不同培养液对牛孤雌生殖胚胎和体细胞核移植胚胎体外发育的影响

采用体外成熟的牛卵母细胞 ,经 5 μmol/LIonomycin 5min和 2mmol/L 6 DMAP 5 μg/mLCCB 4h激活 ,分别在TALP M 199(TM ,1∶2 )、BMOC M 199(BM ,1∶2 )和CR1aa培养液内培养 ,2 4h和 3 6h各组卵母细胞的卵裂率分别为5 6.4%、5 5 .6%、5 3 .6%和 72 .0 %、75 .9%、79.0 % ,无显著差异 (P >0 .0 5 ) ;培养 8d后囊胚发育率分别为 18.2 %、2 1.4%和 2 9.3 % ,CR1aa内培养孤雌生殖胚的囊胚发育率显著高于TM (P <0 .0 1)。皮肤成纤维细胞构建的重组胚经同法激活后 ,分别在TM、BM和CR1aa内培养 ,2 4h和 3 6hBM和CR1aa内重组胚的卵裂率显著高于TM (4 9.7%、49.8%比 2 0 .5 % ;74.1%、73 .2 %比 5 0 .0 % ) (P <0 .0 1) ;虽然培养 8d后各组胚胎的囊胚发育率无显著差异 ,但CR1aa内重组胚的囊胚发育率稍高 (12 .3 %比 9.8%、11.5 % )。结果表明 ,CR1aa更适合孤雌生殖和体细胞核移植胚胎的体外培养。     

绵羊去透明带卵母细胞的孤雌激活

为探索一种简化的绵羊核移植操作程序,比较了不同浓度离子霉素、两种不同激活方法对保留和去除透明带的绵羊卵母细胞孤雌发育的影响。结果,2.5μmol/L离子霉素+2mmol/L 6-DMAP激活去除透明带卵母细胞时,卵裂率为78.9%,囊胚发育率为13.7%;采用5μmol/L离子霉素+2mmol/L 6-DMAP方法激活保留透明带的卵母细胞时,卵裂率为88.5%,囊胚发育率为14.7%。在WOWs培养中,对去除和保留透明带的卵母细胞,用5μmol/L离子霉素+2mmol/L 6-DMAP激活时,卵裂率分别为70.4%和69.2%,用70mL/L无水乙醇+2mmol/L 6-DMAP激活时,卵裂率分别为33.3%和23.0%,离子霉素处理组的卵裂率显著高于无水乙醇处理组。结果表明,透明带的去除与否对卵裂率没有产生影响,但各处理组的卵裂卵均未发育为囊胚。     

不同型牛血清对家兔原核胚序贯培养体外发育的影响

采用不同型血清分别添加到TCM199和mTCM199培养液、RPMI1640和mRPMI1640培养液中,对兔原核期受精卵进行了体外序贯培养,并对各组间不同时期发育率进行了分析比较。结果显示:体外培养至第72 h时,3个体外序贯培养体系间8-细胞胚率、桑椹胚率差异不显著(P>0.05),当体外培养至囊胚时,100 mL/L NBS TCM199(mTCM199)培养体系、100 mL/L NBS RPMI1640(mRPMI1640)培养体系的囊胚率均显著低于100 mL/L FBS RPMI1640(mRPMI1640)培养体系的囊胚率(三组的囊胚率依次是27.3%、35.9%、97.2%,P<0.01)。但前两组之间差异不显著。结果表明,不同型血清对兔早期胚胎体外正常发育具有很大影响,序贯培养中添加国产NBS的培养液的培养效果明显低于添加进口FBS的培养液的培养效果。     

绵羊睾丸原代细胞培养及接种羊痘弱毒后的病变观察

研究了在相同培养条件下不同培养液、不同血清和不同细胞密度对绵羊睾丸细胞生长的影响 ,并对该细胞接种羊痘弱毒后的病变情况进行了观察。结果 ,3种培养液对绵羊睾丸细胞生长的支持作用表现为MEM液 >199液 >乳汉液 ,但差异不显著 ;用犊牛血清的最适细胞密度为8.0× 10 5～ 1.0× 10 6 /mL ,用成年牛血清的最适细胞密度为 1.0× 10 6 /mL ,用绵羊血清的最适细胞密度为 8.0× 10 5/mL ;原代培养生长良好的细胞接种羊痘弱毒后出现了明显的细胞病变     

