真核表达的吕氏泰勒虫TlSP重组蛋白的免疫保护效果评价

为评价重组吕氏泰勒虫TlSP蛋白的免疫保护效果,以真核表达的不同浓度的重组TlSP抗原分别与等体积的佐剂MONTANIDE ISA 61 VG混合后充分乳化,于首次免疫后第0天和第21天分别免疫绵羊2次,于第35天进行攻蜱试验,通过观察在试验期间各组绵羊的临床症状、红细胞染虫率和特异性抗体效价等来评价免疫保护效果;空白对照组以等量PBS代替抗原进行同步参照分析。结果显示,空白对照组的绵羊出现高热、贫血和淋巴结肿胀等典型的临床症状,而2个重组蛋白免疫组只出现轻微贫血。空白对照组、免疫A组(600 g)和免疫B组(300 g)分别于攻蜱后第20天、36天和29天最早发现血液中出现泰勒虫,最高染虫率分别为8.60%、1.12%和3.00%,特异性抗体最高效价分别为1∶8 192、1∶65 536和1∶32 768。TlSP重组亚单位疫苗能刺激特异性T淋巴细胞的增殖,提高机体IL-2、IL-4和IFN-γ的分泌水平。本研究为今后羊泰勒虫病的防治奠定了基础。     

鸡球虫三价弱毒疫苗对鸡的免疫效果研究

将100只3日龄罗曼雏鸡随机分成空白对照组、攻虫对照组、Ⅰ组(1个免疫剂量)、Ⅱ组(2个免疫剂量)和Ⅲ组(0.5个免疫剂量)共5个试验组,每组20只鸡,对研制的鸡球虫三价弱毒疫苗的安全性和免疫效果进行初步评价。结果,各组的相对增重率依次为100.0%、86.8%、81.8%、89.2%和89.7%;攻虫后第10 d剖检所有鸡,各组肠道病变记分依次为0、2.7、2.2、2.3和2.6;免疫期间,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组的OPG值依次为5.7×106、6.7×106和7.3×106;攻虫期间,攻虫对照组的OPG值为12.3×106,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组的OPG值依次为7.2×106、8.5×106和9.0×106。攻虫后各组的死亡率依次为0、5%、0、10%和0;各组的抗球虫指数依次为200.0、115.8、135.8、140.2和143.7。结果表明,该三价弱毒疫苗抗柔嫩艾美球虫的效果并不理想,还需要进一步改进和完善。     

张家川县绵羊血液原虫病的调查与防治

对甘肃省张家川县绵羊蜱媒血液原虫病进行了流行病学调查。结果发现 ,绵羊体表寄生蜱类 5种 ,即青海血蜱 (Haemaphysalisqinghaiensis)、长角血蜱 (H .longicornis)、革蜱 (Dermacentorspp .)、草原革蜱 (D .nuttalli)和微小牛蜱 (Boophilusmicroplus) ,其中青海血蜱为传播媒介优势种。绵羊泰勒虫 (Theileriaovis)感染率为 6 2 .2 % ,无形体 (Anaplasmaovis)感染率为 16 .7% ,且有双重感染的病例。体表喷洒药物灭蜱试验表明 ,5 0mg/L倍特对蜱类的半数致死时间 (LT50 )为 4 .91h ,用药后 3d体表残留活蜱数为 3.4± 2 .2只 ,14d后再次染蜱数为 4 9.7± 12 .0只 ,羊只血液原虫病感染率由38.1%降至 8.8% (P <0 .0 1) ,红细胞染虫率由 11.6 %± 6 .9%降至 5 .4 %± 2 .1% (P >0 .0 1)。     

锗硒对绵羊血液抗氧化酶活性和增重率的影响

选取 2 0只羯滩羊随机分成 4组 ,每组 5只。第Ⅰ组为对照组 ;第Ⅱ组绵羊每 2 0d肌肉注射 2 g/L亚硒酸钠溶液 ,2mL/只 ;第Ⅲ组绵羊每日口服 1g/LGe 132溶液 ,5 0mL/只 ;第Ⅳ组绵羊同时补充亚硒酸钠和Ge 132 ,方法和剂量同上 ,试验期为 2个月。在试验前和试验后第 10、2 0、30、4 0、5 0d采取血样 ,测定血浆GSH Px和SOD活力 ,在试验前和试验第 6 0d时称量各组绵羊体重。结果 ,第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组绵羊血浆GSH Px活力明显高于第Ⅰ组 (P <0 .0 5或P <0 .0 1) ;第Ⅲ、Ⅳ组绵羊血浆SOD活力极显著高于第Ⅰ组 ;第Ⅳ组绵羊血浆GSH Px、SOD活力显著或极显著高于第Ⅱ、Ⅲ组 ;第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组绵羊的增重率分别比第Ⅰ组提高了 3.7%、1.8%和 5 .0 %。表明 ,锗、硒可提高绵羊血液抗氧化酶的活力 ,并能提高其增重率。     

