反复冻融新生牛血清对促细胞生长效应的影响

选择促细胞生长性能良好的三批新生牛血清 ,经不同次数冻融后用其配制MEM培养液 ,用于培养SP2 / 0细胞 ,从细胞最大增殖量和倍增时间 2个指标测定促细胞生长效应。结果 ,用经不同次数冻融的新生牛血清配制的MEM培养液 ,对SP2 / 0细胞的最大增殖量和倍增时间影响不大 ;但反复冻融 2 0次以上的新生牛血清配制的培养液使细胞的倍增时间延长。由此可见 ,为了防止细胞倍增时间延长 ,所用新生牛血清的冻融次数应该控制在 2 0次以内     

猪传染性水泡病传代细胞甲醛灭能苗的研究

一、材料和方法 (一)病毒(强毒):本强毒是1974年采自漯河冷冻厂病猪水泡皮,磨碎接种乳鼠,用鼠毒五代接种传代细胞。细胞病变明显,且有规律。 (二)供生产病毒的细胞培养:我们的试验都是用IB-RS-2系猪肾传代细胞进行的。引自农林部兽医药品监察所。 1.培养液:以Hanks液加0.5％乳蛋白水解物为基础液,另加N_(16)液8％、牛血清10％、青霉素每毫升含100单位,链霉索含100微克,用灭菌碳酸氢钠调整pH为7.0左右。维持液含牛血清3％,pH为7.4左右,其他相同。     

绵羊睾丸支持细胞的分离鉴定及其在山羊痘病毒疫苗株培养中的应用

为研究绵羊睾丸支持细胞对山羊痘病毒的增殖特性,采用胶原酶Ⅳ和胰酶两步法分离绵羊睾丸支持细胞,通过倒置显微镜进行形态学观察、细胞染色鉴定以及特异性表达ABP蛋白鉴定,然后接种山羊痘病毒疫苗株。结果显示,分离的原代细胞24 h可长满单层,用0.05%的胰酶消化处理3次可得到纯度约为80%的睾丸支持细胞;油红O染色可观察到绵羊睾丸支持细胞的细胞质含有大量脂肪滴,细胞核可见双极小体;HE染色后细胞核为蓝色,细胞质呈红色或粉红色。ABP蛋白间接免疫荧光可观察到在绵羊睾丸支持细胞的细胞质和细胞核周围有绿色荧光,经显微镜下计数其纯度达80%以上。接种山羊痘病毒疫苗株后第4天有90%细胞产生病变,细胞变圆,细胞聚集成簇状,细胞收缩、细胞核出现空泡化。qPCR扩增Ct值为18.81,Ct值低于其他细胞传代数值。结论,本研究成功分离培养了绵羊睾丸支持细胞,该细胞能较好地培养山羊痘病毒疫苗株,对羊痘疫苗的生产有一定的现实意义。     

猪流行性腹泻病毒Vero细胞微载体培养条件的优化试验

通过研究搅拌速度、pH值、血清浓度等环境条件对细胞贴壁的影响以及细胞接种密度、微载体浓度与细胞生长的关系 ,对应用微载体技术和生物反应器系统生产猪流行性腹泻病毒(PEDV )的可行性进行了探讨。结果表明 ,搅拌转速、pH值、血清浓度均对Vero(PEDV )细胞在CT 3微载体上的贴壁率和均匀分布有影响 ;当接种密度为 15 .0× 10 4 /mL时 ,即每 1mg微载体接种 5 .0× 10 4 细胞时 ,可以获得较高的细胞密度 ;随着微载体浓度的提高 ,最高细胞密度也增加 ;在CelliGen反应器中 ,采用优化的培养条件 ,细胞密度可达到 174 .0× 10 4 /mL ,是方瓶培养的 3.5倍 ,每个细胞的PEDV含量与方瓶培养相当 ,制备的疫苗免疫原性好     

