牛IFN-γ单克隆抗体的制备及鉴定

为进一步研究牛IFN-γ(BoIFN-γ)单克隆抗体在牛免疫学以及牛疫病诊断中的应用,用原核表达的重组牛IFN-γ(rHis-BoIFN-γ)免疫6周龄雌性BALB/c小鼠,免疫3次后取其脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0进行融合。用建立的间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,经3～5次亚克隆,最终获得12株能稳定分泌抗体的阳性杂交瘤细胞株。Ig亚类鉴定结果显示这12株杂交瘤细胞均为IgG,其中5株为IgG1,3株为IgG2a,4株为IgG2b。这12株杂交瘤细胞在体外具有稳定分泌抗牛IFN-γ单克隆抗体的能力。Western-blot及间接ELISA证明这12株单克隆抗体均可特异性地结合rBoIFN-γ蛋白。间接免疫荧光试验显示,这12株单抗均与真核细胞BHK-21表达的rBoIFN-γ产生荧光反应,证明这些单抗能够与接近天然的BoIFN-γ反应,证实了单抗的特异性。ELISA叠加试验表明,3C2与1H4、1G6与1G4针对不同表位,1A10、1B2、2B9、3C4四株和1C1与1G6、1G4与3C2、1A10与1G8针对相同或相近的表位。     

鸡IFN-γ单克隆抗体的制备及其识别区的鉴定

IFN-γ是鸡体内一种重要的细胞因子,为制备鸡IFN-γ的单克隆抗体,以ch IFN-γ-His融合蛋白免疫BALB/c小鼠,经3次免疫后分离出脾细胞与骨髓瘤细胞系(SP2/0)进行融合,经单克隆培养,筛选得到4株能稳定分泌单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为2A10、2B10、4D10和4F9。应用间接ELISA方法鉴定4株单抗的重链类型分别为IgG2a、IgG1、IgG1和IgG2b。通过间接ELISA方法测定4株单抗的亲和力解离常数(Kd)分别为1.06×10~(-10)、7.35×10`(-10)、1.10×10~(-10)和9.34×10~(-10),表明4株单抗均为高亲和力抗体。将ch IFN-γ的C端、N端同时进行表达,应用Western-blot方法鉴定4株单抗的抗原识别表位分别为chIFN-γ的47-100位氨基酸,101-145位氨基酸和1-46位氨基酸。应用Western-blot方法鉴定4株单抗的特异性,4株单抗均能识别原核表达的重组蛋白chIFN-γ,而不识别鸡ch IL-2、ch IL-4、ch IL-10蛋白,表明4株单抗特异性良好。原核表达chIFN-γ蛋白制备单克隆抗体效果良好,为进一步研究chIFN-γ的功能奠定了基础。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3A单克隆抗体的制备和鉴定

以原核表达并纯化的口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白3A免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,用间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞,有限稀释法进行亚克隆,获得3株能稳定分泌抗3A蛋白单抗的杂交瘤细胞,分别命名为3H2、4B1、7F5,并对这3株单抗进行了生物学鉴定。结果显示,单抗3H2和4B1为IgG2a亚型,7F5为IgG2b亚型。单抗7F5针对的表位与3H2和4B1两株单抗的表位不一致;这3株单抗均能够与FMDV特异性结合,且单抗4B1与所有3A相关蛋白均反应。稳定性鉴定结果表明,获得的3株杂交瘤细胞均能稳定分泌单克隆抗体。研究结果为进一步探索3A蛋白的结构和功能以及建立诊断方法奠定了基础。     

抗鹅细小病毒VP3蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

利用已构建好的pET-30a重组菌E.coli Rosetta(DE3)表达鹅细小病毒(GPV)VP3重组蛋白,经Ni-NTA亲和层析纯化后作为免疫原,经腹膜腔接种4～6周龄BALB/c小鼠3次,末次免疫后第3d取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合。用建立的间接ELISA方法进行筛选,经4次亚克隆,最终获得4株能稳定分泌抗GPVVP3单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1F1、2A9、3B11和4A2。亚类鉴定结果显示,单抗1F1为IgG2b亚型,其余3株单抗为IgG1亚型,轻链均为κ链。经间接ELISA检测,单抗1F1、2A9、3B11和4A2的腹水效价分别为1:819200、1:1638400、1:409600和1:819200。Western-blot分析表明,获得的4株单克隆抗体均能特异性识别GPVVP3重组蛋白;间接免疫荧光试验证明,这4株单抗能够与天然GPV结合。     

抗兔出血症病毒单克隆抗体的制备

用1∶10稀释的兔出血症病毒(RHDV)加等量佐剂乳化后接种BALB/C小鼠3次,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合。通过用间接ELISA试验筛选、克隆出分泌抗RHDV单克隆抗体的杂交瘤细胞林E_3E_6。     

