口蹄疫病毒O型和A型交互反应性单克隆抗体的筛选与鉴定

不同血清型口蹄疫病毒(FMDV)之间不能产生交叉免疫保护,但是血清学的交叉反应确实存在。本研究旨在建立一种筛选型间交互反应性抗体的方法,以期为解析FMDV血清型间保守的抗原结构奠定基础。本方法主要依据单个B细胞抗体技术,首先采用两种不同的荧光染料FluoProbes 647H和Pacific Blue分别标记O型与A型FMDV 146S灭活抗原,然后利用流式细胞分选技术,从免疫牛外周血单个核细胞(PBMCs)中分选出结合两种抗原的特异性B细胞,通过单个B细胞抗体基因测定,获得Ig G抗体重链与轻链可变区编码序列,并将可变区基因插入含有牛IgG抗体恒定区的pcDNA3.4载体中,构建IgG抗体的重链与轻链表达质粒。将重链与轻链表达质粒共转染中国仓鼠卵巢悬浮细胞(CHO-S)进行完整抗体表达。结果显示,通过该方法获得了5株FMDV特异性单克隆抗体,其中4株(H64、R82、I16、R29)经间接免疫荧光(IFA)检测都可特异性识别O和A型FMDV;ELISA结果显示,H64、R82、I16与O、A型抗原均具有较好的亲合力;Western-blot结果显示,I16可特异性结合O、A型FMDV结构蛋白VP2中的线性表位,说明在衣壳蛋白VP2上存在血清型间保守的抗原表位,通过本研究进一步加深了对FMDV抗原结构的认识。     

猪细小病毒VP2蛋白主要抗原表位区的原核表达及检测PPV抗体的间接ELISA的建立

利用大肠杆菌表达51ku的猪细小病毒(PPV)VP2蛋白主要抗原表位区,通过Western-blot检测,表达蛋白具有良好的反应原性。利用此表达蛋白建立了检测PPV抗体的间接ELISA。通过检测32份阴性血清最终确定本ELISA的判定标准为:血清抗体效价0.18,判为PPV血清抗体阳性;血清抗体效价≤0.18,判为血清抗体阴性。此ELISA的批内重复性试验的变异系数小于5%,批间重复性试验的变异系数小于10%。用此ELISA与商品化PPV IgG检测试剂盒做符合性比较试验;结果,感染猪血清抗体检测符合率为100%,免疫猪血清抗体检测符合率为82%,非免疫健康猪血清抗体检测符合率为78%,样本总体检测符合率为80%。用建立的ELISA检测田间猪血清的PPV抗体,阳性率介于28.8%~37.5%之间,提示上述地区可能存在不同程度的PPV感染情况。本研究为PPV免疫或感染状况的检测提供了一种有用的定性诊断方法。     

口蹄疫病毒3A蛋白和FLAG标签的融合表达与血清学分析

通过对比各短肽标签,选择由8个氨基酸组成的FLAG标签弥补口蹄疫疫苗毒株OZK 3A蛋白的93～102位10个氨基酸缺失,原核表达FLAG与3A的嵌合蛋白,并命名为3AF。同时也表达了OZK毒株原始3A蛋白。分别以3A和3AF蛋白作为免疫原免疫6～8周龄雌性BALB/c小鼠,采用ELISA和Western-blot分析融合蛋白的血清学反应活性。结果表明,3A蛋白和3AF蛋白均能在大肠杆菌中有效表达,且主要以可溶性形式表达。纯化的3AF蛋白能与FLAG单抗特异性反应而未能诱导免疫小鼠产生针对该标签的抗体,体现了体外和体内的生物反应性差异。FLAG标签对3A蛋白的表达水平、表达形式等未产生显著影响。本研究为下一步FLAG标记病毒的拯救及其应用奠定了基础。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3A单克隆抗体的制备和鉴定

以原核表达并纯化的口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白3A免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,用间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞,有限稀释法进行亚克隆,获得3株能稳定分泌抗3A蛋白单抗的杂交瘤细胞,分别命名为3H2、4B1、7F5,并对这3株单抗进行了生物学鉴定。结果显示,单抗3H2和4B1为IgG2a亚型,7F5为IgG2b亚型。单抗7F5针对的表位与3H2和4B1两株单抗的表位不一致;这3株单抗均能够与FMDV特异性结合,且单抗4B1与所有3A相关蛋白均反应。稳定性鉴定结果表明,获得的3株杂交瘤细胞均能稳定分泌单克隆抗体。研究结果为进一步探索3A蛋白的结构和功能以及建立诊断方法奠定了基础。     

细胞自噬相关蛋白ATG9A对口蹄疫病毒侵入的影响

为揭示细胞自噬相关蛋白9A(ATG9A)对口蹄疫病毒（FMDV）复制的影响,利用IFA、RT-qPCR和Western-blot等方法检测FMDV与ATG9A的共定位情况以及病毒感染对ATG9A的影响;通过构建ATG9A重组表达质粒和合成小干扰RNA,检测过表达及敲降ATG9A对FMDV吸附、内化、基因组复制、蛋白翻译、子代病毒粒子产生的影响。结果显示,FMDV感染后与ATG9A共定位且抑制ATG9A的表达;ATG9A不影响FMDV的吸附,但极显著地抑制FMDV的内化过程;同时,过表达（或干扰）ATG9A能够在RNA与蛋白水平显著降低（或提高）FMDV的增殖和子代病毒粒子产生的能力。结论,ATG9A抑制FMDV的复制,为深入认识FMDV在细胞内的复制周期提供了线索。     

口蹄疫病毒2C''3AB基因重组杆状病毒的构建及其表达

将含有口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白2C部分基因编码区及3AB完整基因编码区的基因片段2C'3AB重组于杆状病毒穿梭质粒pMelBac-B,经PCR、酶切及序列分析鉴定正确后,命名为pMel-2C'3AB.将重组穿梭质粒pMel-2C'3AB与杆状病毒骨架共转染Sf9昆虫细胞,通过噬斑筛选及PCR鉴定,构建了含有目的基因的重组杆状病毒.用该病毒感染High Five细胞,细胞裂解液的SDS-PAGE电泳结果显示,出现一约为43ku的蛋白带,与预期大小一致;Western-blotting结果表明,该表达产物能被FMDV阳性血清及2C'3AB单克隆抗体识别;间接ELISA结果显示,表达的目的蛋白能与牛、羊、猪的O型FMDV阳性血清发生特异性反应.证实,FMDV 2C'3AB基因在昆虫细胞中得到了表达,且表达产物具有良好的反应活性.