弓形虫HAD2b基因缺失株的构建及生物学功能研究

弓形虫是一种很成功的专性细胞内寄生的机会性致病原虫,可感染几乎所有温血动物,导致的弓形虫病是一种重要的人兽共患寄生虫病,目前尚无有效的疫苗。为了研究弓形虫卤代酸脱卤酶(haloacid dehalogenase,HAD)家族中一个保守蛋白HAD2b的功能,本研究通过利用CRISPR/Cas9技术成功构建了弓形虫Ⅰ型RH虫株HAD2b基因缺失株(RHΔHAD2b)。通过噬斑试验分析发现,RHΔHAD2b形成的噬斑大小和数量与野生株相比无显著差异。通过逸出试验发现,大部分RHΔHAD2b和野生株在钙离子的刺激下,在2 min内完成逸出,差异不显著。小鼠毒力试验发现,昆明鼠分别感染RHΔHAD2b和野生株后均在7～10 d内死亡,无显著差异。对HAD2b基因转录组数据库现有数据分析表明,HAD2b在弓形虫RH株的表达量显著低于其它虫株,说明HAD2b在不同虫株可能发挥不同的功能。本研究成功构建了弓形虫HAD2b基因缺失株(RHΔHAD2b),为进一步研究HAD2b基因在Ⅰ型虫株的其它生物学功能奠定了基础,也为构建弓形虫其它基因型虫株的HAD2b基因缺失株奠定了技术基础。     

三株胸膜肺炎放线杆菌基因缺失株免疫原性的研究

为深入研究猪传染性胸膜肺炎基因工程弱毒活疫苗的生物学特性和免疫原性,分别以本实验室构建的血清7型胸膜肺炎放线杆菌(APP)基因缺失株apxⅡC-/Kan+、apxⅡC-/ⅠN+和血清5型APP的基因缺失株SW1ΔⅠC为研究对象,对其进行研究。溶血活性试验证实,突变株完全失去了溶血活性。细胞毒性试验证实,缺失株SW1ΔⅠC的细胞毒性完全丧失,缺失株apxⅡC-/Kan+和apxⅡC-/ⅠN+有轻微的细胞毒性。遗传稳定性试验证实,3株缺失株在体内传5代均不会发生回复突变。毒力试验结果显示,基因缺失株apxⅡC-/Kan+、apxⅡC-/ⅠN+和SW1ΔⅠC对小鼠的半数致死量分别为亲本株的5倍、7倍和15倍。3株缺失株分别免疫小鼠后,以10LD50血清1型、5型和7型APP的剂量攻毒,小鼠的保护率可达100%。试验结果表明,3株缺失株的毒力明显降低,并能提供有效的保护力。本研究为进一步以突变株为基因工程弱毒活疫苗的研究奠定了一定基础。     

弓形虫病免疫的研究——自然弱毒株(QHO)免疫原性的观察

本文描述了弓形虫自然弱毒株(QHO)速殖子不经任何理化处理,以敏感模式动物小白鼠进行的适宜免疫剂量、有效免疫力产生的时间、适宜攻击剂量和免疫持续期等项试验。结果用QHO株10~1～10~5免疫剂量存活率分别为100％、70％、100％、90％、80％;免疫后第14天即可产生免疫力,免疫后的小鼠可经受10~1～10~4以上强毒攻击,保护率达90％以上,免疫后小鼠经120天以上持续期观察和抗体消长规律测定都可经受10~5大剂量强毒攻击,保护率达90％,抗体滴度一直维持在高滴度水平(滤纸IHA法1:32)。证实QHO株是一种典型的弱毒株,并具有较好的免疫原性和激发机体产生明显的免疫保护效应,是许多弓形虫(RH、GJS、M-7741、GT-1等株)所不能相媲的一种特异弱毒虫株。为进一步研究弓形虫的生物学特性和弱毒株虫苗提供了依据。     