羊泰勒虫病人工感染试验

在实验室条件下用采自甘肃省临潭县的青海血蜱饥饿成蜱人工叮咬绵羊,使其感染泰勒虫并发病,观察其虫血症、临床表现、血液学变化及病理剖检变化.结果,试验羊普遍出现稽留热、贫血、体表淋巴结肿胀等症状;血红蛋白含量从85 g/L降到40 g/L,红细胞总数从12.0×1012降到1.5×1012;内脏器官有不同程度地肿胀、出血;本病的潜伏期为22-28 d,红细胞染虫率最高可达39%.     

吕氏泰勒虫TlSP基因多态性免疫区在毕赤酵母中的高效分泌表达

为研制具有完整抗原性和天然结构的吕氏泰勒虫表面蛋白TlSP(Theileria luwenshuni surface protein),采用RT-PCR方法从吕氏泰勒虫裂殖子总RNA反转录获得TlSP基因的c DNA序列,将其多态性免疫区域克隆至毕赤酵母表达载体p PIC9K,构建重组质粒p PIC9K-TlSP。p PIC9K-TlSP经SalⅠ酶切线性化后,电转化导入毕赤酵母菌株GS115和KM71中,经遗传霉素G-418筛选后得到高拷贝菌株,对PCR鉴定为阳性的菌株进行甲醇诱导表达。对GS115和KM71两种菌株表达重组蛋白TlSP的效果进行评估,并对TlSP的反应原性进行了分析。结果表明,反转录获得的TlSP基因的c DNA序列长为888 bp,其中多态性免疫区域长为552 bp;筛选得到抗遗传霉素G-418(4.0 mg/m L)的GS115菌株5株,KM71菌株7株,经PCR鉴定为阳性的2种菌株均成功表达了分泌型重组蛋白TlSP,GS115菌株的蛋白表达效果较好;重组蛋白TlSP能与吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫、绵羊泰勒虫及环形泰勒虫阳性血清发生反应,而与巴贝斯虫、绵羊无浆体阳性血清无反应。本研究为深入研究TlSP蛋白在羊泰勒虫病免疫学诊断和亚单位疫苗中的应用奠定了基础。     

环形泰勒虫子孢子悬液的制备及其对黄牛的感染试验

通过动物感染试验获得环形泰勒虫感染阳性蜱 ,采用标准方法制备环形泰勒虫子孢子悬液 ,并用此悬液感染试验牛。结果 ,试验牛感染后 1 5d血液中出现虫体 ,并表现为稽留热 ,最高体温 42℃以上 ,最高染虫率可达 75 % ,最终死亡     

鹦鹉热衣原体亚单位疫苗免疫原性及免疫保护性研究

本研究将鹦鹉热衣原体的MOMP基因经PCR扩增后与pET-22b(+)载体连接构建重组质粒,转化入E.coli,通过IPTG诱导表达MOMP蛋白,鉴定重组蛋白的表达和反应性。结果显示,重组蛋白被成功表达,分子质量大小为40 ku,经溶解、透析纯化后,重组MOMP蛋白纯度为91%,能与鼠抗重组MOMP蛋白抗体产生特异性反应,与鹦鹉热衣原体阳性血清呈强阳性反应。重组MOMP蛋白与ISA201佐剂乳化制成鹦鹉热衣原体亚单位疫苗,免疫绵羊后抗体效价高达1∶4 222,用强毒株攻毒后保护率达100%,表明此鹦鹉热衣原体亚单位疫苗具有良好的免疫原性和免疫保护性。     