牦牛IBR病毒85-Y株电镜观察及理化特性鉴定

牦牛IBR病毒85-Y株的分离,血清学鉴定及回归本动物试验已相继报道。现将对该毒株的电镜观察及理化特性鉴定的结果报告如下。 (一)材料与方法 1.细胞:供试验用的犊牛肾(BK)继代细胞系按常规方法制备。生长液含健康犊牛血清10％,乳汉液45％,199培养液45％,pH7.0～7.2。维持液为pH7.2—7.4之乳汉液。 2.种毒:85-Y株冻干毒在BK继代细胞上再传3～5代作为以下各项试验的种毒,接种细胞单层前均经3次冻融,3500rpm离心20分钟。     

透明质酸酶对牛卵母细胞孤雌激活的研究

在37-39℃50 mL/L CO2条件下,用含80 mL/L发情牛血清及50 mL/L犊牛血清的M199成熟培养液培养牛的A、B级卵丘-卵母细胞复合体(COCs),18-22 h后以无血清的TCM199培养液洗涤3次,用透明质酸酶消化吹打脱去卵丘细胞,以无血清的M199培养液洗涤3次,移回成熟培养液中培养.结果,卵细胞于成熟后第3 d开始出现卵裂,第5 d卵裂率达到37%,第9 d囊胚率达5%-9%.表明透明质酸酶可以促使成熟的牛孤雌卵母细胞激活并发育至囊胚.     

环形泰勒虫裂殖体感染细胞培养技术的改进

在环形泰勒虫裂殖体胶冻细胞苗工厂化生产中,将小转瓶培养改为大转瓶培养,在此基础上又用成年健康黑白花牛血清代替犊牛血清,加犊牛血清的培养液收获细胞数为１４６ ．０ 万个／ ｍ Ｌ,而加成年牛血清的培养液在２ 次细胞培养中收获细胞数分别达１５３ ．８ 万个／ ｍ Ｌ 和１６２ ．０ 万个／ ｍ Ｌ。     

牦牛胎儿成纤维细胞的分离培养

采用30d胚龄左右的牦牛胚胎,用2种不同的消化液消化后,将所得的牦牛胎儿成纤维细胞(yak embryonic fibroblasts,YEF)培养于不同血清含量的RPMI1640培养液中,并接种于2种不同材质的培养瓶表面,对YEF的分离方法、培养所需胎牛血清(FBS)添加量和不同基质表面对YEF生长的影响进行了研究。结果表明,含150 mL/L FBS的RPMI1640培养基最适合YEF生长,可传代27次以上;经用RPMI1640和D-Hank’s液配制的2．5 g／L胰蛋白酶消化,所得的YEF的细胞活率差异不显著(P>0．05),其原代细胞在含100 mL／L胎牛血清的RPMI1640培养液中的贴壁率差异极显著(P<0．01);不同生长基质对YEF的形态没有显著影响。     

免疫吸附去除猪瘟免疫血清中非相关抗体

当用聚乙二醇沉淀法从猪瘟兔化弱毒牛睾丸细胞培养物上清液制备部分纯化抗原,进行猪瘟免疫检测时,因免疫血清中存在抗牛睾丸细胞和抗牛血清成分的抗体,会产生非相关性反应而 干扰对抗病毒特异性抗体的检测。在血清稀释液中加入牛睾丸细胞培养物抗原可有效地抑制这种非相关抗体引起的反应,保证猪瘟免疫抗体检测的特异性。     

低血清培养PK-15细胞系对TGEV增殖规律的研究

为降低疫苗生产综合成本,本研究探讨了以低血清培养基(M08011)替代常规细胞培养基(DMEM)的可行性。本研究依次采用含100、80、50、30、20、10、0mL/L血清的低血清培养基(M08011)驯化PK-15细胞,并考察猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)在低血清培养的PK-15细胞系中的增殖规律。结果显示,驯化后的PK-15细胞在含100、80、50、30、20 mL/L的低血清培养基中生长状态良好,与常规培养基所培养的PK-15细胞无差异。低血清培养体系培养PK-15细胞时,血清最低添加量为20 mL/L。用该体系培养的PK-15细胞接种TGEV后,TGEV的TCID50为10^-4.97/100μL,与常规条件培养的TGEV的TCID50为104.88/100μL相比,差别不明显。TGEV接种PK-15细胞,低血清培养基中血清浓度降低至20 mL/L,毒价未受到影响。结果表明,本研究建立的PK-15细胞及TGEV低血清培养体系可初步应用于TGEV的增殖培养,为相关疫苗研发奠定了基础。     

