应用重组猪生殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白为抗原建立I-ELISA检测方法的研究

用重组杆状病毒表达的猪生殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白作为抗原,建立了诊断猪生殖和呼吸综合征(PRRS)的I-ELISA,与IDEXX公司试剂盒检测结果的符合率为97.3%,与间接荧光抗体试验(IFA)的符合率为100%.用该方法检测国内猪血清85份,阳性率为18.8%;能检出PRRS疫苗免疫猪6 d的血清抗体;与猪瘟、伪狂犬病、猪巴氏杆菌病、猪霉形体病阳性血清无交叉反应.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立与应用

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是影响世界养猪业的一种重要病原,GP5蛋白是病毒编码的重要免疫保护蛋白。目前,虽然PRRSV抗体检测方法较多,但尚无商品化的GP5蛋白ELISA抗体检测试剂盒。本研究根据高致病性PRRSV BB0907毒株GP5基因特性,删除了GP5基因跨膜区,并将剩余基因片段优化为大肠杆菌偏嗜性,构建了高效表达的GP5重组蛋白的原核表达载体,制备获得GP5重组蛋白。通过反应条件优化,建立了PRRSV GP5蛋白间接ELISA(GP5-ELISA)抗体检测方法,其最佳抗原包被浓度为1.0μg/m L,血清的最佳稀释度为1:100,与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病病毒(PRV)、口蹄疫病毒(FMDV)、脑心肌炎病毒(EMCV)和副猪嗜血杆菌(HPS)等病原抗体均无交叉反应。相对于IDEXX公司PRRSV ELISA抗体检测试剂盒,本研究建立的间接GP5-ELISA的敏感性和特异性分别为90.69%和92.86%,两种方法的符合率为91.11%。用本研究建立的间接GP5-ELISA对360份临床猪血清的PRRSV抗体进行检测,抗体阳性率为74.44%。上述结果表明,本研究建立的猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白间接ELISA抗体检测方法具有广阔的应用前景。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立与应用

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是影响世界养猪业的一种重要病原,GP5蛋白是病毒编码的重要免疫保护蛋白。目前,虽然PRRSV抗体检测方法较多,但尚无商品化的GP5蛋白ELISA抗体检测试剂盒。本研究根据高致病性PRRSV BB0907毒株GP5基因特性,删除了GP5基因跨膜区,并将剩余基因片段优化为大肠杆菌偏嗜性,构建了高效表达的GP5重组蛋白的原核表达载体,制备获得GP5重组蛋白。通过反应条件优化,建立了PRRSV GP5蛋白间接ELISA(GP5-ELISA)抗体检测方法,其最佳抗原包被浓度为1.0 g/m L,血清的最佳稀释度为1∶100,与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病病毒(PRV)、口蹄疫病毒(FMDV)、脑心肌炎病毒(EMCV)和副猪嗜血杆菌(HPS)等病原抗体均无交叉反应。相对于IDEXX公司PRRSVELISA抗体检测试剂盒,本研究建立的间接GP5-ELISA的敏感性和特异性分别为90.69%和92.86%,两种方法的符合率为91.11%。用本研究建立的间接GP5-ELISA对360份临床猪血清的PRRSV抗体进行检测,抗体阳性率为74.44%。上述结果表明,本研究建立的猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白间接ELISA抗体检测方法具有广阔的应用前景。     

PRRS抗体间接ELISA检测方法的建立及应用

以差速离心法结合蔗糖密度梯度离心法提纯的PRRSVSC2株作为包被抗原,建立了检测猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体的间接ELISA法。该法的最适抗原包被浓度为5μg/mL,最佳酶标兔抗猪抗体稀释度为1∶5000,对猪抗PRRSV的IgG检测灵敏度达到0.1μg/mL。该法只与PRRS阳性猪血清呈现阳性反应,而与PRRS阴性猪血清和猪伪狂犬病、猪乙型脑炎、猪瘟、猪细小病毒病阳性血清呈现阴性反应。应用该法检测PRRSVORF5基因疫苗免疫猪后的抗体消长规律表明,疫苗免疫猪后第7d抗体水平迅速上升,第75d达到高峰,然后缓慢下降,至第135d时仍然极显著(P<0.01)高于空载体对照和空白对照。试验结果表明,该法具有良好的特异性和敏感性,可用于PRRS流行病学调查和PRRSV基因疫苗免疫后抗体水平检测。     

