犬新孢子虫NcAMA1基因重组腺病毒穿梭质粒的构建及其真核表达

为构建犬新孢子虫NcAMA1基因重组腺病毒穿梭质粒,并在真核细胞中表达,以重组质粒pVAX1-NcAMA1为模板,PCR扩增了NcAMA1基因,以此构建了pMD18T-NcAMA1重组克隆质粒;对该重组克隆质粒进行双酶切鉴定后,将其亚克隆至腺病毒穿梭载体pCR259中。应用脂质体介导转染法将经PCR鉴定和酶切鉴定正确的pCR259-NcAMA1重组穿梭质粒转染293细胞,应用IFAT和Western-blot技术检测了AMA1基因在293细胞中的表达情况。结果显示,扩增的NcAMA1基因长度为1 695bp,构建的重组腺病毒穿梭质粒pCR259-NcAMA1能在293细胞中获得瞬时表达,表达蛋白的分子质量约为68ku。     

FMDV全ORF编码基因的克隆及其腺病毒穿梭质粒的构建

为研制FMD复制缺陷型腺病毒活载体疫苗,通过RT-PCR方法获得了O型口蹄疫病毒(FMDV)全开放阅读框(ORF)基因片段,将其克隆到pMD18-T载体后测序,再将ORF编码基因定向克隆入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建了重组腺病毒穿梭质粒。经PCR、酶切及测序鉴定,所克隆的ORF编码基因序列与原始强毒株Akesu/58的ORF编码基因比较,L、P1、P2、P3基因的核苷酸同源性分别为98.8%、97.9%、99.0%和97.6%,PCR、酶切鉴定重组腺病毒穿梭质粒均获得了长约6.9 kb的目的基因片段。表明,成功获得了含有O型FMDV全ORF编码基因的阳性克隆,并成功构建了含有完整FMDV开放阅读框架的编码基因表达盒的重组腺病毒穿梭质粒。     

亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒VP1基因重组犬2型腺病毒的构建

应用PCR方法扩增出亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒的VP1基因,继而构建出真核表达载体pVAX-VP1。再将含有巨细胞启动子CMV的目的基因表达盒连接到穿梭载体pVAX△E3上,筛选出VP1表达盒方向与E3区转录方向一致的重组子,获得转移载体。再经酶切,连接等方法获得重组腺病毒质粒。利用脂质体介导将重组质粒转染DK细胞,转染3次后,细胞出现明显的腺病毒病变。经PCR扩增、测序检测及基因组酶切鉴定,证明该病毒即为重组犬2型腺病毒。命名为CAV2/FMDV。经验证,该重组毒可稳定遗传,其毒价为103.5TCID50/mL。     

O型口蹄疫病毒OA58株3C基因的克隆与真核表达

利用RT-PCR技术扩增获得了长度约640 bp的口蹄疫病毒目的基因,回收片段后与pMD18-T载体进行连接,测序结果表明获得了口蹄疫病毒3C基因。将重组质粒pMD18-3C与表达载体pEGFP-N1分别用BamHⅠ+XhoⅠ双酶切后,进行定向亚克隆,对重组表达质粒pEGFP-3C进行PCR、酶切鉴定及DNA测序,结果表明重组表达质粒所含的3C基因读码框正确。用pEGFP-3C转染BHK-21细胞,荧光显示目的基因EGFP发出绿色荧光;对3C转录的mRNA进行RT-PCR鉴定,证实3C基因在BHK-21细胞中得到了表达。     

表达水泡性口炎病毒G蛋白的重组腺病毒的构建与鉴定

为了以复制缺陷型人5型腺病毒为表达载体,构建表达水泡性口炎病毒印第安纳型(VSV-IN)G蛋白的重组腺病毒,利用PCR扩增编码VSV-IN G蛋白的基因,并将其克隆至腺病毒穿梭载体pacAd-CMV K-NpA中;再将含有目的基因的重组穿梭质粒与腺病毒骨架载体质粒用PacⅠ酶切线性化后共转染AAV-293细胞,获得重组腺病毒rAd-VSV-IN-G。该重组腺病毒于AAV-293细胞连续传代至第20代效价稳定。间接免疫荧光试验和Western-blot检测结果显示,G蛋白在重组腺病毒中可以被正确表达。上述研究成果为VSV重组腺病毒疫苗的研制奠定了基础。     

