AQP9基因在不同闭锁进程水牛卵泡颗粒细胞中的表达及其与细胞凋亡关系的研究

为了解AQP9基因表达及其与水牛颗粒细胞凋亡的关系,初步阐明它在水牛卵泡闭锁中的作用,首先分析了不同闭锁程度水牛卵泡颗粒细胞中AQP9基因和凋亡相关基因的表达情况。通过构建颗粒细胞凋亡模型、过表达AQP9基因的方法分析了它对细胞凋亡相关基因表达的影响。为进一步了解PKC通路与AQP9基因表达的相关性,添加PKC抑制剂处理水牛颗粒细胞,分析细胞凋亡和基因表达情况。上述研究结果表明,AQP9基因主要参与早期卵泡闭锁的过程,AQP9基因可能通过PKC信号通路调节水牛颗粒细胞的凋亡。     

马齿苋对热应激小鼠空肠HSP70及肝脏抗氧化能力的影响

旨在探究马齿苋水提物(aqueous extract of Portulaca oleracea L.)对热应激小鼠空肠HSP70含量及肝脏抗氧化能力的影响。选取40只昆明种小鼠,随机分为4组:空白组(C)、热应激组(HS)、马齿苋水提物组(AEP)、维生素C组(Vc),每组10只。热应激组于40℃±1℃环境下每天处理0.5 h,其余时间置于30℃±1℃条件下,C组放置于25℃±1℃,连续6 d后,将小鼠置于25℃±1℃之环境给药治疗7 d。在给药治疗开始后第3天和第7天眶窦采血,处死后采集小鼠空肠、肝脏,测定各组小鼠血清HSP70含量、肝脏SOD、MDA及GSH-Px含量及空肠黏膜HSP70 mRNA表达量的变化。结果显示,与C组比较,热应激可显著提高小鼠空肠黏膜HSP70 mRNA表达量(P<0.01),提高肝脏SOD、MDA和GSH-Px的活性水平(P<0.01)。与HS组比较,给予马齿苋水提物后,可有效降低热应激小鼠血清HSP70含量和空肠黏膜HSP70 mRNA表达量(P<0.01)及肝脏MDA的活性水平(P<0.05),但对SOD和GSH-Px的含量无显著影响(P>0.05)。结论:马齿苋水提物能够通过降低热应激小鼠的氧化应激反应,减少热应激小鼠体内HSP70的表达量,达到良好的抗热应激效果。     

犊牛小肠肌间神经丛NOS阳性神经元的发育学变化

用NADPH-黄递酶组织化学方法对1、4和6月龄利杂犊牛小肠肌间神经丛NOS阳性神经元的形态、分布和数量进行了比较研究。结果显示,利杂犊牛小肠肌间神经丛NOS阳性神经元和阳性神经纤维形成清晰的三级网状结构,NOS阳性神经元形态各异,聚集在一起构成大小不等的神经节。小肠各段神经丛中NOS阳性神经元的密度随年龄增长而降低;4月龄到6月龄犊牛空肠肌间神经节的NOS阳性神经元数量变化与十二指肠和回肠相比变化较大;4月龄以空肠的肌间神经丛NOS阳性神经元的核质比(为0.16)最小,回肠与空肠的核质比差异不显著(P>0.05),回肠、空肠与十二指肠的核质比差异显著(P<0.05),6月龄空肠的核质比(为0.25)最大,但小肠各段的核质比相互间差异不显著(P>0.05)。证实,犊牛小肠各段肌间神经丛NOS阳性神经元核质比的发育变化可能与其功能的变化有关。     

肠毒素性大肠杆菌K99-ST1融合基因的克隆及原核表达

为有效预防肠毒素性大肠杆菌(ETEC)引起的犊牛和羔羊腹泻,将PCR扩增获得的ETEC K99菌毛抗原基因和人工合成的ST1基因片段,借助pUCm-T载体,构建了重组质粒pUCm-K99-ST1,从而获得了融合基因K99-ST1;使用EcoR I Sal I双酶切将该融合基因定向插入表达载体pET-30a中,成功构建了表达载体pET-K99-ST1,将其转入表达茵株BL21(DE3)中,经IPTG诱导,获得31 ku的蛋白;Western-blotring结果显示,该融合蛋白可与K99阳性血清发生特异性反应.     