类山羊传染性胸膜肺炎诊断和防治的研究——免疫试验

本研究在确证了华池“类山羊传染性胸膜肺炎”是由绵羊肺炎支原体(M.Ovipneu-monia)所致的基础上,又以地方分离株试制浓缩灭活苗3批。通过豚鼠、家兔和山羊、绵羊检验均安全,并免疫山羊12只,攻毒结果,免疫组11/12保护(保护率为91.7％)对照组9/9发病;又以8911批苗免疫绵羊4只,攻毒结果,免疫组4/4保护(保护率为100％),对照组3/3发病。田间小区免疫试验;共免疫绵羊、山羊3672只,另设对照羊1451只,经半年免疫试验观察和抽样攻毒效检,免疫羊保护率为93.9％,其发病率和死亡率比对照群分别降低74.9％和72.6％,以上结果证明了试制三批苗对山羊和绵羊均具有良好的免疫效力。免疫持续期试验,以8810批苗在现地免疫羊865只,对照羊651只,经6、12及18个月的攻毒试验,结果免疫群的保护率分别为96.5％,97.5％,92.8％,免疫群比对照群发病率/死亡率分别降低78.3％/83.0％,86.7％/89.0％,7.06/72.2％,结果证明疫苗的有效免疫持续期为18个月以上。同时以本苗与“古典山传苗”作了6、12个月对比免疫试验,结果“古典山传苗”免疫群比8810批苗免疫群的发病率/死亡率分别高83.4％/93.4％和90.0％/91.1％。并证实两种疫苗间缺乏交叉免疫力。将3批苗保存在4～6℃条件下12个月,在室温(25±5℃)中6个月,其免疫效力不减低。     

磷酸伯氨喹和贝尼尔对人工感染羊泰勒虫病例的治疗试验

用感染羊泰勒虫的青海血蜱叮咬健康羊人工复制羊泰勒虫病病例6只,用贝尼尔和磷酸伯氨喹各治疗2只.结果,磷酸伯氨喹以1.5 mg/kg体重剂量连续肌肉注射3 d,2只羊的染虫率分别从15.0%和10.0%下降到0.5%,临床症状基本消失;贝尼尔以5.0 mg/kg体重剂量连续肌肉注射3 d,仅1只羊的染虫率由12.0%下降到1.5%,临床症状基本消失,1只羊的染虫率由12.0%上升到15.0%,临床症状加重.     

基于抗原蛋白Fiber-2及细胞因子佐剂的Ⅰ群4型禽腺病毒亚单位疫苗的开发

为了开发一种抗I群4型禽腺病毒(FAd V-4)的亚单位疫苗,选择I群禽腺病毒血清4型流行毒株衣壳蛋白Fiber-2作为保护性抗原蛋白。利用昆虫细胞-杆状病毒系统生产Fiber-2蛋白,通过Westernblot检测重组蛋白的表达情况,利用双向琼脂扩散法检测重组Fiber-2的免疫原性。为了增强亚单位疫苗的免疫保护效果,添加鸡源白细胞介素2(chIL-2)和鸡源γ-干扰素(ch IFN-γ)作为免疫佐剂,与重组Fiber-2单独或混合使用,制备多种形式的亚单位疫苗,并进行动物攻毒保护试验。重组蛋白的Western-blot鉴定结果显示,63 ku处出现Fiber-2蛋白目的条带;双向琼脂扩散试验结果显示,重组蛋白效价达到1∶128,表现出良好的反应原性。动物攻毒保护试验结果显示,单独使用Fiber-2免疫SPF鸡,在50 μg/只的剂量下,可为SPF鸡提供100%的保护效果,以chIL-2和chIFN-γ为免疫佐剂,与重组Fiber-2联合免疫SPF鸡,可显著增强Fiber-2在低剂量(10 μg/只)下的免疫保护效果,上述结果表明重组Fiber-2联合chIL-2和chIFN-γ细胞因子佐剂所制备的亚单位疫苗在抗I群4型禽腺病毒感染领域具有良好的应用前景。     

甘肃省羊泰勒虫病的调查及分布特征研究

利用病原检查、蜱感染试验和除脾激发试验相结合的方法，在甘肃省１３个地区（州、市）４５个县对２１６８只绵羊和山羊的泰勒虫病进行了调查。结果表明，甘肃省酒泉、张掖、金昌、武威、兰州、定西、天水、陇南、临夏、甘南、庆阳和平凉１２个地区３５个县均有羊泰勒虫病的分布，其传播媒介为青海血蜱，它主要孳生于阴湿灌丛草原，具有代表性的陇南和天水两地区羊泰勒虫的感染率高达４７．０％～８６．６％。     

旋毛虫TsGLS和TsGAD重组蛋白免疫保护作用的研究

为了评价旋毛虫TsGLS、TsGAD重组蛋白诱导小鼠的免疫保护效果,将TsGLS、TsGAD、TsGLS+TsGAD重组蛋白分别与佐剂混匀免疫BALB/c小鼠后,检测血清中特异性抗体水平变化,并检测重组蛋白体外刺激小鼠脾淋巴细胞所产生的细胞因子水平;在强化免疫小鼠后,通过攻虫试验检测并比较7 d成虫和35 d肌幼虫减虫率,以及免疫小鼠在攻虫后第7、14、21、35天产生的细胞因子水平。结果,各试验组小鼠血清中IgG1(Th2)为主的抗体水平上升,而且IL-4和IL-10水平在攻虫后第14天达到最高,IFN-γ和IL-12水平在攻虫后第7天达到最高。攻虫试验后TsGLS组、TsGAD组、TsGLS+TsGAD组的小鼠中旋毛虫成虫和肌幼虫减虫率分别为35.55%、49.24%、37.34%和47.05%、60.01%、46.55%。上述研究结果表明,TsGLS和TsGAD重组蛋白均能诱导小鼠获得免疫保护效果,且TsGAD重组蛋白免疫效果更佳。     