马流感病毒NP单克隆抗体的制备及特性鉴定

利用原核表达的马流感病毒(EIV)核蛋白(NP)为免疫原,经腹腔接种4周龄BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经4次有限稀释法克隆和间接ELISA法筛选,获得了3株稳定分泌单抗的杂交瘤细胞株2G11、3E10和4A1,并对它们进行了亚类鉴定、间接ELISA检测和特性鉴定。结果显示,单抗2G11为IgG1亚型,3E10为IgG2a亚型,4A1为IgM亚型,轻链均为κ链。单抗2G11、3E10和4A1的细胞上清液及腹水效价分别为1∶640、1∶640、1∶320和1∶409 600、1∶204 800、0。这3株单抗均能特异性识别EIV NP重组蛋白,并且能够与天然EIV结合;获得的3株单抗与马动脉炎病毒、马疱疹病毒1型、马疱疹病毒4型、马乙型脑炎病毒均不发生交叉反应。亲和力试验结果显示,单抗2G11和3E10与EIV的亲和力常数分别为4.39×106 M-1和2.20×106 M-1。     

猪传染性胃肠炎病毒重组N蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

以纯化的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)重组N蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,通过间接ELISA法对融合细胞进行筛选,采用有限稀释法对阳性细胞进行4次亚克隆,获得了3株能稳定分泌N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为JY(4)-1、JY(4)-2、JY(4)-3.分别采用体外培养法、诱导腹水法和实体瘤法制备单克隆抗体,并用间接ELISA法检测其效价,结果显示,这3株杂交瘤细胞的细胞培养上清、小鼠腹水和血清的单抗效价均分别为1:512、1:10~5、1:10~5,其中以诱导腹水法制备的单抗产量和效价最佳.间接免疫荧光试验结果显示,这3株单抗均能与TGEV感染的ST细胞产生特异性免疫荧光,而不与猪细小病毒、猪生殖与呼吸综合征病毒、猪轮状病毒等发生交叉反应;经鉴定,3株单抗的亚类均为IgG2a,这3株杂交瘤细胞具有良好的遗传稳定性.     

猪肺炎霉形体热休克蛋白Hsp70单克隆抗体的制备及鉴定

以肺炎霉体体(Mhp)Yin-1株为模板,利用所合成的引物扩增了伴侣蛋白DnaK(热休克蛋白Hsp70)C末端基因,将得到的目的片段分别克隆至表达载体pET-28a和pGEX-6P-1中,原核表达获得了重组蛋白6P-1-DnakC和28a-DnakC,经Western-blot分析,均能被Mhp抗血清识别.以28a-DnakC作为包被抗原,建立了间接ELISA检测方法,以6P-1-DnakC为免疫抗原,免疫BALB/c小鼠.筛选和鉴定了2株分泌抗DnaK的杂交瘤细胞株,命名为1AD10、2AF11.Western-blotting结果表明,这2株单抗与Mhp发生特异性反应而不与其他相关霉形体发生反应.抗体亚类鉴定结果显示,1AD10、2AF111分别为IgG2b和IgG2a亚类,且轻链均为κ链.相加ELISA试验表明,2株单抗能识别不同的抗原表位.     

猪脑心肌炎病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

利用纯化的猪脑心肌炎病毒(EMCV)VP1重组蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤细胞技术,获得了2株稳定分泌抗EMCV VP1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为10B和11D。经ELISA测定,2株杂交瘤细胞培养上清效价分别为1∶1 600和1∶800,接种小鼠的腹水效价分别为1∶2.56×106和1∶1.28×106。2株单抗的亚类均为IgG2a,均能特异性识别重组VP1蛋白,但它们识别VP1蛋白的不同表位。间接免疫荧光和免疫组织化学试验证实,2株单抗具有良好的特异性,均能够识别EMCV。     

抗山羊IgMμ链单克隆抗体的制备及鉴定

将构建的山羊IgMμ链的原核表达重组质粒pET30a-IgMμ转化至大肠杆菌BL21中,诱导表达获得重组蛋白His-IgMμ;以Ni-NTA亲和层析法纯化His-IgMμ重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,经细胞融合、抗体筛选和细胞克隆等杂交瘤细胞技术,筛选能稳定分泌抗山羊IgMμ链单克隆抗体的杂交瘤细胞株;采用小鼠腹腔诱生腹水的方法制备出抗IgMμ链单抗,并鉴定单抗的生物学特性。结果,成功构建了重组表达载体pET30a-IgMμ,诱导表达、纯化得到了目的蛋白;获得了4株能稳定分泌抗山羊IgMμ链单克隆抗体的杂交瘤细胞株,4株单抗腹水的效价均达到了1×10~(-4)以上,其中1D8、5D1和6G10株单抗亚型为IgG1,9H8株的亚型为IgG 2a,轻链均为κ;1D8、5D1、6G10和9H8的亲和力平衡解离常数KD分别为1.87×10~(-11)、8.46×10~(-7)、4.26×10~(-9)和4.07×10~(-10);经Western-blot鉴定,单克隆抗体6G10能特异性识别原核表达的HisIgMμ蛋白。上述研究结果表明,本研究获得了4株高亲和力和效价的抗山羊IgMμ链特异性单克隆抗体,这为山羊感染性疾病的早期诊断、预报预警和防控提供了基础条件。