黄牛脑水通道蛋白4的表达及其对高原脑水肿的易感性

为了探讨黄牛对高原脑水肿的易感性,并为青藏高原养牛业提供参考,运用免疫组织化学SABC染色法并采用Image-Pro Plus 6.0软件,对成年黄牛大脑不同功能区水通道蛋白4(AQP4)的表达及分布特征进行了研究。结果显示,黄牛不同功能区脑组织中AQP4表达面积(S)和积分光密度(IOD)值的大小顺序为S扣带回>S中央前回>S丘脑>S尾状核,IOD扣带回>IOD中央前回>IOD丘脑>IOD尾状核,且扣带回和中央前回的S和IOD值均显著高于丘脑和尾状核(P<0.01)。结果证实,成年黄牛脑不同功能区、同功能区不同层及同功能区同层不同类型细胞对水的通透性及代谢功能存在较大差异,对脑水肿的易感性是不同的。     

感染旋毛虫后小鼠腹腔巨噬细胞NOD1样受体及相关细胞因子的表达动态分析

为了解感染旋毛虫后宿主巨噬细胞NOD1受体及其信号通路中关键分子与相关细胞因子的表达动态,将一定量旋毛虫肌幼虫经口感染小鼠,在感染后第0.5、4、7、14、21、28、35天分别取小鼠腹腔巨噬细胞,应用荧光定量PCR检测细胞中NOD1、RIP2、NF-κB mRNA表达量,Western-blot测定NOD1、RIP2、NF-κB蛋白表达量,ELISA测定细胞培养上清及血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的质量浓度。荧光定量PCR结果显示,感染旋毛虫后巨噬细胞中NOD1、RIP2、NF-κB的mRNA表达量变化趋势基本一致,均呈现"升高-降低-升高-降低-平稳"的态势,且分别在感染后第4和21天各具有1个mRNA表达量峰值,在第28～35天时mRNA水平降低并趋向稳定。Western-blot结果表明,NOD1、RIP2和NF-κB p-p65的蛋白质量浓度变化趋势与其mRNA表达量检测结果基本一致。ELISA结果显示,感染小鼠腹腔巨噬细胞培养上清和小鼠血清中TNF-α、IL-6的质量浓度与对照组相比变化明显(P0.01,P0.05),变化趋势与NOD1、RIP2和NF-κB的变化相似,IL-1β的质量浓度变化程度不明显。结果表明,旋毛虫感染可以引起小鼠NOD1受体的激活,在旋毛虫生活史的特定时期上调NOD1受体通路中关键分子RIP2和下游分子NF-κB的表达,促进细胞因子TNF-α和IL-6的分泌。试验证明,宿主NOD1受体参与了旋毛虫感染引起的免疫应答,为防治旋毛虫病和理解旋毛虫对宿主的感染机制提供了新的思路。     

食淀粉乳杆菌对猪A群轮状病毒NSP4在小鼠肠组织表达的影响

为探究食淀粉乳杆菌对猪轮状病毒(PRV)非结构蛋白NSP4表达的影响,对3日龄清洁级BALB/c小鼠分别在感染PRV前后灌服食淀粉乳杆菌,应用实时荧光定量PCR检测感染病毒后空肠组织中PRVNSP4的m RNA相对表达量,采用比色法测定空肠组织内钙离子含量变化,并通过ELISA定量检测空肠组织中整联蛋白α2β1、磷脂酶C和Dicer的含量。结果显示,饲喂食淀粉乳杆菌第5天和第7天时,预防组和辅疗组中NSP4的m RNA相对表达量显著低于病毒组(P0.05);除预防组第11天外,感染病毒后各检测时间点预防组和辅疗组的钙离子含量显著低于病毒组(P0.05);饲喂食淀粉乳杆菌第7天、第9天和第11天时,预防组和辅疗组中整联蛋白α2β1的含量显著低于病毒组(P0.05);感染病毒后各检测时间点预防组和辅疗组中磷脂酶C和Dicer的含量均低于病毒组。以上结果表明:在小鼠感染轮状病毒前后灌服食淀粉乳杆菌均能显著抑制PRV NSP4的m RNA表达和整联蛋白α2β1的合成,并降低空肠组织中钙离子,磷脂酶C和Dicer的含量,这为研究益生菌抗轮状病毒机制提供参考。     

