,发现病猪排毒最长可达13 d.证实,该分离株为猪伪狂犬病强毒株,脾为病毒检测的首选靶器官.     

传染性腔上囊病病毒HN01超强毒株VP2基因的克隆和序列分析

根据GenBank中登录的传染性腔上囊病病毒(IBDV)标准强毒株52-70株基因组序列,设计并合成了1对扩增IBDV VP2基因的特异性引物.以IBDV超强毒分离株HN01感染发病鸡腔上囊组织中提取的病毒RNA为模板,用RT-PCR扩增出了1.45 kb的cDNA产物,将扩增的IBDV HN01株VP2基因克隆于pMD 18-T载体上,获得了pMD 18-T-VP2重组质粒.将IBDV HN01株 VP2基因序列测定结果与已发表的其他IBDV毒株VP2基因序列进行分析比较,绘出系统进化树.结果表明,HN01株与欧洲超强毒株UK661、日本超强毒株OKYM、香港超强毒株HK46等非常相似,而与经典强毒株、弱毒株和变异株相差较大.     

三株犬细小病毒的分离鉴定及VP2基因序列分析

为了解江苏省犬细小病毒(CPV)的流行变异情况,对疑似感染犬细小病毒的病例样品进行特异性PCR鉴定和F81细胞培养,并对病毒VP2基因及其推导氨基酸序列进行遗传变异分析。结果显示,成功分离到3株CPV,间接免疫荧光试验测定的病毒滴度分别为3.2×103TCID50/m L、3.5×103TCID50/m L、1.0×104TCID50/m L;3株CPV分离株VP2基因的核苷酸序列同源性为99.4%～99.8%,与30株来自不同国家和地区的CPV参考株同源性分别为98.1%～99.9%。VP2基因序列进化树显示,3株CPV分离株与CPV-2型(疫苗株)、CPV-2a型、CPV-2b型、New CPV-2a型、New CPV-2b型及国外CPV-2c型毒株的亲缘关系较远,与国内CPV-2c型毒株的亲缘关系较近;根据VP2蛋白第426位氨基酸位点的分子特征,证明这3株CPV分离株均为CPV-2c型毒株。该结果为近期江苏省CPV分子流行病学调查提供了依据。