FN-EIIIA肽段表达与皮肤损伤时间推断研究

目的 在mRNA研究的基础上,研究大鼠皮肤挫伤后含EIIIA□段的Fn蛋白水平表达与损伤时间关系。方法片段特异性单克隆抗体免疫组织化学染色。结果伤后6h表皮细胞、毛囊上皮细胞等出现棕黄色阳性染色颗粒,并随损伤时间延长染色加深。结论Fn-EIIIA片段检测可用于法医学生前伤确认和损伤时间推断。     

人皮肤成纤维细胞早期损伤后EDA-FN表达与损伤时间的关系

目的探讨培养的人体皮肤成纤维细胞损伤后纤维连接蛋白EDA片段的表达情况与损伤时间的关系。方法培养人体皮肤成纤维细胞,利用单克隆抗体进行免疫组织化学染色及Western检测。结果培养中的人体成纤维细胞可以微量表达EDA,随损伤时间延长而表达量增加。结论EDA片段表达变化可以作为法医学早期损伤时间推断的比较理想的指标。     

大鼠皮肤损伤后纤维连接蛋白剪接异型体的表达

运用地高辛标记纤维连接蛋白 (FN)特殊位点的探针 ,通过原位杂交方法检测不同损伤时间大鼠皮肤各型FN剪接异型体的表达情况 ,结果发现 :伤后大鼠皮肤各型FN的表达随时间呈增高趋势 ;伤后 30～ 6 0min表达出正常皮肤中没有的EⅢA、EⅢB片段。FN的这一特性为法医学诊断生前、死后伤和伤后存活时间推断提供了新指标。     

IL-33在小鼠皮肤创伤后损伤时间推断中的作用

目的通过观察白细胞介素-33(interleukin-33,IL-33)在皮肤创伤后的时序性变化规律,探讨IL-33在法医学实践中用于损伤时间推断的应用价值。方法利用直径为5mm的圆形锉刀在小鼠背部建造皮肤损伤模型,于伤后1h、3h、6h、12h、1d、3d、5d、7d、10d取损伤处组织,对照组在与创伤组小鼠相同部位取同等大小的皮肤样本。采用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色法观察皮肤创伤后愈合过程中的形态学变化,通过Western印迹法、免疫组织化学染色和双重免疫荧光染色法检测皮肤创伤样本IL-33的表达变化。结果Western印迹法结果显示,伤后3h,IL-33蛋白表达稍有下降,6h后IL-33蛋白表达逐渐增加,于伤后3d达峰值,随后逐渐减少。免疫组织化学染色结果显示,在对照组皮肤的表皮、毛囊、皮脂腺及真皮中固有细胞有少量IL-33阳性表达,伤后3h,IL-33阳性细胞率开始增加,伤后3d达到峰值,随后逐渐减少。双重免疫荧光染色结果显示,伤后1~3d,IL-33阳性表达细胞主要为巨噬细胞,伤后5~7d,IL-33阳性表达细胞主要为肌成纤维细胞。HE染色结果显示该皮肤损伤模型创口愈合过程符合炎症的病理学发展规律。结论IL-33有望成为法医学推断皮肤损伤时间的参考指标。     

大鼠皮质神经细胞缺氧缺糖损伤后MAP-2表达变化规律

目的观察原代培养大鼠大脑皮质神经细胞缺氧缺糖（OGD）损伤24h内的形态学及微管相关蛋白2（MAP-2）表达变化。方法使用出生1-2d的Wistar大鼠,取大脑皮质神经细胞进行原代培养,用连二亚硫酸钠加低糖培养基制作神经细胞OGD损伤模型,损伤后应用倒置显微镜观察形态学变化,Western印迹法观察MAP-2蛋白表达变化。结果原代培养大鼠大脑皮质神经细胞OGD损伤后1h,少数神经细胞突起缩短;伤后6-12h神经细胞胞体明显皱缩,多数细胞突起缩短或消失;伤后24h神经细胞形态部分恢复,部分突起重新出现。Western印迹法显示,MAP-2在神经细胞OGD损伤后1h表达降低,伤后12h达低谷,24h表达升高。结论 OGD损伤后,原代培养大鼠大脑皮质神经细胞的形态及MAP-2表达随时间呈现一定的规律性变化。     