口蹄疫病毒多基因腺病毒穿梭质粒的构建

采用分步扩增连接的方法将口蹄疫病毒结构蛋白基因P1 2A、3C蛋白酶基因和 3D聚合酶基因按正确的读码框依次连接克隆入 pGEM T载体。然后 ,将切取的目的基因亚克隆入腺病毒穿梭质粒 pShuttle CMV。构建成功的 2个重组穿梭质粒经测序鉴定 ,含有完整的目的基因表达盒 ,穿梭质粒可与腺病毒骨架载体进行细菌内同源重组 ,以产生重组腺病毒载体     

双峰驼CYP2J基因的克隆与原核表达载体的构建

CYP2J酶主要参与机体内源性物质代谢,尤其是对花生四烯酸和亚油酸代谢发挥着重要作用。本试验通过克隆CYP2J基因,构建其原核表达载体,为蛋白层面深入研究双峰驼CYP2J酶提供特异性抗体奠定基础。从双峰驼肾组织提取RNA,反转录后PCR扩增出双峰驼CYP2J基因,胶回收纯化后进行TA克隆,连接pMD18-T质粒并转化大肠杆菌DH5α的感受态细胞中,提取质粒进行HindⅢ和KpnⅠ双酶切和PCR鉴定,并借助上述内切酶双酶切重组质粒pMD18-T-CYP2J后,连接于经同样双酶切处理的原核表达载体pET-32a,转化于大肠杆菌DH5α细胞中,并经HindⅢ和KpnⅠ双酶切、PCR鉴定及测序鉴定重组质粒。结果表明,在重组质粒pMD18-T-CYP2J和pET-32a-CYP2J双酶切电泳中均能得到约1500bp的特异性目的条带及两种质粒的特异性条带。以2种重组质粒为模板进行PCR扩增后电泳均能得到约1500bp的CYP2J特异性条带,测序结果与GenBank中公布的双峰驼CYP2J预测序列的相似度为99%。由此可见,本试验成功构建了双峰驼CYP2J基因原核表达载体pET-32a-CYP2J,为后续该基因的高效原核表达和蛋白层面的研究奠定了基础。     

鸭肝炎病毒VP1和VP3基因的克隆及其杆状病毒表达载体的构建

为了构建鸭肝炎病毒VP1和VP3结构蛋白基因的杆状病毒表达载体,以RT-PCR方法扩增鸭肝炎病毒的VP1和VP3基因,克隆至pGEM-T载体。经筛选测序验证后,以BamHⅠ+XhoⅠ双酶切回收VP1和VP3目的片段,与经相同方法处理的杆状病毒转座载体pFastBac1连接,得到重组质粒pFastBac1-VP1和pFastBac1-VP3。将经酶切及测序鉴定的阳性重组质粒转化入含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac,发生转座作用,经抗性及蓝白斑筛选,成功获得各自携带VP1和VP3基因的重组穿梭载体,将其命名为rBacmid-VP1、rBacmid-VP3。研究结果为进一步在昆虫细胞中表达VP1或VP3基因,开发研制鸭肝炎病毒基因工程疫苗奠定了基础。     

H3N8亚型马流感病毒HA基因重组腺病毒的构建及其生物学特性的研究

为了构建表达H3N8亚型马流感病毒HA蛋白的重组腺病毒,把A/Equine/Xinjiang/3/2007(H3N8)的HA基因克隆到腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV中,将重组穿梭质粒pShuttle-XJ3HA电转化至BJ5183感受态细胞中,与人5型腺病毒骨架质粒同源重组,获得了重组腺病毒质粒pAd-XJ3HA。该质粒线性化后转染AD293细胞,包装重组腺病毒rAd-XJ3HA。通过PCR、间接免疫荧光试验(IFA)和Western-blot鉴定,证明HA基因已整合到腺病毒载体基因组中,并能够有效表达。该重组腺病毒在AD293细胞上连续传15代后仍表现出良好的遗传稳定性。马流感病毒HA基因重组腺病毒的成功构建为我国马流感重组病毒活载体疫苗的研究提供了技术储备。     

