猪圆环病毒3型PCR诊断方法的建立

根据NCBI中PCV3的基因组序列,设计了1对特异性引物,并对PCR的反应体系和反应条件进行优化,同时进行特异性和敏感性试验,最后应用所建立的PCR方法检测了临床送检的22份病料。结果显示,建立的PCR方法的最佳反应条件为总体积25 L,退火温度56℃,模板DNA量3 L(l ng/m L),进行35个循环。该PCR能特异地扩增出目的片段,长度约为381 bp。测序结果表明,PCR扩增产物正确。该PCR反应特异性强,只能扩增PCV3阳性样品,且能扩增的最低模板量为1×10-4ng/m L。用该PCR对送检的22份病料进行PCV3检测,结果阳性率为13.6%。可见,本研究建立的PCR方法特异、敏感,可用于PCV3的快速检测。     

猫传染性腹膜炎病毒实时荧光定量PCR方法的建立与应用

为建立一种高效准确检测猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)的实时荧光定量PCR方法,以FIPV N基因为靶基因设计特异性探针和引物,构建质粒标准品。通过优化反应条件,建立real-time PCR方法,并进行临床检测。经方法优化,所建立方法的标准曲线为y=-3.137x+42.243,R²值为0.999,扩增效率E为108.0%。该方法与猫瘟病毒(FPV)、猫疱疹病毒(FHV)和猫杯状病毒(FCV)无交叉反应,特异性良好;检测最低拷贝数为9.250 copies/μL,比常规PCR方法高出100倍;组内、组间变异系数均小于5.0%,重复性好。采用建立的方法和EvaGreen real-time PCR方法对39份临床样品进行检测,结果,检出阳性样品数分别为24和22,经Kappa检验,两者高度一致。上述结果表明,本研究成功建立了高效、敏感、特异的实时荧光定量PCR方法,可用于FIPV的临床病例检测。     

猫疱疹病毒Ⅰ型PCR检测方法的建立及初步应用

本研究旨在建立猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)PCR检测方法,并将其应用于临床样品FHV-1的快速检测。根据GenBank已发表的FHV-1 TK基因序列的保守区域设计合成1对引物,通过对反应体系的优化,建立了FHV-1 PCR检测方法,并验证该方法的特异性、敏感性、稳定性。结果显示,本研究建立的FHV-1 PCR检测方法对猫杯状病毒(FCV)、猫细小病毒(FPV)、犬瘟热病毒(CDV)均无交叉反应;可检测病毒DNA模板的最低浓度为3.78×101copies/μL;应用该方法从22份猫临床样品中检出17份FHV-1核酸阳性样品。上述结果表明,本研究建立的FHV-1 PCR检测方法特异、灵敏、快速、可重复,适合于临床FHV-1的快速检测。     

犬源环孢子虫PCR检测方法的建立

为了建立犬源环孢子虫的PCR检测方法,根据该环孢子虫18SrDNA基因序列,设计1对特异性引物;通过阳性参照摸索出该检测方法的最佳反应条件,进行了特异性和敏感性试验;并对临床样品进行了检测。结果显示,该PCR检测方法能特异性地扩增出犬源环孢子虫18SrDNA中379bp的片段,与牛源环孢子虫、柔嫩艾美耳球虫、人隐孢子虫、蓝氏贾第虫、刚第弓形虫、毛首线虫、大片吸虫、犬弓首蛔虫等8种虫体基因组DNA无交叉反应;最低能检测到84fg的阳性参照DNA,检测的157份临床样品中8份为阳性,比传统镜检方法多出3份。结果表明,建立的PCR检测方法具有较高的特异性和敏感性,可用于犬环孢子虫的临床检测。     

