间接荧光抗体诊断牛边缘边虫病的研究

间接荧光抗体试验(IFAT)检测边缘边虫(Anaplasma marginale)感染牛血清快速准确,具有实际应用价值。利用冷藏抗原片进行的IFAT结果表明,该法具有特异性强、敏感性高等特点,人工感染牛符合率为100％;就疫区273份血清的检查,阳性率为35.2％,对安全区86份血清的检查,假阳性占3％。抗体消长实验表明,人工感染牛于第5天即可测出IFA抗体,60～70天达到高峰(1:5120),并维特一段时间,在感染后335天,抗体消失。在本试验中边缘边虫抗原与双芽巴贝西虫、牛巴贝西虫、瑟氏泰勒虫、伊氏锥虫感染牛血清均无交叉反应;与绵羊边虫感染羊血清有很强的交叉反应。     

牛巴贝斯虫病ELISA诊断方法的建立

以BORCT蛋白为包被抗原,优化最佳反应条件,确定阈值并测定其交叉反应,建立了一种特异性检测牛巴贝斯虫抗体的间接ELISA方法。利用该方法测定了试验感染的2头牛的抗体动态曲线,并对我国四川、甘肃、新疆3个省(自治区)的314份牛血清样品进行了检测。结果显示,经MedCalc 12.7.3.0软件分析86份阴性血清和69份阳性血清的检测结果,确定29.6%抗体比率为该方法的阳性阈值,对应的敏感性和特异性分别为94.2%和96.5%,并且与其他巴贝斯虫、泰勒虫和无浆体阳性血清均无交叉反应。对试验感染动物的检测结果显示,感染后的第6天出现特异性抗体,第12天达到最高值,一直持续到第270天。野外样品检测结果显示,3个省份均有牛巴贝斯虫的分布,平均阳性率为46.82%。     

延边地区牛瑟氏泰勒虫病的分子流行病学调查

为了解吉林省延边地区牛瑟氏泰勒虫病的流行情况,分别采用血涂片染色镜检法和PCR方法对采自延边地区的206份牛血液样本进行了牛瑟氏泰勒虫病的分子流行病学调查。结果显示,PCR检测的阳性率为62.6%,显著高于血涂片染色镜检法检测的阳性率(17.5%)。采用统计学分析方法对PCR检测的206份血液样本进行了不同地区、不同年龄、不同品种及饲养方式的比较;结果,不同地区之间和不同品种之间瑟氏泰勒虫感染率差异不显著(P>0.05);而不同年龄阶段之间和不同饲养方式之间牛瑟氏泰勒虫感染率差异显著(P<0.05)。结果表明,吉林省延边地区是牛瑟氏泰勒虫病的流行地区。     

补体结合试验诊断环形泰勒虫病的研究

用含环形泰勒虫的血液接种除脾牛，将红细胞中的虫体制成抗原，建立了总量为０．６ｍｌ的补体结合试验方法。人工感染牛血清中的抗体在感染后５ｄ即可检出，３０ｄ达到最高峰，持续８个月。检测４３头已知感染牛，４２头呈阳性反应，检出率为９７．５６％；３５份安全区牛血清，均呈阴性，没有假阳性反应。环形泰勒虫抗原与瑟氏泰勒虫血清有轻微的交叉反应，与双芽巴贝斯虫、牛巴贝斯虫、牛边虫、伊氏锥虫、日本分体吸虫病牛的血清无交叉反应。利用该方法对不同地区的１２７５份牛血清进行了环形泰勒虫病血清学调查，表明其敏感性、特异性良好，可用于口岸检疫、流行病学调查及临床诊断     

牛环形泰勒焦虫补反抗体测定

据资料报道,补体结合反应(CF)是动物和人感染原虫后出现的一种比较特异性的血清学反应。 ( 1966)用环形泰勒焦虫红细胞型虫体作抗原。检测了实验感染环形泰勒焦虫牛的补反抗体,对补反阳性牛进行攻蜱试验,结果表明阳性牛具有对该病的免疫力。P.Hooshmand-Rad等(1971)利用环形泰勒焦虫组织培养物作抗原成功地测定了牛体注苗后血液中的补反抗体。关于这方面的资料国内尚未见报道。本实验以人工培养     