猪胚胎多能性干细胞的分离培养

收集妊娠 2 6 .0～ 2 9.0d的猪胚胎 ,分离培养原始生殖细胞 (PGCs) ,在STO细胞饲养层上生长 ,形成了多能性干细胞 (EG)。发现其具有干细胞的显著特性 ,并能在体外定向分化为神经细胞、上皮细胞和胚泡细胞。试验使用A、B、C 3种不同的培养基培养PGCs ,结果在形成EG细胞集落的数量和EG细胞分化上有着明显的差距 ,说明血清的质量和浓度以及细胞因子对干细胞的生成和增殖有着重要的影响     

绵羊胎盘滋养层细胞的体外培养与鉴定

为建立一种稳定、方便地获得较高纯度的绵羊绒毛膜滋养层细胞的方法,为后续的细胞转染和RNA干扰试验提供细胞学基础,采用组织块法培养滋养层细胞,消化差速法纯化细胞,相差显微镜观察滋养层细胞的形态学特点,应用常规HE染色和免疫组织化学染色、透射电镜及PCR技术鉴定细胞来源。结果显示,倒置相差显微镜下,可见细胞为上皮样细胞形态,呈片状铺展生长。免疫组织化学染色显示,细胞角蛋白染色阳性细胞占90%以上,波形蛋白染色呈阴性;透射电镜可观察到滋养层细胞所特有的结构;台盼蓝排斥试验检测细胞活力,存活率超过95%,细胞活力良好。常规RT-PCR技术可扩增出滋养层细胞所分泌的特有的干扰素蛋白-1基因片段。证实该方法可以有效获得较高纯度的、具有生物学活性的绵羊绒毛膜滋养层细胞,为本实验室后续的体外研究提供试验基础。     

大鼠神经干细胞的分离培养和分化

分离大鼠大脑皮质及皮质下组织 ,经消化及机械吹打后 ,用悬浮培养法、有限稀释法获得来源于同一细胞的亚细胞系克隆 ;用免疫细胞化学法鉴定神经干细胞 (NSCs)。结果 ,从大鼠大脑皮质及皮质下分离的组织 ,经原代和传代培养均可形成细胞克隆 ,并具有增殖能力 ;原代和传代细胞抗原与抗巢蛋白 (nestin)单克隆抗体反应呈阳性 ;单细胞克隆能分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。结果表明 ,用此方法分离的细胞具有自我更新和分化潜能 ,有很强的增殖能力 ,是属于中枢神经系统的干细胞。     

双峰驼与马的骨髓细胞比较研究

对１１例双峰驼和５例马的骨髓造血细胞对比观察表明，双峰驼骨髓红细胞系统与粒细胞系统的各种未成熟细胞几乎均比马的同种细胞小；嗜酸性粒细胞的颗粒比马的小，但数量较多；其成熟红细胞呈椭圆形薄饼状，而马的为圆形。两种动物的骨髓细胞分类计数无显著差异     

山羊角膜缘干细胞的分离培养

采用分散酶Ⅱ(dispaseⅡ)联合胰蛋白酶二步法分离培养山羊角膜缘干细胞,观察其体外培养特性,通过免疫细胞化学、RT-PCR法鉴定分离培养的细胞。结果显示,获取的细胞形态为多角形,体外培养能传20多代,经免疫组织化学和分子生物学鉴定,细胞表达角膜缘干细胞标志物p63、PCNA、ABCG2和角膜上皮细胞标志物K3/K12和Cx43。本试验建立了山羊角膜缘干细胞的体外培养方法,可为角膜缘干细胞的研究提供方法学基础。     