猪细小病毒VP2蛋白主要抗原表位区的原核表达及检测PPV抗体的间接ELISA的建立

利用大肠杆菌表达51ku的猪细小病毒(PPV)VP2蛋白主要抗原表位区,通过Western-blot检测,表达蛋白具有良好的反应原性。利用此表达蛋白建立了检测PPV抗体的间接ELISA。通过检测32份阴性血清最终确定本ELISA的判定标准为:血清抗体效价0.18,判为PPV血清抗体阳性;血清抗体效价≤0.18,判为血清抗体阴性。此ELISA的批内重复性试验的变异系数小于5%,批间重复性试验的变异系数小于10%。用此ELISA与商品化PPV IgG检测试剂盒做符合性比较试验;结果,感染猪血清抗体检测符合率为100%,免疫猪血清抗体检测符合率为82%,非免疫健康猪血清抗体检测符合率为78%,样本总体检测符合率为80%。用建立的ELISA检测田间猪血清的PPV抗体,阳性率介于28.8%~37.5%之间,提示上述地区可能存在不同程度的PPV感染情况。本研究为PPV免疫或感染状况的检测提供了一种有用的定性诊断方法。     

斑点免疫金渗滤法检测猪生殖与呼吸综合征抗体的研究

应用提纯的猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗原包被硝酸纤维素膜,然后用胶体金标记的金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)建立了检测PRRS抗体水平的斑点免疫金渗滤法(DIGFA)。该法通过胶体金标记SPA直接显色,阳性者出现红色斑点,整个试验过程仅需5min即可判断结果;与猪瘟、猪伪狂犬病、猪细小病毒病阳性血清不发生交叉反应;纯化PRRSV抗原的最低检测量为0.0553mg mL,即55.3ng 点。对200份猪血清用该法与ELISA同时进行PRRS抗体检测,两种方法的符合率达98%。     

猪萨佩罗病毒VP1蛋白的原核表达及其间接ELISA方法的建立

为建立猪萨佩罗病毒(PSV)的快速检测方法,本试验以重组VP1蛋白为包被抗原建立了检测PSV Ig G的间接ELISA方法。RT-PCR从PSV分离株SHCM2019中扩增VP1基因,将其克隆到原核表达载体p ET28a,对重组质粒pET28a-VP1进行原核表达,经Western-blotting检测后,利用VP1重组蛋白建立检测猪血清中PSV Ig G抗体的间接ELISA方法。结果显示,表达的VP1蛋白分子质量约为40 ku,与预期大小相符,Western-blotting表明,重组蛋白与PSV抗体阳性血清具有良好反应原性。以VP1蛋白为抗原建立的ELISA方法与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)及牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的阳性血清均无交叉反应,特异性好;批内和批间的变异系数均小于10%,重复性好。利用建立的间接ELISA方法对95份猪临床血清样本进行检测,阳性率为44.21%。本研究建立的检测方法为PSV的血清学诊断提供了可靠手段。     

猪生殖与呼吸综合征血清抗体重组N蛋白间接ELISA检测方法的建立

以纯化的猪生殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)重组N蛋白作为包被抗原 ,通过对各项试验条件的优化 ,建立起检测PRRS血清抗体的重组N蛋白间接ELISA检测方法。用此方法检测了2 0 0份血清样品 ,并与IDEXX公司ELISA试剂盒的检测结果相比较 ,敏感性和特异性分别为 93%和95 % ,总符合率达 91%。 2种检测方法的结果之间差异不显著 (P >0 .0 5 )。试验表明 ,建立的间接ELISA检测方法具有敏感性高、特异性强、重复性好的优点 ,可用于PRRS血清抗体的检测。     