华南地区黑冠松鼠猴(Saimiri vanzolinii)弓形虫虫株的分离鉴定

采用基于弓形虫虫株529 bp重复序列的PCR方法对采集的病料进行弓形虫分子鉴定。将该弓形虫阳性病料匀浆接种于BALB/c小鼠腹腔,经连续传代分离获得弓形虫速殖子。同时,根据弓形虫B1基因的PCR方法对该分离虫株进行鉴定,扩增出弓形虫B1基因特异条带。测序结果表明,此虫株扩增片段基因序列与GenBank中的弓形虫B1(AF179871)基因序列完全一致。通过PCR-RFLP分型鉴定,所分离的SS弓形虫虫株与传统Ⅰ型RH株、Ⅱ型PRU株和Ⅲ型VEG株的酶切谱系均有所不同,同时与Chinese#1型也有所不同,其被判定为国内另一种独特基因型弓形虫虫株,这为国内乃至华南地区弓形虫基因库的建立收集了样本,也为下一步野生动物弓形虫检测和防控提供了依据。     

猪源弓形虫的分离鉴定及基因型的研究

本研究的目的是分离鉴定江西省某猪场猪感染的弓形虫虫株并研究其多位点基因型。以江西省某猪场病死的后备母猪肺门淋巴结为材料,经触片、瑞氏染色,镜检可见弓形虫滋养体;将该阳性病料腹腔接种BALB/c小鼠,经连续传代分离得到弓形虫虫株(命名为TgPJX13),用基于B1基因的半巢式PCR方法对该分离虫株进行鉴定,得到弓形虫的特异条带。测序表明,TgPJX13株扩增片段序列与NCBI中的弓形虫B1基因序列完全一致。用PCR-RFLP方法在11个基因位点(其中SAG1、SAG2、SAG3、5′+3′SAG2、BTUB、GRA6、c22-8、c29-2、L358和PK1为核基因位点,Apico为顶质体基因位点)对TgPJX13虫株进行基因型鉴定,确定该虫株的基因型为ToxoDB#9。弓形虫TgPJX13株的成功分离和鉴定为进一步研究其毒力及生物学特性奠定了基础。     

副猪嗜血杆菌5型galE基因缺失株HPS-YA-008ΔgalE的构建及鉴定

为构建副猪嗜血杆菌5型galE基因缺失株,本研究通过重叠PCR构建了galE基因的上、下游同源臂,然后将其连接到pRE112载体而构建了重组自杀性质粒pRE112ΔgalE;使重组质粒pRE112ΔgalE转化大肠杆菌X7213,与副猪嗜血杆菌接合转移,应用两步法筛选galE基因缺失株HPS-YA-008ΔgalE,用PCR方法验证galE基因的缺失突变。在此基础上进一步研究galE基因缺失株HPS-YA-008ΔgalE的生长特性、药物敏感性、对保育猪的毒力等生物学特性。结果,副猪嗜血杆菌血清5型galE基因缺失株HPS-YA-008ΔgalE构建成功,且缺失株的毒力已经被致弱,对药物的敏感性增加。本试验的研究结果为研制更加安全的副猪嗜血杆菌弱毒疫苗提供了实验材料。     

弓形虫中含WD40结构域蛋白TGME49＿228400的生物学功能研究

利用CRISPR/Cas9技术成功构建了弓形虫Ⅱ型Pru虫株的TGME49＿228400定位株和缺失株（PruΔ228400）,研究了TGME49＿228400在弓形虫中的亚细胞定位和基本生物学功能。Western-blot结果显示TGME49＿228400蛋白大小为69.9 ku。间接免疫荧光检测显示,TGME49＿228400定位于顶质体,TGME49＿228400缺失后对弓形虫顶质体的形态无影响。与Pru野生株相比,TGME49＿228400缺失株形成噬斑和增殖的能力均显著减弱（P<0.01）,而入侵、逸出、体外缓殖子转化能力和对小鼠的毒力无显著差异（P>0.05）。本研究结果可为后续阐明弓形虫中其他含WD40结构域蛋白的功能和作用机制奠定基础。     

刚地弓形虫强弱毒株速殖子抑制消减cDNA文库的构建和初步分析

为筛选刚地弓形虫的毒力相关基因,以弓形虫为研究对象,构建了弓形虫强弱毒株抑制消减Cdna文库.分别收集弓形虫Ⅰ型RH株和Ⅱ型QHO株速殖子,提取总RNA,纯化后获得mRNA,并反转录为cDNA,用抑制消减杂交技术(SSH)构建弓形虫强弱毒株正向消减(弱毒株消减强毒株)及反向消减(强毒株消减弱毒株)cDNA文库.从两文库中各筛选10个阳性克隆测序及进行在线BIAST分析.结果显示,构建的弓形虫强弱毒株的消减cDNA文库具有较强的特异性;在获得的18个有效表达序列标签中,有12个与已报道的基因有较高相似性,另外6个可能代表新基因.表明,弓形虫强弱毒株差异表达消减cDNA文库的成功构建,为进一步研究弓形虫毒力相关基因的功能奠定了基础.     