建立在PCR-RFLP方法基础上的羊梨形虫的种类鉴定

羊的梨形虫病在世界范围内广泛分布,由多种泰勒虫和巴贝斯虫引起。在我国主要有莫氏巴贝斯虫、羊巴贝斯虫未定种、吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫和绵羊泰勒虫,给我国畜牧业造成了巨大的经济损失。为了快速准确地鉴定羊梨形虫,作者运用PCR技术扩增了梨形虫的18 S rRNA基因,然后再分别用内切酶ClaⅠ、Sau96Ⅰ和MboⅡ酶切扩增产物,根据酶切后限制性片段多态性的不同,建立了PCR-RFLP方法,达到了鉴定莫氏巴贝斯虫、巴贝斯虫未定种、吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫和绵羊泰勒虫的目的,为梨形虫的分类和流行病学调查提供了新的方法。     

鸡球虫疫苗1号的免疫效果研究

用鸡球虫1号苗(LCV-1)以1头份/只和5头份/只剂量分别免疫10日龄伊莎褐公雏,并设攻虫对照组和空白对照组。2个免疫组在整个试验过程中没有死亡,其相对增重率分别达96.27%和95.17%,而攻虫对照组的相对增重率为91.21%,与免疫组相比差异显著;2个免疫组攻虫期间平均OPG值分别为1.001×105和1.63×105,而攻虫对照组为2.118×105,2个免疫组与攻虫对照组相比差异极显著;2个免疫组间比较,免疫1组比免疫2组的平均增重高1.1%,差异不显著;免疫期间平均OPG值免疫1组比免疫2组小53.08%,差异极显著,攻虫期间前者比后者小38.59%,差异显著。从总体看,免疫1组的剂量比免疫2组的安全可靠,免疫保护作用更强。     

副猪嗜血杆菌聚胺转运蛋白PotD重组亚单位疫苗的制备及其免疫保护效力的评价

为研究副猪嗜血杆菌Pot D蛋白的免疫保护效力,本研究以副猪嗜血杆菌SC1401菌株的基因组DNA为模板,PCR扩增去除信号肽编码序列后的potD基因部分片段,将其克隆于pET-28a(+)载体中,构建重组表达质粒pET-potD,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,超声破碎后SDS-PAGE分析目的蛋白表达形式。纯化后的蛋白以每只50 g的剂量免疫2周龄的BALB/c小鼠,同时设置SC1401全菌灭活疫苗组、生理盐水对照组及佐剂对照组,一免后第14天进行一次加强免疫,二免后第14天断尾采血进行抗体效价测定,并以5×LD50的SC1401野毒株攻毒,评价其免疫保护效力。结果显示,目的蛋白的分子质量为44.3 ku,主要以包含体形式存在;ELISA测定的Pot D蛋白的血清抗体效价(最高稀释度为1∶20 000,P/N2.1),显著高于SC1401全菌甲醛灭活苗(最高稀释度1∶10 000)、生理盐水对照组及佐剂对照组的血清抗体效价(P0.05)。攻毒后显示Pot D蛋白组的保护力达80%,与SC1401全菌灭活疫苗组持平,远高于生理盐水对照组及佐剂对照组。结果表明,Pot D重组蛋白能够很好的激发小鼠体内的免疫应答,提供较好的免疫保护力,可以作为副猪嗜血杆菌病重组亚单位疫苗的候选抗原蛋白。     

禽流感H9亚型灭活油乳剂疫苗不同剂量的免疫效果比较

将 4 7只 2 8日龄SPF鸡分为 4组 ,第 1～ 3组为试验组 ,每组 12只 ,分别肌肉注射禽流感H9亚型灭活油乳剂疫苗 0 .1、0 .3、0 .5mL/只 ,第 4组 11只为对照组。各组鸡在免疫后 1、2、3周采血 ,测定H9抗体水平 ;在免疫后 3周用 1∶10稀释的AIV H9N2攻毒 ,0 .2mL/只。攻毒后第2、3、4周继续测定H9抗体水平 ,观察了疫苗对鸡的保护效果。结果显示 ,0 .5mL/只剂量的免疫效果比 0 .1mL/只和 0 .3mL/只剂量的免疫效果好 ;攻毒用的AIV H9N2的致病力低 ,对所有试验鸡均不致死。     