小鼠孤雌胚2-细胞阻滞的研究

为探讨小鼠孤雌胚2-细胞阻滞的机制,本试验以昆明小鼠为研究对象,通过输卵管上皮细胞和垂体细胞作为饲养层培养小鼠孤雌胚胎,分析其作用机理。小鼠卵母细胞通过70mL/L乙醇激活5min,再用2mmol/L 6-DMAP、5μg/mL CB激活3h后,分别在不同饲养层的KSOM培养液中进行培养,观察并比较各培养条件下孤雌胚胎的发育情况。结果,培养至第24小时,各组无显著差异(P>0.05),都有较高卵裂率。培养至第48小时,用两种饲养层细胞培养的孤雌胚胎4-细胞～8-细胞发育效果好,与用单独一种饲养层细胞培养相比,差异显著(P<0.05),与对照组相比,差异极显著(P<0.01);发育至桑囊胚的比例为49.4%(42/85)(P<0.01)。结果表明,含有输卵管上皮细胞和垂体细胞的KSOM培养液可有效促进小鼠孤雌胚胎的发育并通过2-细胞阻滞(通过2-细胞阻滞率为74.1%),并可进一步提高其发育率(桑囊胚率为49.4%)。     

去掉卵丘细胞或切开卵透明带对小鼠体外受精的影响

探讨了去掉小鼠卵子的卵丘细胞和人工切开透明带对小鼠体外受精的影响.结果表明,与卵丘卵母细胞复合体相比,用透明质酸酶去掉卵子的卵丘细胞后的体外受精率显著降低(分别为56%和12%-23%);当人工切开部分透明带后,卵子的体外受精率增至56%-87%(P＜0.01);与细胞质均质的卵子相比,细胞质不均卵子即使切开透明带也仅有19%-22%的卵子受精.结果表明,用透明质酸酶去掉小鼠卵子的卵丘细胞后,选择细胞均质的卵子并人工切开透明带,可提高小鼠的体外受精率.     

牛分枝杆菌重组MPT83蛋白间接ELISA方法的建立

以纯化的牛分枝杆菌重组MPT83蛋白为包被抗原,建立了检测牛分枝杆菌抗体的间接ELISA方法。确定了间接ELISA各组分的最适反应条件:抗原包被浓度为1μg/mL,酶标二抗稀释度为1∶1600,血清稀释度为1∶60,抗原和血清、血清和二抗均在37℃反应30 min,底物在37℃显色15 min,D655 nm阴性、阳性临界值为0.5。经阻断试验、交叉试验、重复性试验,表明该方法特异性强、重复性好。用该方法对18份结核菌素试验阳性牛血清和36份结核菌素试验阴性牛血清进行检测,结果显示,阳性血清的符合率为27.8%,阴性血清的符合率为91.7%。     

不同化学激活剂对小鼠卵母细胞的激活效果

为探讨不同激活剂的卵母细胞孤雌激活效果及激活胚体外发育情况,用乙醇、Ca-A23187、SrCl2、6-DMAP及CB分别对小鼠卵母细胞进行了激活处理。结果显示,70 mL/L乙醇刺激小鼠卵母细胞时,以激活5~7 min的激活效果及孤雌胚发育较好,桑囊胚发育率可达29.11%;用SrCl2激活小鼠卵母细胞时,6~10 mmol/L为最佳处理浓度,3~6 h为最佳激活时间,桑囊胚发育率可达16.67%;以70 mL/L乙醇激活5 min,再用2 mmol/L 6-DMAP 5μg/mL CB激活3 h效果最佳,桑囊胚发育率高达35.77%。研究证实,小鼠卵母细胞经乙醇、6-DMAP和CB等复合激活后能较好地发育。     

神经生长因子对牛腔前卵泡体外培养的影响

用改良的McCoy’s 5a培养液(含 3 mmol/L L-谷氨酰胺、1 g/L BSA、29 ng/mL睾酮、2.5μg/mL转铁蛋白、100 ng/mL胰岛素和4 ng/mL硒),在96孔培养板中,每孔250μL培养液条件下,研究了神经生长因子(NGF)对牛腔前卵泡体外发育的影响。结果表明:在培养液中添加 3种不同浓度(4、6、8 IU/mL)NGF对体外培养的d<60μm腔前卵泡有促进生长的作用。在体外培养10 d时,3种不同浓度NGF组的d<60μm腔前卵泡及其卵母细胞直径平均增长值显著高于对照组,但对60μm130μm的腔前卵泡作用不显著。同时,不同浓度的 NGF显著提高了d<60μm腔前卵泡的发育率。     

反复冻融新生牛血清对促细胞生长效应的影响

选择促细胞生长性能良好的三批新生牛血清 ,经不同次数冻融后用其配制MEM培养液 ,用于培养SP2 / 0细胞 ,从细胞最大增殖量和倍增时间 2个指标测定促细胞生长效应。结果 ,用经不同次数冻融的新生牛血清配制的MEM培养液 ,对SP2 / 0细胞的最大增殖量和倍增时间影响不大 ;但反复冻融 2 0次以上的新生牛血清配制的培养液使细胞的倍增时间延长。由此可见 ,为了防止细胞倍增时间延长 ,所用新生牛血清的冻融次数应该控制在 2 0次以内