弓形虫NT株回猪和在猪体内包囊分布的初步观察

1977年在我国高热病猪中发现了爆发性弓形虫病。1979年又在我国高热病猪中发现了弓形虫包囊弱毒株,接种猪只不引起死亡;接种小白鼠不产生症状,但在脑内可形成包囊。由于这株虫株是在江苏南通县的病猪中分离的,故定名为弓形虫南通包囊弱毒株,简称NT株。为了证实NT株在猪体内,是否与在小白鼠体内一样可形成包囊,因此将猪源小白鼠传代的NT株作了回猪试验。     

磺胺嘧啶对弓形虫在继代小鼠体内包囊形成的影响

用模式动物小白鼠继代弓形虫(Toxoplasmagondii)的过程中,随着继代次数增加,虫体毒力也随之增强,尤其弱毒虫株在继代过程中更为突出,随着继代次数和毒力的增强,鼠体内弓形虫包囊形成之前小鼠常发生死亡,从而给虫株包囊的研究带来一定的困难。据报道,国外研究者为获取弓形虫包囊,在继代小鼠的饮水中加入磺胺嘧啶(SD),可保证小鼠存活至组织包囊形成,但对饮服SD的浓度和时间未详细报道。为了确定不同浓度、不同饮服时间对小鼠体内弓形虫包囊形成及其毒力的影响,特进行了本试验。 (一)材料和方法 1.弓形虫QHO株组织包囊:弓形虫QHO株由本课题组分离继代培养。取预先接种弓形虫QHO株的小白鼠,引颈处死,取其含弓形虫包囊的脑组     

布鲁氏菌bp26基因缺失株的构建

选择含有反向筛选基因sacB标记的pRE112质粒为自杀载体,利用等位基因交换的方法成功敲除了布鲁氏菌弱毒疫苗S19株、S2株、M5株的bp26基因,构建了具有非抗性基因标记的缺失株S19-Δbp26、S2-Δbp26、M5-Δbp26。将构建的重组自杀质粒pRE-Δbp26(缺失了bp26基因的681个碱基)电转化入布鲁氏菌后,经过5μg/mL氯霉素筛选单交换子和70g/L蔗糖筛选同源重组双交换子,用菌落PCR及DNA测序的方法进行验证。结果表明,bp26基因的缺失改造成功,连续传20代后菌落PCR及DNA测序的结果显示突变株具有遗传稳定性。以pRE112自杀质粒为基础构建无抗性基因标记的布鲁氏菌缺失株为布鲁氏菌的基因功能研究奠定了基础,同时Δbp26缺失株的构建可为新型布鲁氏菌疫苗的研制奠定基础。     

鼠伤寒沙门菌SL1344株分泌性蛋白K1缺失株的构建及其生物学特性的初步研究

为研制更加安全有效且遗传背景清晰的鼠伤寒沙门菌(S.typhimurium)疫苗弱毒株,本研究首先构建了含缺失1 011 bp sseK1基因的重组自杀性质粒PREΔsseK1,利用重组自杀性质粒介导的等位基因交换技术,两步法筛选SL1344的sseK1缺失株。PCR、双酶切及测序结果表明SL1344ΔsseK1构建成功。生物学特性初步研究表明,与亲本菌株SL1344相比,缺失株SL1344ΔsseK1保留了亲本株SL1344的血清型1,4,5,12∶i∶1,2,且能够稳定遗传缺失后的sseK1基因,生长速度及生化特性没有发生明显改变。小鼠毒力试验表明,SL1344ΔsseK1缺失株口服感染6周龄BALB/c小鼠的LD_(50)为6.63×10~8CFU,毒力较亲本株SL1344下降至0.048%。免疫保护效力试验显示,小鼠免疫后第14天血清抗体Ig G含量达到最高,运用鼠伤寒沙门菌野生毒株对免疫后第17天的小鼠攻毒有62.5%的保护率。以上研究结果表明,SL1344株sseK1基因缺失株构建成功,且遗传稳定,毒力明显降低,具有较好的免疫原性,为研究sseK1基因的致病机制及将其开发为更加安全有效的沙门菌弱毒疫苗候选菌株奠定了基础。     