禽多杀性巴氏杆菌C48-1外膜蛋白H基因真核表达载体的构建

应用限制性内切酶BamHⅠ将片段ompH从重组质粒pMDT-omp H切下,非定向插入真核表达质粒pcDNA3中,经酶切分析、PCR鉴定及序列测定,证实成功构建了禽多杀性巴氏杆菌C48-1外膜蛋白H基因的重组真核表达质粒pcDNA3-ompH。将重组表达质粒转染至 COS7 细胞,经RT-PCR、SDS-PAGE及Western-blotting检测,证明了外膜蛋白H基因获得了瞬时表达。     

比格犬甲状腺显微与超微结构的观察

应用光镜和透射电镜技术,观察了3~6月龄比格犬甲状腺的显微和超微结构。结果表明,比格犬甲状腺实质由滤泡和滤泡旁细胞构成。滤泡呈圆形或椭圆形,直径20.22~220.00μm,平均90.80μm;由单层立方上皮细胞围成,细胞高度3.04~7.11μm,平均5.18μm,电镜下可见功能状态不同的两型滤泡上皮细胞;滤泡旁细胞很多,直径4.40~8.82μm,平均6.23μm,位于滤泡之间或镶嵌于滤泡上皮细胞之间,也可聚集在一起形成滤泡样结构,胞质内含有大量的分泌颗粒,电镜下也可见两种类型的滤泡旁细胞。     

日本经济安全保障理论辨析

日本是对经济安全问题研究比较早的国家之一,形成了独具特色的经济安全保障理论。在日本的经济安全保障理论中,关于什么是经济安全保障以及经济安全保障与军事安全保障、综合安全保障、人类安全保障的关系等问题,在不同的时代产生了各种各样的观点,对此要进行综合地辨析,才能真正理解日本的经济安全保障理论,从而能够更好地理解日本安全保障政策。     

柬埔寨:2010年回顾与2011年展望

2010年,柬埔寨社会稳定、经济稳步发展,在对外关系上奉行独立、和平、永久中立和不结盟的外交政策,虽然柬埔寨与泰国时为边境领土问题爆发冲突,但柬埔寨政府能稳妥处理。     

乳牛L-选择素在中性粒细胞中表达与分布的定位研究

采用间接荧光标记及胶体金标记方法通过流式细胞仪和低压扫描电子显微镜,检测了L-选择素在健康泌乳中期乳牛(A组)及患金黄色葡萄球菌型临床型(B组)和亚临床型乳腺炎乳牛(C组)中性粒细胞上表达的基本规律。结果表明:三者表达L-选择素的中性粒细胞阳性率分别为97.90%、97.69%和96.67%(收集5 000个细胞),组间差异不显著(P>0.05),但患亚临床型乳腺炎乳牛的阳性率从3次测定的结果看是逐渐增加的;L-选择素表达的间接荧光强度组间差异极显著(P<0.01);而患亚临床型乳腺炎的乳牛组内差异也极显著(P<0.01);扫描电镜观察到的中性粒细胞表面脊样结构的分布及形态与流式细胞仪检测的结果具有相似性。     

三聚氰胺对小鼠急性毒性试验中消化系统重要组织器官损伤的病理学观察

为探讨三聚氰胺对急性毒性试验中小鼠的胃、小肠和肝的损伤作用,将32只SPF级昆明小鼠随机分为4组,每组8只,雌雄各半,连续灌服不同剂量的三聚氰胺(0、175、350、700 mg/kg),观察试验小鼠的临床表现,剖检死亡小鼠并取材,观察胃、小肠和肝的病理学变化。结果显示,各试验组小鼠48 h内均全部死亡。光镜下可见死亡小鼠胃和小肠的黏膜层弥漫性坏死,肝细胞脂肪变性,肝小叶弥漫性淤血,甚至有片状出血灶,灶内肝细胞坏死。700 mg/kg组小鼠的胃、小肠及肝血管内均可见多个黄色颗粒状结晶体沉着。在透射电镜下,175 mg/kg和350 mg/kg组小鼠的肝细胞胞浆结构疏松,线粒体肿胀,700 mg/kg组小鼠的肝细胞胞浆中充满脂滴,线粒体弥漫性固缩。表明,三聚氰胺可引起小鼠胃肠黏膜发生急性弥漫性坏死,肝淤血,肝细胞变性,散在坏死,高浓度的三聚氰胺可在胃、小肠和肝间质中形成结晶体。     