酶联免疫吸附试验诊断环形泰勒虫感染牛的研究

用层析法制备的牛环形泰勒虫（Ｔｈｅｉｌｅｒｉａａｎｎｕｌａｔａ）抗原用于ＥＬＩＳＡ试验，检测６２头份带虫牛血清，阳性符合率９６．６７％；在疫区检测１５０头份牛血清，阳性率８０．４３％；在瑟氏泰勒虫流行区检测４５４头份牛血清，有交叉反应，阳性率２８．１９％；检测８９头份安全区牛血清阴性符合率１００％。用正常红细胞抗原和环形泰勒虫抗原分别对人工感染和自然感染牛作了特异性试验，结果ＥＬＩＳＡ前者ＯＤ值为阴性，后者ＯＤ值为阳性。２头人工感染牛于接种后１４～２０天测出抗体，３０天达到高峰，然后下降．其中１头牛接种后１２个月ＥＬＳＡ值仍明显高于健康于。环形泰勒虫抗原与双芽巴贝西虫、牛巴贝西虫、大巴贝西虫、边缘边虫、日本血吸虫、伊氏锥虫、肝片吸虫抗血清不发生交叉反应。检测瑟氏泰勒虫血清，有３／４的阳性反应率，证实环形泰勒虫与瑟氏泰勒虫有密切的血清学关系。     

补体结合试验诊断边虫感染牛的研究

利用边缘边虫DS-1株接种除脾易感牛,制备出补反诊断抗原。所制备的抗原具有良好的特异性和敏感性,并建立了总量为0.6ml的补反诊断方法。对试验条件下人工感染牛的补反检出率为100％,安全区无假阳性反应。人工感染牛第5天出现补反抗体,感染后20～50天血清抗体达到高峰,以后开始下降,7个月后补反抗体消失。所制备的补反抗原与双芽巴贝西虫、牛巴贝西虫、大巴贝西虫,环形泰勒虫、瑟氏泰勒虫、伊氏锥虫和日本血吸虫等几种血液寄生虫抗血清之间没有交叉反应。抗原保存期达一年以上。所制备的抗原达到了国外同类产品的水平。     

牛流行热在天祝白牦牛中流行病学的调查

为了解牛流行热在天祝白牦牛中的流行状况,本研究从甘肃省武威市天祝藏族自治县的7个乡镇分别随机抽样采集了224头白牦牛的抗凝血和血清,应用间接ELISA抗体检测试剂盒检测血清中牛流行热病毒特异抗体,应用实时荧光定量RT-PCR、RT-PCR方法检测牛流行热病毒G基因并进行序列验证。结果表明,7个乡镇的白牦牛均存在牛流行热病毒感染,抗体阳性率为45.09%;荧光定量RT-PCR的检出阳性率为37.5%;以RT-PCR扩增G基因3’端420 bp区段测序并构建系统发育树表明,白牦牛群流行的BEFV毒株与中国大陆1976年分离的JB76H毒株亲缘关系较近,为BEFV基因Ⅰ型。本研究首次证实白牦牛在自然状态下可感染牛流行热病毒,可能是重要的牛流行热病毒宿主。     

团集凝集试验诊断牛边缘无浆体病的研究

应用国内制备的全套试剂建立的团集凝集试验(CAT)检测3份边缘无浆体人工感染牛血清,阳性率为100％;98份流行区牛血清,阳性率为16％;267份非疫区牛血清,全部为阴性。与多种病毒、细菌病及包括血液原虫病在内的一些寄生虫病无交叉反应。一次感染边缘无浆体的牛,用此法检测,其抗体可持续8个月以上。     