五株基因缺失的肠炎沙门菌免疫原性的研究

为了探讨ompR、spiA、rpoS、ompR-spiA、ompR-rpoS基因缺失株成为肠炎沙门菌减毒候选活疫苗的可能性,构建了3株rpoS、ompR-spiA、ompR-rpoS基因缺失株,通过口服方式把5株ompR、spiA、rpoS、ompR-spiA、ompR-rpoS基因缺失株接种BALB/c小鼠进行毒力测定和免疫保护性测定。结晶紫染色定量法显示,这5株基因缺失株生物被膜的形成能力显著降低;毒力测定显示,它们的半数致死量比野生株的高10 000倍,双基因缺失株的毒力更弱。血清抗体水平测定表明,各基因缺失株可诱导机体产生较高的IgG抗体,并于注射后第3周达到高峰;攻毒后ompR、spiA、rpoS、ompR-spiA和ompR-rpoS基因缺失株的免疫保护率分别为62.5%、50.0%、50.0%、50.0%和37.5%。结果表明,ompR基因缺失株可作为肠炎沙门菌减毒活疫苗的候选株。     

传染性腔上囊病病毒超强毒致弱株GZ20 VP2 基因的克隆和序列分析

根据已发表的52/70株传染性腔上囊病病毒(IBDV)基因组序列,设计并合成了一对特异扩增IBDV VP2基因的引物.以超强毒IBDV(vvIBDV)致弱株GZ20基因组为模板利用RT-PCR技术扩增出了1.5kb的cDNA产物,将VP2基因克隆于pUC119质粒上,得到重组pUC119质粒.并对VP2基因全序列测定,序列分析和聚类分析表明,该致弱株与无毒疫苗株PBG98和弱毒株CU-1非常相似,而与经典强毒株、超强毒株和变异株相差较大.这提示该致弱株属于标准血清Ⅰ型弱毒株.     

应用三磷酸核苷水解酶基因检测弓形虫方法的建立

用Primer Explorer V4软件针对弓形虫三磷酸核苷水解酶(NTPase)基因设计了6条环介导等温扩增(LAMP)特异性引物,建立弓形虫LAMP反应体系,并进行特异性和敏感性试验。结果显示,用该反应体系30 min即可检测出弓形虫NTPase基因,产生瀑布状的特异性条带,检测极限为20 copies,敏感性比PCR高10倍。与犬新孢子虫、鹦鹉热衣原体、柔嫩艾美耳球虫、吕氏泰勒虫、羊巴贝斯虫未定种和牛巴贝斯虫间无交叉反应,且重复性良好。应用此方法,可以在攻虫后第2天于试验猪血液中检测出弓形虫,比PCR方法提前2 d。表明将弓形虫NTPase基因作为环介导等温扩增检测弓形虫的目的基因,具有特异性强、敏感性高的特点,是快速诊断弓形虫病的一种新方法。     

弓形虫单克隆抗体试剂的研究——应用RIHA及IHA法对弓形虫感染兔、羊循环抗原和抗体的检测

应用抗弓形虫单克隆体(McAb)致敏绵羊红细胞建立的反向间接血凝诊断法(RIHA)和间接血凝诊断方法(IHA),对人工感染弓形虫的兔、羊血清进行了循环抗原(CAg)和抗体(Ab)检测。结果表明,弓形虫弱毒(QHO)株和强毒(RH)株感染的兔和羊血清,用RIHA检出CAg的时间在感染后1～2天,平均4天;IHA检出Ab的时间在感染后8～16天,平均12天。用毒力不同的弓形虫感染后,CAg检出时间有一定差异:QHO株感染的兔平均5.3天,羊平均6.25天;RH株感染的兔平均2.3天,羊为1天。兔、羊CAg的阳性检出率均为100％。兔、羊血清CAg于感染后23～66天先后消失,而Ab滴度长期维持在一定高度(1:64～1:4096)。证明RIHA方法对不同毒力弓形虫感染的动物血清CAg可以达到早期诊断的目的。为弓形虫病急性期和早期现症感染提供了可靠的诊断方法和手段。     