皮肤成纤维细胞纤维连接蛋白及其EDA、EDB表达与损伤时间的关系

目的研究培养的皮肤成纤维细胞纤维连接蛋白(fibronectin,FN)及其可变剪接片段EDA、EDB在损伤后的mRNA水平,为推断早期损伤时间提供参考指标。方法培养人体皮肤成纤维细胞,换无血清培养液培养24h后,采用划痕法制作细胞损伤模型,损伤后0、0.5、1、2、6、24h收集细胞,抽提RNA,实时RT-PCR定量检测总FN及其EDA、EDB的mRNA水平的变化。结果皮肤成纤维细胞中总FN及其EDA、EDB的mRNA水平随损伤时间的延长而升高,EDA mRNA在损伤后1h达到高峰,EDB mRNA在损伤后6h达到高峰,FN mRNA在损伤后2h达到高峰;在损伤1h后总FN及其EDA、EDB的mRNA表达变化随时间的延长而呈现一种不断上升的趋势。结论纤维连接蛋白EDA、EDB可作为早期损伤时间推断的较理想的参考指标。     

大鼠局灶性脑挫伤后p35及p25的表达变化

目的探讨大鼠局灶性脑挫伤后脑中p35和p25表达变化的时间规律性,为脑损伤时间推断提供更多依据。方法50只成年雄性SD大鼠随机分为损伤即刻(0h)组,伤后6h、12h、24h、3d、5d、7d、10d组,同时设立正常组和假手术组,每组5只,建立大鼠局灶性脑挫伤模型,运用HE、免疫组织化学染色及Western印迹法等方法检测损伤不同时间后损伤周边区脑组织p35及p25的蛋白表达。结果正常组和假手术组蛋白表达较多p35和少量p25。在局部脑挫伤后,p35随时间呈现单峰变化,p25随时间呈现双峰变化。结论大鼠局灶性脑挫伤后p35和p25的表达呈现不同规律性并有较好的时间相关性,可为脑损伤时间推断提供较好的依据。     

大鼠局灶性脑挫伤后Homer蛋白表达变化

目的 观察局灶性脑挫伤后Homer蛋白表达的变化规律,探讨其表达变化与损伤时间的相关性.方法 建立大鼠钝力性局灶性脑挫伤模型,应用免疫组织化学技术和Western印迹法观察脑损伤后不同时间脑组织中Homer蛋白表达的变化.结果 对照组、假手术组及伤后0.5h组脑组织中有少量Homer蛋白染色阳性细胞,伤后3h组脑组织H...     

大鼠脑液压冲击伤caspase-8的表达

目的探讨大鼠脑损伤后caspase-8表达情况,为脑损伤的诊断及损伤时间推断提供依据。方法建立大鼠脑液压冲击伤模型。用免疫组化与图像分析技术分别检测伤后15,30min和1,3,6,12h及1,4,7,14d大鼠皮质、丘脑、海马等部位caspase-8的表达。结果发现伤后30min大脑皮质和海马caspase-8开始出现表达,随时间增加其表达亦逐渐增加,伤后3h显著增加,24h达到高峰,4d后逐渐减少,14d基本恢复正常;而丘脑在伤后1h才开始出现阳性表达,伤后6h出现明显表达,24h达到高峰,4d后逐渐减少,14d基本恢复正常。同时发现损伤对侧海马及丘脑出现相应的变化规律。结论caspase-8阳性表达的变化规律可作为脑损伤诊断及损伤时间推测的指标之一。     

小鼠皮肤切创愈合过程中大麻素Ⅰ型受体表达

目的探讨小鼠皮肤切创愈合过程中损伤区大麻素Ⅰ型受体（cannabinoid receptorⅠ,CB1R）的表达及不同时间的变化规律。方法应用免疫组织化学和Western印迹法检测小鼠皮肤切创后不同时间段CB1R的变化情况。结果正常组织中有少量CB1R的表达,位于表皮、毛囊、皮脂腺、皮肌层。伤后6～12 h,中性粒细胞不表达CB1R,伤后1～5 d,阳性染色以单核细胞和成纤维细胞为主。伤后7～14 d,CB1R阳性着色以成纤维细胞为主。阳性细胞率6h～3d逐渐升高,5d达到高峰,7～14d逐渐降低。经Western印迹法显示各个时间段均有CB1R的阳性条带,其中5d为CB1R表达的高峰。结论在皮肤损伤愈合过程中CB1R被激活,CB1R表达于单核细胞,可能参与炎症反应,CB1R在损伤周边区表达于成纤维细胞,可能参与皮肤损伤后的愈合,其变化规律可用于损伤时间的推断。     