大熊猫白细胞介素-18的原核表达及免疫功能分析

以本实验室构建的含有GpIL-18编码区序列的质粒pMD-GpIL-18为模板,PCR扩增GpIL-18ORF后连接到pET-28a原核表达载体,转化大肠杆菌Rosetta(DE3)进行诱导表达,纯化目的蛋白(PGpIL-18)。利用荧光定量PCR检测PGpIL-18蛋白对C57BL/6J小鼠脾细胞中细胞因子的影响。将PGpIL-18蛋白与细菌疫苗同时注射小鼠,检测其免疫增强效应。Western-blot结果表明,IPTG诱导PGpIL-18融合表达;其产物PGpIL-18能刺激小鼠脾细胞大量分泌IFN-γ,增加GM-CSF和TNF-α的表达量。同时注射PGpIL-18蛋白和细菌疫苗的小鼠血清中IgG的质量浓度明显高于对照组。同时,通过金黄色葡萄球菌和大肠杆菌攻毒试验,发现PGpIL-18蛋白可以提高疫苗对小鼠的保护率。PGpIL-18能促进特异性免疫应答的发生,这一结果为重组PGpIL-18蛋白作为佐剂的开发利用奠定了理论基础。     

三氧化二砷对小鼠脾氧化应激和甲硫氨酸亚砜还原酶基因表达的影响

为研究过量三氧化二砷(arsenic trioxide,ATO)摄入对小鼠脾氧化应激和甲硫氨酸亚砜还原酶基因表达的影响,将30只6周龄雄性小鼠随机分成6组,每组分别连续3周口服不同剂量三氧化二砷(按体重0、0.3、1、3、6、9mg/kg),然后分析小鼠脾氧化应激状态和甲硫氨酸亚砜还原酶基因表达的变化。结果显示,不同剂量的ATO处理均导致小鼠脾膜脂过氧化加剧(P0.01),也导致总超氧化物歧化酶(SOD)活性显著下降(P0.01),各处理组间无显著差异。qPCR分析显示,不同剂量ATO处理诱导了MsrA和MsrB2基因表达的显著上升,高剂量ATO上调了MsrB1基因的表达,但抑制了小鼠脾中MsrB3基因的表达。结果表明,ATO的摄入导致了小鼠脾膜脂过氧化并降低了SOD活性,MsrA、MsrB1和MsrB2基因可能在减轻ATO导致的小鼠脾蛋白氧化修复中起重要作用。     

日粮中添加大豆抗原蛋白对断奶仔猪血清中IgG和IgE水平以及肠道ZO-1表达的影响

为了评价大豆抗原蛋白对断奶仔猪有无致敏作用及对肠紧密连接蛋白ZO-1表达的影响,选取70头24日龄断奶仔猪,随机将其分为7组,A组饲喂基础日粮,B组、C组、D组的饲粮中分别按仔猪初始体重添加500、2 000、5 000 mg/kg的β-伴大豆球蛋白,E组、F组、G组的饲粮中按仔猪初始体重分别添加500、2 000、5 000 mg/kg的大豆球蛋白,通过ELISA检测仔猪24及30日龄时血清中IgG及IgE的质量浓度,并于仔猪30日龄时,每组选取5头仔猪放血致死,采集小肠组织,通过免疫组化检测小肠紧密连接蛋白ZO-1的表达情况,并用实时荧光定量PCR测定ZO-1 m RNA的相对表达量。统计学分析结果表明,在仔猪日粮中添加大豆抗原蛋白能刺激断奶仔猪血清IgG和IgE的质量浓度升高(P0.01),小肠ZO-1蛋白表达和ZO-1 m RNA的相对表达量降低,且大豆抗原蛋白的添加剂量越多,ZO-1表达越低。上述结果表明,β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白能引起仔猪肠道过敏反应,损伤肠道紧密连接;β-伴大豆球蛋白的致敏作用大于大豆球蛋白。     