鸡新城疫油乳剂灭活疫苗免疫效果的研究

本试验根据国内外学者的有关研究,自制了鸡新城疫油乳剂灭活疫苗(简称油苗),油苗与Ⅱ系或Ⅳ系弱毒疫苗同时应用于带母源抗体的1日龄雏鸡,较好地克服了母源抗体的干扰,获得了理想的免疫效果。Ⅱ系 油苗组免疫后60日龄内,Ⅳ系 油苗组免疫后90日龄内,HI抗体效价在4 log_2 X以上,攻毒保护率为100％;Ⅱ系 油苗组免疫后90日龄,HI效价为3 log2 X,攻毒保护率为80％,其免疫效果远远高于油苗单独免疫及Ⅱ系疫苗对1日龄或9日龄雏鸡的免疫。在农村推广应用油苗与弱毒疫苗同时免疫孵坊内的1日龄雏鸡,可避免雏鸡因母源抗体水平高低悬殊而造成的单用弱毒疫苗的初免失败,又克服了在7～15日龄时,鸡己分散到千家万户,使免疫很难进行的缺点。既提高了免疫密度,又提高了免疫效果。油苗对经免青年鸡及成年鸡的免疫,其HI抗体效价高于Ⅰ系弱毒疫苗免疫鸡3～4个倍比滴度,且能在较长时间内处于高免疫水平状态。免疫后390天,HI效价还在4 1og_2X以上,攻毒保护率100％。疫苗原胚液经4～40倍稀释后制成油苗,免疫鸡仍能达到或超过Ⅰ系疫苗的免疫水平。     

牛源环形泰勒虫吐鲁番流行株Ta-t的体内扩繁试验

以被去除脾的昆明小白鼠为实验动物(40只),接种牛源环形泰勒虫吐鲁番流行株Ta-t,进行小鼠体内扩繁试验,并于接种后第8、12、24、48小时以及第3~10天每天经血液涂片检查接种后昆明小白鼠的红细胞染虫率,观察分析其扩繁情况;经昆明小白鼠心脏、眼球采血的方法收集其最高染虫率(15%以上)的血液内裂殖子,并进行冻存,摸索其保存、复苏条件等。结果显示,除脾术后昆明小白鼠均存活,检测其呼吸、脉搏、食欲、精神状态皆良好,说明摘脾手术成功;接种后第48小时可在昆明小白鼠血液里观察到裂殖子,第5~9天每组昆明小白鼠的平均染虫率可达15%~20%(最高峰),第10天后染虫率开始下降,血液涂片中裂殖子数量渐渐减少;经试验发现,在雌雄性昆明小白鼠体内的染虫率差异极显著(P=0.0070.01),去脾昆明小白鼠与未去脾昆明小白鼠的染虫率差异也极显著(P=0.000 20.01),牛源环形泰勒虫在除脾的昆明小白鼠血液内能被置换、增殖。染虫率为15%以上时昆明小白鼠血液里的裂殖子可用冷冻(-80℃)保存,亦可制作玻片裂殖子抗原备用,保存半年以内的裂殖子复苏活性最佳。该试验数据可为建立环形泰勒虫动物模型、教学、科研提供丰富的血液原虫株资源。     

家兔出血症病毒病毒样颗粒疫苗的研制及评价

为研究重组杆状病毒RHDV-VP60株表达VP60蛋白及其效果的情况,将RHDV-VP60株接种Sf9细胞制备家兔出血症病毒样颗粒蛋白,与铝胶佐剂混合制成灭活疫苗,进行安全检验、最小免疫剂量测定及免疫持续期研究。结果显示,3批VP60蛋白病毒样颗粒抗原液的血凝效价为1∶2~(18)～1∶2~(19)。3批疫苗以超剂量(每只2.0 mL)免疫家兔未见任何不良反应;对兔的最小免疫剂量为每只0.5 mL;免疫后第14天,血清RHDV HI效价为1∶16～1∶64,攻毒后5/5健活;疫苗免疫持续期达210 d。上述研究结果表明,重组杆状病毒RHDV-VP60株可高效表达VP60蛋白并能形成病毒样颗粒,用其制备的疫苗安全性及免疫效果良好,解决了传统疫苗生产过程所存在的生物安全风险以及重组蛋白表达量低的问题。