大鼠脑损伤后EPO及其受体表达与损伤时间的关系

目的研究大鼠脑损伤后脑组织中促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)及其受体(erythropoietin receptor,EPOR)的表达与损伤时间的关系。方法 72只SD大鼠随机分为对照组(36只)、脑损伤组(36只),在建模后1、2、4、8、12、24 h每组各取6只大鼠处死,取挫伤部位脑组织,应用实时荧光定量PCR和Western印迹法检测不同时间点EPO以及EPOR的mRNA表达和蛋白表达情况。结果伤后24h内,EPO及EPOR的表达随损伤时间的增加而呈上升趋势。EPO的mRNA及蛋白表达与损伤时间之间存在相关性,其相关系数分别为0.875、0.911(P0.05);EPOR的mRNA及蛋白表达与损伤时间之间存在相关性,其相关系数分别为0.936、0.905(P0.05)。结论大鼠颅脑损伤早期EPO及EPOR的表达呈逐步上升趋势,与损伤时间具有相关性,可以作为脑损伤时间推断的参考。     

大鼠皮肤创伤后EⅢA-FNmRNA表达与损伤时间推断研究

目的研究皮肤创伤后不同时间纤连蛋白剪接方式变化及EⅢA剪接异型体的表达。方法提取伤区组织总RNA,RT-PCR方法扩增目的条带。结果大鼠皮肤损伤后表达出正常组织中没有的EⅢA+(526bp)片段,其中伤后1h该条带肉眼可辨认,在伤后24h内,随损伤时间延长其条带亮度相应升高。结论EⅢA-FN剪接异型体表达变化可为法医学损伤时间推断较理想指标。     

FN－Ⅲcs在皮肤切创中的表达与损伤时间关系

目的研究纤维连接蛋白可变剪接片段Ⅲcs在不同损伤时间皮肤中的表达,为早期损伤时间的判定指标提供实验依据.方法DIG标记反意RNA探针,以原位杂交的方法检测大鼠和人体皮肤在损伤早期FNⅢcs表达的变化.结果(1)人体及大鼠皮肤损伤后30min皮肤网状层的毛囊、皮脂腺、血管内皮层中表达FNⅢcs的阳性细胞数开始增多,至伤后6h达到高峰,以后又逐渐减少.(2)人体皮肤FNⅢcs表达的部位与大鼠有明显的差异.结论FNⅢcs的原位检测可望成为判断早期损伤时间的有用指标;为FNⅢcs在创伤修复中的合成方式、部位和作用的研究提供了实验基础.     

小鼠皮肤切创愈合过程中caspase-6、-7表达的免疫组织化学研究

目的　观察皮肤切创损伤愈合过程中 ,caspase 6、 7在损伤周边区内的表达及其变化规律。方法　应用免疫组织化学技术观察伤后不同时间小鼠皮肤切创组织中caspase 6、 7的表达 ,以非切创小鼠皮肤组织作对照。 结果　伤后 6h的损伤皮肤组织中可见少量多核粒细胞表达caspase 6、 7,伤后 12～ 2 4h ,大部分浸润的多核粒细胞及部分单核细胞为caspase 6、 7阳性。随伤后时间延长 ,caspase 6、 7阳性细胞以单核细胞及成纤维细胞为主。伤后 0～ 3h ,caspase 6、 7阳性细胞比率较低 ,12h后逐渐增加 ,伤后 3d达高峰 ,其后逐渐下降。 结论　小鼠皮肤损伤愈合过程中 ,caspase 6、 7在损伤周边区内中性粒细胞 ,单核细胞及成纤维细胞中表达 ,其时序性变化规律可望用于皮肤损伤时间的推断。     

大鼠皮肤挫伤后NF-KB mRNA表达与损伤时间关系

目的 应用实时定量PCR技术检测大鼠皮肤挫伤后NF-～B mRNA时序性表达规律,分析其与损伤时间的关系.方法 制备大鼠皮肤挫伤模型,于伤后0.5,1,6,12,18,24,30h取材,一步法提取总RNA,检测其完整性和浓度,按照0.4μg总RNA量逆转录合成第一链cDNA,以rip32为内参基因进行荧光定量检测,采用JACt法比较其与正常皮肤组织NF-kB mRNA表达的倍数关系.结果 皮肤挫伤组织中NF-KB mRNA伤后0.5h表达显著增强(P<0.05),6h出现高峰,12h降至正常水平,随后略有回升.结论 大鼠皮肤挫伤组织NF-KB mRNA的表达,随着损伤经过时间的延长呈规律性变化.     