野生动物捻转血矛线虫的分子鉴定及PCR检测方法的建立

为了对野生动物捻转血矛线虫进行分子鉴定并建立特异性PCR检测方法,基于ITS序列,对草食类野生动物粪便中毛圆线虫虫卵及幼虫DNA进行分子鉴定,并比较粪便和虫体样品的PCR扩增效果;基于ITS1序列建立了特异性PCR检测方法,并对20份临床粪样进行了检测。结果显示,2种草食动物(长颈鹿、弯角剑羚)粪便和虫体样品均扩增出ITS1和ITS2片段,且虫体DNA比虫卵DNA的扩增效果更好;经系统发育分析和BLAST比对,该毛圆线虫分离株属于毛圆科血矛属,与基因库中多株捻转血矛线虫ITS1和ITS2序列的相似性为98%~99%。结果表明,基于ITS1序列建立的PCR检测方法具有良好的特异性和敏感性,与幼虫鉴定法的符合率为95%,高于粪便虫卵检查法(70%),具有一定的临床应用价值。     

以toxR-S为靶基因的副溶血弧菌PCR检测方法的建立

目前,副溶血弧菌PCR检测方法大多基于毒力基因或看家基因,存在假阳性和漏检的风险,建立敏感而特异的快速分子检测方法迫在眉睫。本研究在对toxRS基因序列进行系统发育树构建及同源性分析的基础上,发现toxR、toxS基因均有作为种特异性检测靶基因的可能,故分别设计引物Primers-R、Primers-S及Primers-R-S,通过优化PCR反应条件建立了相应的PCR检测方法。通过对57株副溶血弧菌和19株亲缘相近菌及食源性致病菌的检测,toxR-SPCR显示出较好的稳定性和特异性,检测极限达2pg基因组DNA。对359份市场海产品样品的比对检测结果表明,toxR-S PCR与国标(GB4789.7-2013)规定的方法的符合率高达95.82%,敏感性100%,特异性92.39%。对两种方法检测时阳性不一致的15份样品,以其总细菌DNA为模板扩增副溶血弧菌看家基因;测序比对结果显示,这15份样品与副溶血弧菌同源性高达97%以上。上述结果表明,本研究建立的toxR-S PCR具有快速、特异、敏感等优点,可被广泛用于副溶血弧菌的快速检测。     

牛瑟氏泰勒虫二温式PCR检测方法的建立及应用

为建立一种能快速、特异、敏感地检测牛瑟氏泰勒虫的方法,根据GenBank中的牛瑟氏泰勒虫MPSP基因(GQ180198.1)设计合成了1对特异性引物,建立了检测牛瑟氏泰勒虫的二温式PCR方法。该方法与犬新孢子虫、猪支原体和弓形虫RH株均无交叉反应,能检测到的最低DNA含量为1.7pg/μL。结果表明,该二温式PCR检测方法具有较高的特异性和敏感性。本研究为牛瑟氏泰勒虫的快速检测提供了一种方法。     

卵形巴贝斯虫荧光定量PCR方法的建立及初步应用

为建立一种检测感染牛的卵形巴贝斯虫的敏感、快速方法,本研究根据GenBank中登录的卵形巴贝斯虫18S rRNA保守区设计1对特异引物,通过优化反应条件,建立了检测卵形巴贝斯虫荧光定量PCR方法。结果显示,该方法可以特异地检测出卵形巴贝斯虫DNA,对瑟氏泰勒虫、牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫DNA的检测均为阴性;该方法的灵敏度可达1.26 copies/μL,比普通PCR灵敏度高100倍。组内及组间重复试验的变异系数均小于3%。对60份临床牛血液DNA样本进行检测,荧光定量PCR和常规PCR的阳性检出率分别为41.67%和33.33%。结果表明,本试验建立的荧光定量PCR方法可用于对卵形巴贝斯虫定量分析和卵形巴贝斯虫病的分子流行病学调查。     