牛新孢子虫病和弓形虫病的流行病学调查

为了调查我国牛新孢子虫和弓形虫的感染情况,应用新孢子虫酶联免疫吸附试验(ELISA)和弓形虫间接血凝试验(IAT)分别检测了来自国内10个省(市、自治区)的262份乳牛、10份肉牛和40份水牛血清。结果显示,乳牛新孢子虫的抗体阳性率为17.2%,弓形虫的抗体阳性率为2.3%,没有检测到既有新孢子虫抗体又有弓形虫抗体的乳牛血清。各牛场所检乳牛血清的新孢子虫抗体阳性率在0~34.4%之间。在水牛和肉牛血清中未检测到新孢子虫抗体和弓形虫抗体。流产乳牛血清的新孢子虫抗体阳性率为20.2%,未流产乳牛为16.1%,其中血清抗体阳性乳牛主要在妊娠中晚期流产。各个年龄段乳牛血清的抗体阳性率差异不显著(P>0.05)。不同妊娠胎次的乳牛血清抗体阳性率差异不显著(P>0.05)。确认新孢子虫病在国内大部分牛场存在。     

牛支原体P48蛋白的表达及间接血凝检测方法的建立与应用

优化并合成牛支原体的p48基因,将其克隆到pET-32a(+)表达载体上后,转化大肠杆菌BL21(DE3),16℃低温诱导表达,获得可溶性表达的大小约66ku的重组P48蛋白。将纯化后的重组P48蛋白致敏戊二醛和鞣酸处理过的绵羊红细胞,建立了检测牛支原体抗体的间接血凝试验。重组P48蛋白致敏红细胞的最佳质量浓度是20~40μg/mL,牛支原体超免疫血清抗体效价达1∶2 048~1∶4 096。该方法对牛肺疫、牛巴氏杆菌病、牛病毒性腹泻病、布氏杆菌病、结核病、口蹄疫、牛生殖道支原体感染、里奇氏支原体感染、大肠杆菌病阳性血清的检测结果均为阴性。该方法的特异性为100%,敏感性为93.33%。与国外商品化的牛支原体ELISA试剂盒相比,平均符合率为96.15%。对833份田间血清和1 084份乳清进行检测,阳性率分别是15.37%和19.56%。结果表明,该方法敏感性高、特异性强和重复性好,可用于牛支原体抗体水平检测、牛支原体病的辅助诊断和流行病学调查。     

牛瑟氏泰勒虫二温式PCR检测方法的建立及应用

为建立一种能快速、特异、敏感地检测牛瑟氏泰勒虫的方法,根据GenBank中的牛瑟氏泰勒虫MPSP基因(GQ180198.1)设计合成了1对特异性引物,建立了检测牛瑟氏泰勒虫的二温式PCR方法。该方法与犬新孢子虫、猪支原体和弓形虫RH株均无交叉反应,能检测到的最低DNA含量为1.7pg/μL。结果表明,该二温式PCR检测方法具有较高的特异性和敏感性。本研究为牛瑟氏泰勒虫的快速检测提供了一种方法。     

牛无浆体PCR检测方法的建立及应用

为建立快速、特异、敏感的牛无浆体(Anaplasma bovis)PCR检测方法及了解新疆部分地区牛无浆体感染情况,根据牛无浆体16S rRNA基因序列(MH255941.1)设计1对引物,建立了检测牛无浆体PCR方法,并进行特异性、敏感性、重复性试验、临床样品检测及系统进化分析。结果显示,所建立的方法能特异性地鉴别牛无浆体,与环形泰勒虫(Theileria annulata)、绵羊无浆体(A. ovis)、牛巴贝斯虫(Babesia bovis)、双芽巴贝斯虫(B. bigemina)基因组均无交叉反应,该方法检测下限可达到1.02×10~(-18)g/μL,比文献报道的PCR敏感10倍(8.9×10~(-18)g/μL);具有良好的重复性;对94份牛临床血液样品检测结果表明,牛无浆体的阳性率为54.3%(51/94),高于文献报道的PCR方法的检测结果 37.2%(35/94);系统进化树显示,三个地区的牛无浆体菌株都不在同一分支上。结论,成功构建了牛无浆体PCR快速检测方法,这为牛无浆体的快速诊断及流行病学调查奠定基础。     