褪黑激素对犬脂肪干细胞向雪旺细胞分化过程中凋亡发生的抑制作用研究

为了探讨褪黑激素(Mel)对犬脂肪干细胞(ADSCs)向雪旺细胞(SCs)诱导分化过程中凋亡发生的影响。本实验将犬ADSCs诱导分化为SCs,并使用免疫荧光法进行鉴定。采用CCK8法选取Mel的最佳浓度。应用q RT-PCR法和Western-blot法检测无Mel组和Mel处理组中ADSCs向SCs诱导过程中细胞凋亡相关基因Caspase-3、Caspase-8、Bcl-2和Bax的m RNA和蛋白表达水平。结果显示,50 nmol/L Mel处理过的细胞活力最高;ADSCs向SCs诱导后S-100和GFAP呈阳性表达,并且观察到Mel的添加并不会影响到SCs的表型特征。ADSCs向SCs诱导后Bcl-2表达量明显低于对照组,Caspase-3、Caspase-8和Bax的表达量显著高于对照组,细胞凋亡较多;在加入Mel后Bcl-2表达量显著升高,Caspase-3、Caspase-8和Bax的表达量显著下降。结果说明Mel可以显著抑制犬ADSCs向SCs诱导分化过程中的凋亡发生。     

树突状细胞对灭活口蹄疫病毒的泛素化作用

通过制备BALB/c小鼠单核细胞源树突状细胞(DC),构建了树突状细胞与灭活口蹄疫病毒(FMDV)的体外作用系统,考察树突状细胞对灭活FMDV的泛素化作用。收获荷载灭活FMDV后不同时间的树突状细胞,制备树突状细胞裂解液,用SDS-PAGE和Western-blot分析灭活FMDV抗原是否被泛素化。结果发现,在将灭活FMDV荷载于树突状细胞后的第0.5、3、6、10和20 h均可检测到分子质量约为75ku的FMDV蛋白,并且被FK2抗体标记的泛素化蛋白含量明显多于FK1抗体标记的泛素化蛋白含量。说明灭活FMDV被树突状细胞加工提呈的过程包括泛素化作用,并且泛素化蛋白主要在溶酶体内被降解。     

公马生长激素细胞和催乳激素细胞的形态计测学研究

利用免疫组织化学和形态计测学的方法,观察了20匹成熟雄性蒙古马的脑垂体前叶生长激素细胞和催乳激素细胞的数量和面积,同时利用放射免疫分析方法检测了这2种激素的血浆水平.结果表明,生长激素细胞的数量为10.10×108个,细胞面积为81.30 μm2;催乳激素细胞的数量为3.94×108个,细胞面积为46.03μm2.生长激素在血浆中含量为10.11ng/mL,催乳激素为1.64 ng/mL.结果提示垂体激素血浆中含量与相关细胞的组织学特征有关,而生长激素血浆中含量的个体差异可能与其搏动性分泌形式有关.     

硝基苯致小鼠骨髓细胞的突变作用

为探讨硝基苯对哺乳动物的致突变性,将12周龄雄性昆明小鼠随机分为染毒组(26、52、104mg/kg)、空白对照组(生理盐水)、溶剂对照组(花生油)和阳性对照组(环磷酰胺),连续灌胃染毒7 d,检测骨髓细胞微核率、骨髓细胞染色体畸变率以及外周血网织红细胞数。结果显示,随着染毒剂量的增加,骨髓细胞微核率、染色体畸变率均有增加,外周血网织红细胞数减少,各组与对照组差异均极显著(P<0.01),并呈剂量-效应关系。表明,硝基苯可导致小鼠骨髓细胞发生突变。     

γ-氨基丁酸对离体培养牦牛黄体细胞凋亡的影响

用离体培养方法观察了γ 氨基丁酸 (GABA)对牦牛黄体细胞凋亡及羟自由基 (OH )生成的影响。结果表明 ,GABA能促进黄体细胞OH的生成并诱导黄体细胞凋亡。