弓形虫profilin蛋白基因的克隆表达及序列分析

为研究弓形虫profilin(prf)蛋白基因的遗传变异规律和表达产物的反应原性,以9个来源于不同宿主和地方的弓形虫虫株基因组DNA为模板,利用PCR方法扩增该基因并测序。将测序结果与从ToxoDB网站下载的4株弓形虫序列一起进行比对分析,用最大简约法绘制系统发育树。再以弓形虫RH株虫体总RNA为模板,使用RT-PCR方法扩增prf基因片段,并将其克隆到原核表达载体pET-30a(+)中,转化入表达菌BL21(DE3)后,使用IPTG进行诱导表达,应用Western-blot对重组蛋白的反应原性进行分析。同时,将弓形虫RH株prf基因编码区序列翻译成氨基酸序列,利用生物信息学软件对其亲疏水性、跨膜结构域、二级结构及B细胞抗原表位进行分析。结果显示,9个弓形虫虫株的prf基因长度均为3 552bp,一致性大于99.5%。系统发育树分析表明,弓形虫虫株的聚类没有规律。SDS-PAGE和Western-blot分析结果显示,Profilin蛋白的分子质量约为30ku,且反应原性较好。蛋白结构预测结果显示,该蛋白含有4个亲水区,无跨膜区,7个α螺旋,8个β折叠,4个β转角,2个无规则卷曲和7个线性B细胞抗原表位。本研究结果表明,弓形虫prf基因可作为抗弓形虫疫苗候选分子。     

表达IBDV VP2蛋白的重组弱毒肠炎沙门菌的构建及其免疫原性的初步研究

为研究肠炎沙门菌rfaH基因与致病性的关系及肠炎沙门菌rfaH基因缺失株作为疫苗载体的可行性,进一步探索传染性法氏囊病(IBD)的防控路径,通过λ-Red同源重组的方法构建了缺失rfaH基因的肠炎沙门菌(rSD),再以其为亲本菌株构建了稳定表达IBDV VP2蛋白的重组肠炎沙门菌(Se-VP2)。以1日龄SPF雏鸡为实验动物,分别检测了重组菌的致病力及免疫效果。结果显示,rSD株和Se-VP2株与野生株生长速度一致,体外连续传20代,基因缺失株和重组株均可稳定遗传;Western-blot表明,Se-VP2株可稳定表达VP2蛋白;构建的重组菌rSD株和Se-VP2株对SPF雏鸡无致病性,半数致死量(LD50)大于1.0×1010CFU,且重组菌Se-VP2株免疫动物后可同时诱导产生针对IBDV和沙门菌的抗体;重组菌Se-VP2株可以诱导T淋巴细胞产生Th1型细胞因子IFN-γ和Th2型细胞因子IL-4,并能刺激外周血淋巴细胞的增殖分化;攻毒保护性试验结果显示,Se-VP2株免疫动物后可对IBDV和沙门菌的感染提供100%的保护。结果表明,rfaH基因是沙门菌的毒力基因,重组弱毒肠炎沙门菌Se-VP2株作为疫苗候选株,对SPF雏鸡安全有效,为后续肠炎沙门菌作为表达载体的研究奠定了基础。     

猪瘟病毒野毒株E2蛋白特异性单抗免疫抑制制备法的建立

采用环磷酰胺免疫抑制法制备特异性识别猪瘟病毒(CSFV)野毒株的单克隆抗体,用纯化的杆状病毒表达的重组HCLV-E2蛋白作为耐受原,Shimen-E2蛋白作为免疫原,免疫BALB/c小鼠,取其脾淋巴细胞与SP2/O骨髓瘤细胞融合,获得了1株能稳定分泌抗E2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,结果显示该单克隆抗体能够与CSFV石门株发生反应,同时能与1.1、2.1、2.2和2.3基因亚群CSFV野毒发生特异性反应,并具有中和活性,而与CSFV兔化弱毒疫苗株不发生反应.表明,该单克隆抗体可以用于鉴别CSFV野毒株和兔化弱毒疫苗株.