猪流行性腹泻病毒S蛋白富含表位区域的原核表达与鉴定

猪流行性腹泻病毒(PEDV)是引起猪腹泻的重要病原之一,给世界养猪业带来严重危害。本研究对PEDV分离株JS-2纤突蛋白(S)进行抗原表位分析,选择3个富含表位片段的区域。通过RT-PCR扩增基因序列,克隆入p ET32a(+)载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)中并进行诱导表达,SDS-PAGE电泳显示,成功表达了3个重组蛋白,分子质量与预期大小一致。将蛋白进行割胶回收,与油佐剂乳化后免疫小鼠,制备超免疫血清,利用PEDV包被抗原进行ELISA检测,结果免疫小鼠血清D450值达1.0左右,证实筛选制备的重组蛋白具有良好的免疫原性和反应原性。     

口疮病毒GIF蛋白的原核表达及对小鼠免疫细胞的影响

探究口疮病毒GIF蛋白对小鼠骨髓源树突状细胞成熟及Na?ve CD4~+T细胞极化作用的影响。原核表达口疮病毒GIF蛋白,用纯化后的蛋白刺激小鼠树突状细胞,利用流式细胞术检测细胞表面分子的表达情况,ELISA方法检测细胞培养上清中细胞因子IL-12P40、TNF-α、IL-10、IL-1β的分泌情况。将Na?ve CD4~+T细胞与经不同质量浓度的GIF蛋白刺激后的树突状细胞共培养,用ELISA检测该树突状细胞对Na?ve CD4~+T细胞的免疫刺激能力,并进一步检测培养上清中IFN-γ和IL-5的分泌水平。结果显示,成功克隆了ORFV117基因,表达了羊口疮病毒GIF蛋白。经不同质量浓度蛋白刺激后,树突状细胞的表面共刺激分子CD86、CD40的表达水平均明显升高,其中5μg/mL蛋白刺激后,MHCⅡ表达水平显著升高,IL-12P40、TNF-α、IL-1β、IL-10释放水平显著升高。经不同质量浓度的GIF重组蛋白刺激后的树突状细胞对Na?ve CD4~+T细胞的刺激能力增强,淋巴细胞共培养上清中IFN-γ分泌量显著增加。这表明一定质量浓度的口疮病毒GIF蛋白能促进小鼠骨髓源树突状细胞的成熟,能够激活抗原递呈作用,并且具有刺激T细胞分化的能力。     

虎杖苷对热应激大鼠空肠消化吸收、抗氧化和屏障功能的影响

为研究虎杖苷(PD)对热应激大鼠模型空肠消化吸收、抗氧化和肠屏障功能的影响,采用2×2设计,将24只雄性SD大鼠随机分为4组(n=6):室温处理+灌胃羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液组、室温处理+灌胃PD溶液组、热应激处理+灌胃CMC-Na溶液组、热应激处理+灌胃PD溶液组。热应激组每天40℃处理1.5 h,连续3 d。结果显示,在热处理后大鼠空肠绒毛高度、绒毛高度隐窝深度比值、蔗糖酶和麦芽糖酶活性下调。热处理还降低了空肠GSH含量和T-AOC活力;PD处理提高了GSH含量和SOD基因表达量,降低了GSH-PX活力。热处理降低了CLDN2基因表达量;PD处理增加了CLDN2、CLDN3、ZO-1基因表达量。热处理提高了空肠组织TLR4、NF-κB、TNF-α和SIRT1基因表达量及细胞因子IL-6、IL-10、TNF-α含量;PD处理提高了SIRT1基因表达量,降低了IL-10含量。结果表明,虎杖苷具有改善热应激大鼠肠道氧化应激和屏障损伤的积极作用。     