人皮肤组织刺、切创后IL-8表达的免疫组织化学研究

为探讨人皮肤刺、切创后白细胞介素 8(interleukin 8,IL 8)在推断皮肤损伤时间中的应用价值 ,本研究应用免疫组化技术对 5 2例不同损伤时间人体皮肤刺、切创组织中IL 8的表达进行了研究。伤后 4h的损伤皮肤组织中可见部分的多核粒细胞表达IL 8。伤后 12～ 2 4h ,大部分浸润的多核粒细胞及部分单核细胞为IL 8阳性。随伤后时间延长 ,IL 8阳性细胞以单核及成纤维细胞为主。伤后 4～ 6h的皮肤中 ,IL 8阳性细胞比率较低 ,为 16 0±10 1%。伤后 1～ 4d达高峰 ,为 5 9 6± 8 7%。其后逐渐减少。本研究结果表明 ,IL 8的表达可用于皮肤刺、切创后损伤时间的推断。     

大鼠原发性脑干损伤后S100B和GFAP的表达变化

目的观察大鼠原发性脑干损伤后脑干组织中S100B、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillory acidic protein,GFAP)的表达变化,探讨其与脑干损伤时间的变化规律及在损伤中的作用机制。方法建立机械性打击脑干损伤动物模型,利用HE染色、Gless嗜银染色和SP免疫组织化学法观察脑干组织中S100B、GFAP在损伤后不同时间的表达,并应用图像分析技术对其进行统计学分析。结果 S100B阳性表达于伤后30 min开始增多,随时间延长逐渐升高,于24 h达到高峰后开始下降,并于72 h基本降至正常水平;GFAP阳性表达于伤后30 min开始升高,48 h达到高峰后开始下降,但仍高于对照组。结论原发性脑干损伤后S100B、GFAP的表达具有时间规律性,在原发性脑干损伤时间的推断及神经修复过程中具有一定的作用。     

小鼠皮肤切创愈合过程中caspase-8表达的研究

目的检测皮肤切创愈合过程中caspase-8的表达,探讨用caspase-8表达的规律推测皮肤损伤时间。方法建立小鼠皮肤切创模型,应用免疫组织化学技术和Western blot方法检测切创后不同时间皮肤中caspase-8的表达,以未切创小鼠皮肤组织作对照。结果伤后12~24h的损伤皮肤组织中部分单核细胞表达caspase-8。随伤后时间延长,caspase-8阳性细胞以单核细胞及成纤维细胞为主。结论伤后3~6h,caspase-8阳性细胞比率较低,12h后逐渐升高,3d达到高峰,以后逐渐下降。实验组中,1、3、5、7d组可见明显的caspase-8活化片段,位于分子量Marker44/42处。结论小鼠皮肤切创愈合过程中,caspase-8在损伤区单核细胞及成纤维细胞中表达,其时序性变化规律可望用于皮肤损伤时间的推断。     

大鼠 Fn剪接异型体分布及皮肤损伤后表达研究

目的研究成年大鼠、新生幼鼠纤维连接蛋白剪接异型体 EⅢ A、 EⅢ B体内分布及皮肤切创、挫伤后表达情况 , 以期为法医学损伤经历时间研究探索新指标及选择阳性对照 . 方法组织匀浆后抽提总 RNA, 逆转录聚合酶链反应 ( RT- PCR) 技术扩增目标条带 . 结果 (1)正常皮肤 EⅢ A+ 、 EⅢ B+ 不表达 , 伤后 18h EⅢ A+ 位点高丰度表达 , EⅢ B+ 位点变化不明显 , 两种致伤方式表达结果差别不大 ; (2)成年大鼠各器官分布情况依次为脑、心、肝 . 结论 EⅢ A+ 可作为皮肤损伤研究的敏感指标 .     

皮肤切创愈合中caspase-3表达的免疫组化研究

目的探讨皮肤切创损伤愈合过程中,caspase-3在损伤区内的表达以及不同损伤时间caspase-3的变化规律。方法应用免疫组织化学技术对33例不同损伤时间小鼠皮肤切创组织中caspase-3的表达进行研究。同时以3例非切创小鼠皮肤组织做对照。结果伤后6h的损伤皮肤组织中可见少量中性粒细胞表达caspase-3,伤后12～24h,大部分浸润的中性粒细胞及部分单核细胞为caspase-3阳性。随伤后时间延长,caspase-3阳性细胞以单核细胞及成纤维细胞为主。伤后0～3h,caspase-3阳性细胞比率较低,为(4.53±6.53)%,12h后逐渐增加,伤后3d达高峰,为(62.66±4.84)%,其后逐渐下降。结论小鼠皮肤损伤愈合过程中,caspase-3可能在诱导损伤区内中性粒细胞、单核巨噬细胞及成纤维细胞发生凋亡过程中发挥重要作用,同时,caspase-3的规律性表达可用于损伤时间的推断。