猫细小病毒和猫疱疹病毒1型双重TaqMan探针荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立同时检测猫细小病毒（FPV）和猫疱疹病毒1型（FHV-1）的双重荧光定量PCR方法,针对FPV的VP2基因、FHV-1的UL21基因设计特异性引物和TaqMan探针,通过优化反应条件,建立了双重荧光定量PCR方法,并绘制了标准曲线,其相关系数（R2）均为0.999,具有良好的线性关系。结果显示,FPV、FHV-1最低检测限分别为4.87和2.21 copies/μL;对猫的常见病毒及细菌均无非特异反应;批内、批间试验的变异系数均小于2%。证明该方法灵敏度高、特异性强、重复性好。用建立的方法对178份样本进行检测,结果,FPV和FHV-1的阳性检出率分别为73.65%和16.85%,二者混感阳性率为15.73%,与临床确诊结果一致。上述结果表明,本研究建立的方法可用于FPV、FHV-1感染的早期诊断、定量检测和流行病学调查等。     

猪弓形虫病特异PCR诊断方法的建立

以核糖体DNA第一内转录间隔区(ITS1)序列作为弓形虫种特异的遗传标记,建立了猪弓形虫病特异PCR诊断方法。应用人工感染的方法建立了猪弓形虫病动物模型,摸索出猪弓形虫病PCR检测的最佳条件。敏感性和特异性试验结果显示,该PCR方法最低能检测到10 个弓形虫速殖子的DNA,且与相关的8种原虫和线虫均无交叉反应,证明该PCR方法具有高度的敏感性和特异性。动物感染试验结果证明,在试验猪出现明显临床症状时(感染后第5 d),对取材的8 个组织样品用该PCR方法检测,有6个组织样品为阳性,其中检出率最高的组织为肺门淋巴结。     

山羊支原体山羊肺炎亚种TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立和应用

为了快速诊断和定量检测山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasma capricolumsubsp.capripneumoniae,Mccp),选择Mccp arc D基因为靶序列,设计特异性引物和探针,建立并优化反应体系,以Mccp和其他支原体及细菌等16种病原体基因组DNA为模板,进行普通PCR和TaqMan探针实时荧光定量PCR特异性检测,并对该方法的敏感性和重复性进行评估。同时利用该方法对68份山羊临床样本进行检测。结果显示,仅Mccp有扩增条带(185 bp)和明显的荧光扩增信号(Ct值为21.93),其余供试菌株没有扩增条带,且表现出微弱的荧光扩增信号(Ct值均大于31)。普通PCR检测的灵敏度为5.96×104copies/L,而TaqMan探针实时荧光定量PCR检测的灵敏度为5.96 copies/L。Ct值在组内和组间重复的变异系数均小于1%。对68份山羊临床样本进行TaqMan探针实时荧光定量PCR检测,结果有2份为Mccp阳性样本,阳性率为2.94%。本研究建立了一种特异、敏感、稳定可靠的Mccp TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,可用于Mccp的快速诊断和定量检测,为山羊传染性胸膜肺炎的防控提供了有效的技术手段。     

猪鼻支原体荧光PCR检测方法的建立和应用

为了建立猪鼻支原体（Mycoplasma hyorhinis）快速荧光PCR检测方法,本研究合成了该病原特异性基因P37的重组质粒,根据该基因设计荧光PCR引物和探针,并对设计的引物和探针的特异性、敏感性和重复性进行了检测。结果显示,该方法具有高度的特异性,除了识别猪鼻支原体基因组外,对猪的基因组和猪常见病原的基因组均不发生交叉反应。在敏感性和重复性试验中,该方法对猪鼻支原体的检测限为1 000copies/m L,变异系数小于3%,因此具有优良的敏感性和稳定性。用该方法检测临床样本,阳性检出率为76%(38/50),远高于普通PCR的阳性检出率（40%,20/50）。上述结果表明,本研究建立的荧光PCR方法在特异性、敏感性和稳定性方面均满足猪鼻支原体的临床检测要求,可以用于猪鼻支原体临床样品的检测。     