猴头菇多糖对MDRV感染RAW264.7细胞后病毒复制及TLR3诱导表达的影响

本试验旨在探索猴头菇多糖(HEP)对番鸭呼肠孤病毒(MDRV)感染RAW264.7细胞中病毒复制及TLR3诱导表达的影响,为进一步解析HEP在调节MDRV所致的番鸭机体免疫抑制中的作用机制提供数据参考。本试验首先通过测定HEP在小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7细胞)上的安全浓度的基础上确定HEP的添加浓度;然后通过RT-qPCR方法和Western-blot方法分别检测各组细胞中TLR3 m RNA的转录水平和TLR3、病毒σNS的蛋白表达量,从基因和蛋白的分子层面分析HEP对MDRV感染RAW264.7细胞的免疫调节作用。结果显示:HEP在46.88～187.5μg/m L浓度范围内是可以促进RAW264.7细胞生长,浓度为93.75μg/m L时细胞相对增殖率最高,VCG细胞TLR3 m RNA的相对表达量和蛋白表达量均极显著(P0.01)高于BCG组,HPG与HTG细胞TLR3 m RNA的相对表达量和蛋白表达量均极显著(P0.01)低于VCG组。结论:HEP可从基因与蛋白水平抑制MDRV感染早期过度活化的TLR3的表达,从而起到抗病毒作用。     

绵羊卵母细胞的差异蛋白质组学研究

为了研究绵羊卵母细胞成熟过程中蛋白质的表达模式,以期在蛋白质水平探索绵羊卵母细胞成熟的分子机制,将采用双向凝胶电泳技术获得的2-DE图谱经PDQuest8.0分析并找出差异蛋白斑点后,对差异蛋白斑点进行高效液相色谱串联离子阱质谱分析。结果显示,GV期和MⅡ期卵母细胞2-DE图谱之间存在13个表达差异明显的蛋白斑点;4个蛋白斑点的质谱检测结果较为理想,对应3种不同的蛋白质,分别为截短的VP2、苹果酸脱氢酶、谷胱甘肽转移酶M3;其中截短的VP2、苹果酸脱氢酶在卵母细胞成熟过程中表达量下调,谷胱甘肽转移酶M3在卵母细胞中大量表达并且表达量上调。结果表明,绵羊卵母细胞成熟过程中,细胞的mRNA合成和表达水平以及糖代谢水平可能降低,细胞的抗氧化和解毒能力可能提高。     

猪生殖与呼吸综合征病毒M基因和N基因的表达

将猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的M基因和N基因从重组质粒pMD18-T-M-N中亚克隆至pBV220原核表达载体上,成功构建了重组表达质粒pBVM-N。将pBVM-N转化大肠埃希氏菌DH5α感受态细胞,重组菌经温度敏感诱导表达,其细菌裂解物经SDS-PAGE可检测到分子质量约为19 ku的目的蛋白,与M基因表达产物一致;经蛋白质分析软件Bandscan分析,其表达量可达19.1%;Western-blotting分析表明,该重组蛋白可被兔抗PRRSV血清所识别,与预期的M基因表达产物相一致,而N基因未获表达。     

丁酸钠对断奶仔猪小肠黏膜形态结构的影响

将12头断奶仔猪分为3个处理组(丁酸钠组:基础日粮 1 g/kg丁酸钠,抗生素组:基础日粮 抗生素,复合组:基础日粮 抗生素 1 g/kg丁酸钠),饲喂4 周后,采用组织学和扫描电镜技术,对仔猪小肠黏膜上皮和杯状细胞的显微和超微结构进行了观察研究。结果显示,各试验组的空肠和回肠黏膜结构完整,层次清晰,肠绒毛排列整齐,柱状细胞结构清晰,丁酸钠组和复合组肠绒毛粗壮,而抗生素组肠绒毛顶端偶见肠上皮脱落,肠绒毛相对较细;各试验组回肠的杯状细胞数量为空肠的1.3~2.2倍,且以复合组的杯状细胞数最多,丁酸钠组次之,抗生素组最少;各试验组空肠和回肠肠上皮表面微绒毛结构清晰,排列整齐,复合组的细胞衣最厚且均匀,丁酸钠组次之,抗生素组较薄。表明,丁酸钠能促进杯状细胞增殖,改善小肠黏膜上皮细胞的形态结构,进而促进仔猪的消化吸收,提高其生产性能,其在这些方面的作用均优于抗生素。     