猪流行性腹泻病毒COE基因的原核表达及其表达产物的生物活性分析

为了获得猪流行性腹泻病毒(PEDV)COE基因在原核表达载体pET-32a(+)中的表达产物,并检测表达产物的生物活性,根据猪流行性腹泻病毒COE基因的全序列设计引物,以pCMV-PEDVCOE质粒作为模板,通过PCR扩增得到COE基因编码区的序列,将其克隆至含有6×His tag的原核表达载体pET-32a(+)中进行诱导表达。表达产物经SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定,并用Ni-NTA亲和层析柱纯化,以此纯化产物为包被抗原建立了ELISA检测方法,并用该方法对39份感染PEDV猪血清进行了检测。结果显示,COE基因在大肠杆菌中经IPTG诱导表达,获得与预期分子质量相符的融合蛋白条带。经Western-blot检测,该蛋白能与Anti-PEDV单克隆抗体发生特异性反应。该融合蛋白纯化、复性后的质量浓度为0.7mg/mL。采用以融合COE蛋白为包被抗原建立的ELISA对39份PEDV感染猪血清的检测结果都为阳性,说明该融合蛋白具备作为包被抗原建立ELISA抗体检测方法的潜力。     

用3AB-ELISA鉴别猪口蹄疫病毒感染与疫苗免疫猪的研究

采用大肠埃希氏菌表达的口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白3AB(FMDV 3AB)多肽为抗原,A G蛋白 辣根过氧化物酶为酶结合物,过氧化氢 四甲基联苯胺为底物溶液,建立了一种可鉴别FMD感染与灭活疫苗免疫猪血清抗体的间接酶联免疫吸附试验(I ELISA),即3AB ELISA。通过对1779份健康猪、免疫猪及人工感染猪血清的检测,确定了该I ELISA的阳性 阴性判定临界值。该检测方法比VIAA AGID法检出率高,尤其是采用A G蛋白酶结合物后操作更简便。     

小反刍兽疫病毒抗体高敏快速荧光定量检测方法的建立

为建立快速定量检测羊血清中小反刍兽疫病毒抗体的方法,本研究通过优化大肠杆菌密码子、优化表达条件等步骤,在大肠杆菌原核表达系统中获得了可溶性的N蛋白与NH融合蛋白,基于纯化的可溶性N蛋白与NH融合蛋白建立了小反刍兽疫病毒抗体高敏荧光免疫定量检测试剂盒。该方法能够快速定量检测绵羊血清中的小反刍兽疫病毒抗体,敏感性高,特异性强,对其他相关的羊类病原无交叉反应,其组内与组间变异系数分别低于10%和15%,具有良好的重复性。对292份临床血清样品进行检测,同时用法国IDVET竞争ELISA试剂盒进行比较,两种方法符合率达到93.84%。与血清中和试验进行比较,高敏荧光快速定量检测方法检测效价值基本与标准阳性血清(OIE参考实验室提供)的中和试验效价值相符合。本试验建立的方法可对小反刍兽疫病毒抗体进行现场快速定量检测,具有较高的实用价值和推广价值。     

基因Ⅳ型猪戊型肝炎病毒重组ORF3蛋白抗原间接ELISA诊断方法的建立

为建立检测猪戊型肝炎病毒(HEV)抗体的间接ELISA诊断方法,将HEV ORF3片段克隆至大肠杆菌表达载体pET42a(+)中,构建了原核表达载体pET42a-ORF3,将其转化大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导表达,并对表达的融合蛋白进行Ni2+-NTA柱纯化及SDS-PAGE、Western-blot鉴定,用纯化的融合蛋白作为包被抗原建立了间接ELISA检测方法.结果显示,GST-ORF3在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了高效表达,表达的蛋白质分子质量约为45.5 ku,具有良好的抗原性.用建立的间接ELISA检测190份猪血清样品,阳性率为84.7%,与试剂盒检测结果相比,阳性符合率为91.5%.表明,建立的间接ELISA方法具有较好的特异性和灵敏性,可用于猪血清HEV抗体的检测.     