微量补体结合试验诊断边虫感染牛的研究

利用边缘边虫DS—1株接种除脾易感牛,制备出补体结合试验诊断抗原,并建立了边虫感染牛总量为0.2ml的微量补反诊断法。所制备的抗原具有良好的特异性和敏感性,对实验室条件下人工感染牛的补反检查,符合率为100％;自然条件下感染牛补反检查的符合率为92.3％;安全区牛无假阳性反应。人工感染牛于第10天可测出补反抗体,30～40天抗体滴度达到高峰,60天后开始下降。边虫补反抗原与瑟氏泰勒虫、双芽巴贝西虫、牛巴贝西虫、伊氏锥虫、肝片吸虫、日本裂体吸虫感染牛血清无交叉反应,与正常红细胞免疫牛血清反应为阴性结果。     

抗布鲁氏菌单克隆抗体的研制及cELISA方法的建立

利用杂交瘤技术筛选出3株抗布鲁氏菌的特异性单克隆抗体5C10、4D2和3E4;利用单抗5C10建立了检测血清中布鲁氏菌抗体的竞争ELISA(cELISA)方法。用该方法对320份牛血清样品和147份绵羊血清样品进行了检测,并与商品化布鲁氏菌病试剂盒进行了比较。结果显示,用建立的cELISA方法和商品化布鲁氏菌病试剂盒对320份牛血清样品和147份绵羊血清样品的检测符合率分别为95.6%和92.5%。用补体结合试验(CFT)进一步检测差异结果的样品(25份),证明建立的cELISA与CFT的吻合率更高(21/25),而商品化布鲁氏菌病试剂盒与CFT的吻合率较低(4/25)。结果表明,本研究建立的用于检测布鲁氏菌抗体的cELISA方法更特异敏感,在布鲁氏菌病根除计划中将具有重要的应用价值。     

甘肃省庆阳地区泰勒虫病流行趋势及分子特征分析

泰勒虫引起的泰勒虫病作为危害畜牧养殖业的重要血液原虫疾病受到人们的广泛重视。因此,调查清楚某地域泰勒虫流行对于该病的早期预防有着积极的意义。本研究通过对位于陕西、甘肃、宁夏三省区的交汇处的庆阳地区蜱虫分布的调查,并进一步进行了蜱所携带的泰勒虫进行了分子鉴定。结果显示,庆阳地区蜱虫优势种以长角血蜱(Haemaphysalis longicornis)为主,兼有小亚璃眼蜱(Hyalomma anatolicum anatolicum),青海血蜱(H.qinghaiensis)的分布。其传播的泰勒虫主要是瑟氏泰勒虫(Theileria sergenti),东方泰勒虫(T. orientalis),环形泰勒虫(T. annulata)以及感染羊的吕氏泰勒虫(T. luwenshuni),尤氏泰勒虫(T. uilenbergi)等,此外还有泰勒虫未定种(Theileria sp.)的寄生。统计显示在收集的300头份牛血液中瑟氏泰勒虫感染率高达74.58%,东方泰勒虫感染率72.36%,环形泰勒虫感染率12.54%。收集的200头份羊血液中吕氏泰勒虫感染率63.58%,尤氏泰勒虫感染率53.62%。而长角血蜱感染泰勒虫的感染率高达87.76%,小亚璃眼蜱感染率为47.62%,青海血蜱感染率46.43%。由此可见,庆阳地区蜱虫分布虽然较为单一,但其传播的泰勒虫病原具有多样性,值得注意的是不论家畜还是蜱虫对于泰勒虫的感染均较高。这为当地的该疾病的防控带来了挑战。因此,加强当地家畜饲养管理将成为首要解决的问题;其次杀蜱也是防控泰勒虫病极其有效的方法。     