云南省红河州山羊流产病原的调查

针对红河州山羊妊娠期流产严重的现象 ,进行了流行病学调查、临床症状观察、病理学检查、实验室诊断、人工感染试验和治疗试验。结果发现 ,妊娠母山羊流产现象覆盖全州 ,且流产率以每年 11.5 0 %的速度递增 ,弓形虫抗体阳性率为 30 .82 % (12 10 / 392 5 ) ,衣原体抗体阳性率为32 .31% (12 6 8/ 392 5 ) ,其中弓形虫和衣原体双重感染阳性羊占 9.35 % (36 7/ 392 5 ) ,未检出布鲁氏菌抗体阳性羊 ;自流产胎儿肺抹片中发现弓形虫滋养体包囊 ,7份流产胎儿中有 6份分离到衣原体 ;用土霉素及复方新诺明治疗有明显效果 ;人工感染试验能复制出与自然病例相同的病例模型。调查结果表明 ,红河州广泛流行的山羊妊娠期流产的病原是弓形虫、衣原体 ,2种病原单一感染或混合感染是造成流产的主要原因。     

旋毛虫新生幼虫cDNA文库的构建

为了克隆和研究旋毛虫新生幼虫功能性抗原基因,采用酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取新生幼虫总RNA,Oligo(dT)纤维素柱纯化mRNA,反转录合成第一链cDNA及第二链cDNA,用CHROMA SPIN-400柱离心层析纯化后,与载体λZAP Express连接.体外包装后得到中国猪旋毛虫(Trichinella spiralis)分离株新生幼虫cDNA文库.文库容量为2.0×106,重组率为98.6%,插入片段长度在0.4×103-2.0×103bp.     

少孢节丛孢菌超微结构的观察研究

观察了捕食线虫性真菌———少孢节丛孢菌的超微结构,以探讨捕食线虫性真菌的杀虫机理。结果显示,少孢节丛孢菌属于隔膜类真菌,隔膜中央有孔,菌丝细胞一般呈长形竹节状;菌株的捕食器为黏性菌环和菌网,形成捕食器的菌丝细胞结构不同于一般的营养菌丝,胞质中含有许多电子密集体,呈大小不等的黑色类圆形颗粒状,多数排列在捕食器菌丝细胞的边缘区域,这是捕食线虫性真菌捕食器菌丝细胞的一个重要特征。     

牛病毒性腹泻病毒p80基因的分段表达及其抗原性分析

为建立以重组p80蛋白为抗原的牛病毒性腹泻(BVD)鉴别诊断ELISA方法,采用PCR方法克隆了BVDV p80基因的A、B、C三段基因片段,分别连接到原核表达载体pGEX-6P1上,获得了重组质粒pGEX-6P1-p80A、pGEX-6P1-p80B和pGEX-6P1-p80C,将其分别转化感受态菌Rosetta和BL21,经1.0 mmol/L的IPTG诱导,分别得到大小为60、47和51 ku的目的蛋白。经Western-blotting分析,3个目的蛋白中,只有p80B(289~477 aa)基因片段所表达的融合蛋白能与BVDV阳性血清反应,表明p80蛋白的免疫优势区域集中在此部位。该融合蛋白可以作为诊断抗原用于建立ELISA诊断方法。     

朝鲜的核、导战略态势及其影响

朝鲜实施导弹发射和地下核试验,意在实现核拥有,籍以提高对美战略的筹码。朝鲜开展核战略角逐由来已久,先后展开过以守为攻;“边缘”对应;将计就计;以硬对强四个回合。角逐结果虽不乏战术上的小胜,却丧失了战略上的大胜。此番的导弹试射与地下核试验可视为第五个回合,是朝鲜核、导角逐战略“以攻为守”的转换。朝鲜执意实现核拥有纵有多种原因,却因核、导本身所拥有的“双刃剑”作用,带来于己、于他都不利的负面影响。包括:自食其言,愈加难以取信于国际社会;产生连锁反映,引发新一轮的军备竞赛;挑战核不扩散条约,难免遭到更大封杀;破坏合作气氛,延缓统一进程;置中国于尴尬境地,动摇中朝关系基础。朝鲜的“自行其事”难免遭到国际社会更加严厉的抵制。