猪札幌病毒VP1基因的表达及ELISA抗体检测方法的建立

为了在大肠杆菌中表达猪札幌病毒VP1基因,并以纯化的重组蛋白为抗原建立猪札幌病毒血清抗体ELISA检测方法。采用RT-PCR技术扩增VP1基因,并将其克隆到pMD18-T载体中,再将所克隆的衣壳蛋白的编码序列亚克隆到表达载体pET-28a(+)中,将成功构建的原核表达质粒pETSAVCAP转化大肠杆菌Rosetta(DE3)进行诱导表达。用纯化的VP1蛋白作为抗原建立了猪札幌病毒血清抗体间接ELISA检测方法并初步用于临床样品的检测。结果显示,猪札幌病毒VP1基因可在大肠杆菌中稳定、高效地表达,Western-blot分析表明该重组蛋白具有良好的反应原性。经对反应条件进行优化,确定间接ELISA的抗原最佳包被浓度为0.5μg/mL,且不与其他常见猪病的阳性血清发生交叉反应,建立的ELISA方法具有较好的敏感性、特异性和重复性。通过对从多个省份收集的490份猪血清样品进行检测,阳性率为65.31%。表明,以大肠杆菌表达的猪札幌病毒VP1重组蛋白为抗原建立的间接ELISA方法可以用于猪札幌病毒抗体的检测。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒M基因的截短表达及间接ELISA检测方法的建立

为对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的M蛋白进行截短原核表达并建立ELISA检测方法,设计引物扩增了含M基因抗原位点的基因片段,并构建了原核表达载体pET-32a-dM;将pET-32a-dM转化大肠杆菌Rosetta(DE3),获得了高效表达,表达产物大小为27ku。蛋白免疫印迹结果显示,该重组蛋白具有良好的抗原活性。以重组蛋白为抗原建立了间接ELISA检测方法,方阵滴定试验确定重组蛋白抗原的最佳包被质量浓度为13.07μg/mL,血清稀释度为1∶80,酶标抗体1∶4 000稀释。阳性判定标准确立为D450nm≥0.3,反之则判为阴性。建立的ELISA与猪乙型脑炎病毒、胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌的阳性血清均无交叉反应,说明它特异性好。批内与批间重复性试验的平均变异系数分别为3.53%及6.82%,说明重复性较好。用该方法检测52份血清,特异性为87.5%,敏感性为90.0%,与商品化ELISA试剂盒的符合率为88.5%。本研究结果表明,截短表达的M蛋白可以作为诊断抗原,建立的ELISA方法完善后可用于PRRSV抗体的检测。     

猪生殖与呼吸综合征病毒分离株dNsp2基因的原核表达

参考GenBank中收录的猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)JXA1株Nsp2基因序列,设计了1对引物用于扩增截短的Nsp2(deleting Nsp2,dNsp2)基因,用BamH Ⅰ+Xho Ⅰ双酶切后将目的基因插入到原核表达载体pET-32a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,经SDS-PAGE电泳和Western-blot检测,dNsp2基因得到了高效表达,融合蛋白的分子质量约为36.5 ku,表达产物以可溶性方式存在于表达上清液中,表达量可达菌体总蛋白的30%以上,表达产物能被PRRSV变异株抗体所识别,具有较好的生物学活性.PRRSV变异株dNsp2基因的高效表达为该病毒ELISA检测方法的建立及应用奠定了基础.     

猪传染性胃肠炎病毒S基因主要抗原位点A和D的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

为建立一种检测猪传染性胃肠炎病毒血清抗体的间接ELISA,将猪传染性胃肠炎病毒S基因主要抗原位点A和D克隆到pET-28a(+)载体中,在大肠杆菌Rosetta(DE3)pLysS中进行表达。表达产物的分子质量为38ku,表达形式为包涵体。通过Western-blot证实,表达产物与猪传染性胃肠炎病毒多克隆抗体能够特异性结合。将重组蛋白经过8mol/L的尿素溶解后,作为间接ELISA的包被抗原,通过优化条件初步建立了检测猪传染性胃肠炎病毒血清抗体的间接ELISA。该方法与纯化的猪传染性胃肠炎病毒包被的间接ELISA相比,符合率达到91.53%。本研究结果对大规模地推广应用猪传染性胃肠炎间接ELISA诊断方法具有重要意义。     