牛蓝舌病的血清学调查

1988～1989年,对兰州军区部分军马场和牧场进行了牛蓝舌病的调查;并采用青岛动物检疫总站提供的牛蓝舌病凝胶免疫扩散诊断抗原进行了血清学抽样检测。调查结果表明我区部分牧场自1983年来牛蓝舌病呈散发,但未引起死亡。血清学抽样检测不同品种牛224头份,检出阳性19头份,阳性率8.48％。其中青海五十六基地牦牛血清65头份,阳性9头份,阳性率达13.85％;甘肃山丹军马场褐牛血清为108份,阳性8份,阳性率为7.41％;陕西北关农场奶牛血清51份,阳性2份,阳性率占3.92％。经统计学处理,不同品种的牛阳性率无显著性意义(P>0.05)。     

间接血凝法诊断牛环形泰勒焦虫病

传统的镜检诊断牛环形泰勒焦虫病对隐性感染,轻度带虫和缺乏配子体的感染诊断困难,而且受到制片与染色技术等多种因素的影响。易造成漏诊和误诊,特别是对大规模的流行病学调查及相似形态虫体的鉴别诊断上更为困难。我们应用间接血凝(Lndirect haema-glutirotion INA)试验诊断牛环形泰勒焦虫病,效果令人满意。并能揭示患病动物的抗体和虫体的消长情况及其相互关系。     

牛源环形泰勒虫吐鲁番流行株Ta-t的体内扩繁试验

以被去除脾的昆明小白鼠为实验动物(40只),接种牛源环形泰勒虫吐鲁番流行株Ta-t,进行小鼠体内扩繁试验,并于接种后第8、12、24、48小时以及第3~10天每天经血液涂片检查接种后昆明小白鼠的红细胞染虫率,观察分析其扩繁情况;经昆明小白鼠心脏、眼球采血的方法收集其最高染虫率(15%以上)的血液内裂殖子,并进行冻存,摸索其保存、复苏条件等。结果显示,除脾术后昆明小白鼠均存活,检测其呼吸、脉搏、食欲、精神状态皆良好,说明摘脾手术成功;接种后第48小时可在昆明小白鼠血液里观察到裂殖子,第5~9天每组昆明小白鼠的平均染虫率可达15%~20%(最高峰),第10天后染虫率开始下降,血液涂片中裂殖子数量渐渐减少;经试验发现,在雌雄性昆明小白鼠体内的染虫率差异极显著(P=0.0070.01),去脾昆明小白鼠与未去脾昆明小白鼠的染虫率差异也极显著(P=0.000 20.01),牛源环形泰勒虫在除脾的昆明小白鼠血液内能被置换、增殖。染虫率为15%以上时昆明小白鼠血液里的裂殖子可用冷冻(-80℃)保存,亦可制作玻片裂殖子抗原备用,保存半年以内的裂殖子复苏活性最佳。该试验数据可为建立环形泰勒虫动物模型、教学、科研提供丰富的血液原虫株资源。     

牛地方流行性白血病液相蛋白芯片检测方法的建立

应用xMAP液相芯片技术原理,以原核表达的重组牛白血病病毒gp51蛋白为抗原,建立了检测牛白血病病毒抗体的LiquiChip液相蛋白芯片检测方法,并进行了特异性、敏感性、重复性与稳定性试验。结果表明,该方法对牛白血病病毒阳性血清检测阳性,对其他常见牛病毒阳性血清检测阴性,表明特异性好;液相蛋白芯片方法对牛白血病病毒抗体的检测敏感性可达119.7ng/μL,对多份牛白血病病毒阳性血清的检测结果显示该方法的检测敏感性与商品化ELISA试剂盒无显著差异;对3份牛白血病病毒阳性血清进行4次重复检测,批内、批间的变异系数均低于10%。所制备的偶联微球芯片保存3个月,其检测结果无显著差异。采用该方法对169份临床牛血清样品进行检测,检出阳性率达57.4%,该检测结果与瑞典进口ELISA试剂盒检测结果的符合率为94.67%。本方法为牛地方流行性白血病的进出境检疫、疫病监测和流行学调查研究提供了一种特异、敏感的新型快速检测技术。