牛结节性皮肤病病毒野毒株TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法的建立

为鉴别牛结节性皮肤病病毒野毒株(wild type lumpy skin disease virus,WT LSDV),本研究根据GenBank中发表的WT LSDV全基因组序列,设计并合成1对特异性引物和MGB探针,优化反应条件,建立了鉴别检测WT LSDV的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法。结果显示,该方法仅对WT LSDV核酸有特异性扩增,对LSDV疫苗株等其他病毒核酸无交叉反应;标准曲线在一定浓度范围内呈现良好的线性关系,标准曲线为y=-3.361 x+34.979,R~20.999,扩增效率为98.39%,最低检测限为4.6 copies/μL。组内、组间重复性试验的变异系数均小于3%。对63份模拟临床样品的检测结果显示,本研究建立荧光定量PCR方法的阳性检出率为90.57%,OIE推荐的普通PCR方法的阳性检出率为64.15%,两种方法检测临床样品均为WT LSDV核酸阴性。结果表明,建立的WT LSDV TaqMan-MGB荧光定量PCR方法特异、敏感、快速、重复性好,且能快速准确地检测WT LSDV,适用于临床样品的鉴别检测,为该病的鉴别、监测、防控提供了技术支撑。     

猪胸膜肺炎放线杆菌半套式PCR检测方法的建立及应用

根据1型胸膜肺炎放线杆菌apx Ⅳ A基因3'端序列设计3条引物,建立了检测猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)的半套式PCR方法.筛选了该方法的最佳反应条件,并采用该方法进行临诊检测,比较了不同处理临床样品的检测结果.结果表明,该方法能检测出所有供试血清型APP,不能从猪上呼吸道常见细菌基因组DNA中扩增出条带,特异性好;最低DNA检出量为16.5 fg,其灵敏性是常规PCR方法的1 000倍;重复性试验结果表明,该方法稳定可靠.应用半套式PCR方法检测临床样品,检出率显著高于细菌分离鉴定;样品保存方法和核酸抽提方法能影响阳性样品的检出率.     

猫疱疹病毒Ⅰ型RAA检测方法的建立与应用

为建立一种快速检测猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)的方法,本研究根据GenBank上登录的FHV-1 UL55序列设计特异性探针及引物,筛选最佳引物对,建立了FHV-1的重组酶介导等温扩增(RAA)检测方法。该方法在39℃反应20 min即可快速、特异性地检测FHV-1。灵敏性试验结果显示,RAA最低检测限为7.60×10¹ copies/μL,比普通PCR最低检测限高100倍。特异性试验结果显示,该RAA方法与猫杯状病毒、猫传染性腹膜炎病毒、猫细小病毒无交叉反应。对34份临床样本进行检测,其中13份为阳性,阳性检出率为38.23%。综上所述,本研究成功建立了猫疱疹病毒Ⅰ型RAA检测方法。     

山羊皮下脓肿病原菌三重PCR检测方法的建立与应用

为同时检测伪结核棒状杆菌、金黄色葡萄球菌和化脓隐秘杆菌3种引起山羊皮下脓肿的主要病原菌,选择针对这3种病原的特异性引物,经条件优化后建立一种可同时检测以上3种病原菌的三重PCR方法,评价了该方法的特异性和敏感性,并检测了临床样品。结果显示,所建立的三重PCR方法仅对伪结核棒状杆菌、金黄色葡萄球菌及化脓隐秘杆菌这3种目的病原菌DNA产生阳性扩增,对大肠杆菌等其他9种微生物的DNA扩增结果均为阴性,具有较强的特异性。该方法同时显示较高的敏感性,对伪结核棒状杆菌、金黄色葡萄球菌和化脓隐秘杆菌基因组DNA的检测下限分别为1.0×103、1.1×103和6.7×102copies;对3种病原菌菌液的检测下限分别为8.7×102、1.1×102和5.1×102CFU/mL。该方法能从临床样品中检测到相应病原,其结果与单一PCR方法一致。本研究中建立了同时检测山羊皮下脓肿主要病原菌的特异和灵敏的三重PCR方法,为该病的快速诊断提供了有用的技术手段。     