伪狂犬病病毒gB抗原的可溶性原核表达及纯化条件的优化

为实现伪狂犬病病毒gB蛋白的可溶性表达,基于伪狂犬病病毒gB基因的序列分析及密码子优化,基因合成gB基因胞外区(含全部抗原表位)序列,亚克隆至原核表达载体pSMK中,获得表达载体pSMKgB。经大肠杆菌诱导表达,并对诱导温度、可溶性、IPTG加入时机、终浓度及诱导时间进行优化。结果表明,伪狂犬病病毒的gB蛋白在16℃、D600值为1.2、IPTG终浓度为0.8mmol/L的条件下,诱导20h,蛋白表达效果最好。经超声破碎,镍柱纯化可获得可溶性的gB蛋白。蛋白印迹法分析结果表明,纯化的目的蛋白能与抗组氨酸标签的抗体及猪伪狂犬病病毒阳性血清发生特异性反应,证实表达的蛋白具有较好的反应原性。本研究为后期制备猪伪狂犬病血清检测ELISA试剂盒奠定了基础。     

副猪嗜血杆菌不同血清型稳定表达蛋白的筛选及间接ELISA检测方法的建立

为了建立一种能够检测不同血清型副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA,选用了在4、5、12型副猪嗜血杆菌中稳定表达的3种蛋白经原核表达后作为候选抗原和全菌裂解物同时包被酶标板,对临床猪血清进行副猪嗜血杆菌抗体检测,发现以锰依赖的超氧化物歧化酶(MSD)作为包被抗原得到的结果最接近用副猪嗜血杆菌全菌裂解物进行ELISA检测的结果,故确定以MSD蛋白为抗原建立间接ELISA。通过方阵滴定对ELISA反应条件进行筛选优化,确定了最佳反应条件:包被抗原的质量浓度为1.5μg/mL,4℃过夜;50g/L脱脂奶粉溶液37℃封闭2h;血清稀释度1∶160,37℃作用90min;酶标二抗的稀释度为1∶15 000,37℃作用45min;底物显色时间为37℃6min。抗体临界值D450nm≥0.245 1判为阳性,D450nm0.208 3判为阴性,介于两者之间为可疑。特异性和重复性试验证明,该方法与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、口蹄疫病毒、红斑丹毒丝菌、马链球菌、猪链球菌、大肠杆菌、肠炎沙门菌血清抗体无交叉反应,批内、批间重复性较好。用建立的间接ELISA对114份临床血清进行检测,与4、5、12型全菌裂解物的ELISA检测结果比较,阳性符合率分别为80.77%、80.00%和90.00%。结果表明,建立的间接ELISA可被用于4、5、12型副猪嗜血杆菌的抗体检测和流行病学调查。     

猪嵴病毒重组VP3蛋白间接ELISA检测方法的建立

为建立检测猪嵴病毒(porcine kobuvirus,PKV)血清抗体的间接ELISA检测方法,以原核表达的重组VP3蛋白为检测抗原,优化ELISA检测条件,建立了PKV抗体的间接ELISA检测方法。该方法仅对PKV血清检测为阳性,对于能够引起猪病毒性腹泻的猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒以及猪轮状病毒阳性血清检测均为阴性。临床血清样品的检测结果表明,建立的ELISA检测方法与RT-PCR方法的阳性符合率较高。结果表明,建立的以重组VP3蛋白为包被抗原检测PKV血清抗体的ELISA方法可以用于检测PKV的感染及相关流行病学调查。     

PRRSV M蛋白基因片段的原核表达及间接ELISA检测方法的初步建立

利用PCR方法获得PRRSV M基因,使用原核表达系统p ET-28a(+)-BL21(DE3)诱导表达M蛋白。用表达的M蛋白建立检测PRRSV抗体的间接ELISA。通过特异性试验、阻断试验和重复性试验考查基于重组M蛋白建立的ELISA(M-ELISA)的实用性,同时使用M-ELISA和IDEXX Herd Chek ELISA for PRRSV试剂盒检测收集的400份临床血清样品。结果,用PCR扩增到了PRRSV M基因,获得了重组M蛋白,建立了用于检测PRRSV抗体的间接ELISA(M-ELISA);该M-ELISA具有良好的特异性和重复性。400份临床血清的检测结果与IDEXX试剂盒的检测结果的符合率为95.3%。上述结果表明,本研究基于表达的重组M蛋白,成功建立了检测RRSV抗体的间接ELISA。