鸽源新城疫病毒F基因的克隆与原核表达

采用RT-PCR方法扩增了鸽源新城疫病毒F基因并将其克隆至pMD18-T载体,测定其核苷酸序列。根据F基因CDS序列,设计原核表达引物,扩增F基因功能区片段,并构建了重组原核表达质粒pGEX4T-1-NDV F(924),在不同时间和温度下进行诱导表达。通过SDS-PAGE检测,目的基因表达出约60ku的融合蛋白,主要以包涵体形式存在,表达目的蛋白的最佳诱导时间为6h,最佳诱导温度为42℃;提取并纯化包涵体蛋白,用其免疫BALB/c小鼠,采小鼠血进行ELISA检测。结果显示,表达蛋白具有良好的免疫原性和反应原性。上述结果表明,缺失疏水区的F基因可以在大肠杆菌BL21(DE3)中获得表达,表达的重组F蛋白具有良好的免疫原性和反应原性。     

猪流行性腹泻病毒S蛋白部分抗原表位基因的原核表达及表达产物的免疫原性分析

为获取具有免疫原性的猪流行性腹泻病毒S蛋白,并能有效研究其免疫原性,从山东省猪流行性腹泻病毒感染的某猪场病料中扩增S蛋白基因具有免疫原性的4个片段(Sa,Sb,Sc和Sd)。将得到的目的片段导入原核表达载体pGEX-6P-1中,转化到BL21(DE3)感受态细胞中进行表达。将表达的蛋白免疫家兔以研究其免疫原性。结果表明,IPTG诱导融合蛋白表达条件的最佳诱导时间为8h,IPTG的最佳终浓度为1.0mmol/L。SDS-PAGE和Western-blot分析表明,四个表达产物的分子质量分别约为61ku(Sa)、46ku(Sb)、41ku(Sc)、43ku(Sd)。经琼脂扩散试验测定,它们免疫后效价分别约为24(Sa)、25(Sb)、22(Sc)、24(Sd)。该研究表明,表达的4段蛋白均具有免疫原性,这为后期亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

1日龄牦牛小肠黏膜免疫相关细胞数量变化的研究

本研究旨在对1日龄牦牛小肠黏膜免疫相关细胞的数量变化进行研究。采用免疫组织化学和组织学特殊染色技术,分别对小肠的上皮内淋巴细胞、固有层淋巴细胞、上皮内杯状细胞和肥大细胞的分布特点和数量变化进行研究,对各肠段分泌的黏液性质进行判定。结果显示,上皮内淋巴细胞数量由十二指肠向空肠、回肠呈依次减少的趋势,各肠段之间差异极显著(P0.01);固有层淋巴细胞数量、肥大细胞密度从十二指肠向回肠呈依次递增的趋势,各肠段之间差异极显著(P0.01);上皮内杯状细胞从十二指肠到回肠呈增长趋势,十二指肠与空肠差异显著(P0.05),但两者与回肠差异极显著(P0.01);十二指肠上皮杯状细胞分泌中性黏液,而空肠、回肠分泌酸性黏液或中性和酸性混合性黏液;十二指肠腺靠近黏膜层分泌中性黏液,靠近肌层分泌酸性黏液;小肠腺均分泌有中性和酸性混合性黏液。上述结果表明,1日龄牦牛小肠不同肠段黏膜相关免疫细胞数量的不同变化,显示了小肠黏膜为机体天然屏障的重要组成部分。