猪圆环病毒2型TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

根据猪圆环病毒2型(PCV2)ORF1基因的保守序列,设计合成了1对特异引物和1条探针,以PCV2全基因阳性质粒作为标准品,经反应条件优化,建立了一种检测PCV2的荧光定量PCR方法。对该方法进行特异性、敏感性和重复性试验,结果显示,该方法可特异地检测PCV2,而与PCV1等猪病病毒不发生交叉反应;该方法的灵敏度可达1×102copies/μL,比常规PCR高100倍;3次重复检测的变异系数均小于5%。用建立的荧光定量PCR和常规PCR分别对94份临床样品进行检测,荧光定量PCR的阳性检出率为51.06%,而常规PCR的阳性检出率仅为38.30%。证实,建立的方法具有快速、特异、灵敏、重复性好、定量、安全等优点,可用于PCV2的临床检测。     

猪链球菌血清2型环介导等温扩增快速检测方法的建立

为了建立快速、灵敏的猪链球菌血清2型(SS2)LAMP检测方法,根据GenBank登录的SS2特异的荚膜多糖(cps2 H)基因序列作为检测靶标,在其序列的保守区域设计LAMP引物,利用参考菌株S735基因组DNA为模板进行扩增,优化了LAMP的反应条件和反应体系,并进行了敏感性、特异性和重复性试验。结果,利用建立的LAMP方法对SS2进行扩增,扩增产物显色呈现阳性反应,电泳出现阶梯状条带,最低检测量为0.186fg/μL模板DNA,比常规PCR高1 000倍;且与其他常见的细菌无交叉反应。结果表明,建立的LAMP方法具有灵敏、特异、快速和重复性强等优点,适用于猪链球菌病的实验室快速检测。     

牛无浆体PCR检测方法的建立及应用

为建立快速、特异、敏感的牛无浆体(Anaplasma bovis)PCR检测方法及了解新疆部分地区牛无浆体感染情况,根据牛无浆体16S rRNA基因序列(MH255941.1)设计1对引物,建立了检测牛无浆体PCR方法,并进行特异性、敏感性、重复性试验、临床样品检测及系统进化分析。结果显示,所建立的方法能特异性地鉴别牛无浆体,与环形泰勒虫(Theileria annulata)、绵羊无浆体(A. ovis)、牛巴贝斯虫(Babesia bovis)、双芽巴贝斯虫(B. bigemina)基因组均无交叉反应,该方法检测下限可达到1.02×10~(-18)g/μL,比文献报道的PCR敏感10倍(8.9×10~(-18)g/μL);具有良好的重复性;对94份牛临床血液样品检测结果表明,牛无浆体的阳性率为54.3%(51/94),高于文献报道的PCR方法的检测结果 37.2%(35/94);系统进化树显示,三个地区的牛无浆体菌株都不在同一分支上。结论,成功构建了牛无浆体PCR快速检测方法,这为牛无浆体的快速诊断及流行病学调查奠定基础。     

猫杯状病毒纳米PCR检测方法的建立

为了提高猫杯状病毒(FCV)的检测效率,参考FCV全基因组序列的保守区域,利用生物学软件Primer Premier 5.0设计1对FCV特异性引物,并建立了FCV纳米PCR检测方法。结果显示,该方法特异性良好,与其他常见的猫病毒性病原均无交叉反应;该方法敏感性良好,最低检测量为5.4×10~(-3)pg/μL的标准品,是普通PCR的10倍。重复性试验结果显示,3批次重复试验结果保持一致,重复性良好。综上所述,建立的FCV纳米PCR方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性,可作为FCV感染的实验室诊断的技术方法。