鸡传染性法氏囊病灭活疫苗免疫鸡中和抗体效价与攻毒保护力的相关关系

为了探讨鸡传染性法氏囊病病毒中和抗体效价与攻毒保护力的相关关系,以不同剂量的鸡新城疫、传染性法氏囊病二联灭活疫苗免疫21日龄的SPF鸡,免疫后采血测定鸡传染性法氏囊病病毒中和抗体,并用传染性法氏囊病病毒强毒攻击,攻毒后第72小时,剖检所有试验鸡,观察鸡法氏囊等器官病变。将每只试验鸡的传染性法氏囊病病毒中和抗体效价与攻毒保护情况进行一一对照。结果显示,当传染性法氏囊病病毒的中和抗体效价≥1∶16 384(214)时,可获得100%的保护;效价为1∶8 192(213)时,保护率为95.5%;效价为1∶4 096(212)时,保护率为92.9%;效价为1∶2 048(211)时,保护率为86.1%;效价为1∶1 024(210)时,保护率为76.5%;效价为1∶512(29)时,保护率为53.3%;效价为1∶256(28)时,保护率为33.3%,效价≤1∶128(27)时,保护率为0。试验证明,鸡传染性法氏囊病病毒中和抗体效价与攻毒保护力密切相关。     

鸡毒支原体丙酮酸脱氢酶E1β亚基单克隆抗体的制备和鉴定

为制备鸡毒支原体丙酮酸脱氢酶E1β亚基(PDHB)的单克隆抗体,将鸡毒支原体Rlow株的pdhb基因进行克隆和原核表达。表达产物纯化后作为免疫原,按常规方法免疫BALB/c小鼠。取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经过克隆和筛选,获得3株能稳定分泌抗鸡毒支原体PDHB抗体的杂交瘤细胞株,分别被命名为2D11、3B5和4D9。ELISA检测结果表明,3株杂交瘤细胞培养上清的抗体效价为1∶1 024~1∶2 048,小鼠腹水的抗体效价为1∶12 800~1∶25 600。单克隆抗体特异性试验显示,获得的腹水单克隆抗体均能与鸡毒支原体各菌株发生反应,而不与其他禽类病原发生反应。3株单克隆抗体的抗体亚型均为IgG1,轻链均为κ链。稳定性鉴定结果表明,获得的3株杂交瘤细胞均能稳定分泌单克隆抗体。鸡毒支原体PDHB单克隆抗体的成功制备,为研究丙酮酸脱氢酶的生物学功能和进一步建立检测方法奠定了基础。     

牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

在MDBK细胞上增殖牛病毒性腹泻病毒(BVDV)HN 1 株,用蔗糖密度梯度离心法纯化后免疫BALB/c小鼠,应用淋巴细胞杂交瘤技术,取脾细胞并与NS0 骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA筛选,3次有限稀释法克隆,得到4株能稳定分泌抗BVDV单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株:3A8、3C7、3C11和3E9。经鉴定,3A8、3C7、3E9株为IgG1亚类,3C11株为IgG2a亚类;杂交瘤细胞的平均染色体数目为99 条。3A8、3C7、3E9、3C11 与BCV、BRV均无交叉反应,但3A8、3C7、3E9与HCV、BDV存在交叉反应,而3C11与HCV、BDV无交叉反应,3C11显示出较好的特异性;杂交瘤细胞培养上清液及小鼠腹水McAb的ELISA效价分别为1∶1 000 和1∶200 000,该杂交瘤细胞连续培养20代后仍能稳定分泌抗体。这些McAb的获得为BVDV的研究及快速诊断方法的建立奠定了基础。     

猪链球菌2型人源分离株MRP单克隆抗体的制备与鉴定

为建立一种针对猪链球菌2型(SS2)毒力因子的特异性检测方法,研制了抗SS2溶菌酶释放蛋白(MRP)单克隆抗体(McAb),并对其生物学活性进行了分析.将表达、纯化的SS2菌株MRP免疫BALB/c小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术将免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,以纯化的MRP蛋白作为包被抗原,通过间接ELISA方法筛选获得了6株能稳定分泌抗MRP McAb的杂交瘤细胞系288、3G5、1G1、3G9、186和2C3.经用间接ELISA方法测定,单抗腹水的抗体效价均超过1105,杂交瘤细胞培养上清液的效价为1128～11 024.western-blotting鉴定结果表明,6株单抗均具有特异的生物学活性;以2B8单抗腹水和SS2多克隆抗血清建立的夹心ELISA方法可特异地检测MRP.     

蓝舌病病毒单克隆抗体的制备及生物学特性鉴定

以纯化的蓝舌病病毒(BTV)11型VP7免疫BALB/c小鼠,运用淋巴细胞杂交瘤技术,借助间接ELISA筛选,获得了3株分泌抗BTV11 VP7的群特异性单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株,命名为C12D9、B4 F3、E1 A7.这3株杂交瘤细胞株连续传代3个月再经液氮冻存6个月后复苏培养,仍能稳定分泌特异性McAb.3株McAb均具有ELISA特性和免疫沉淀特性,其中C12D9株上清液的ELISA效价为1256,腹水的ELISA效价为10-6.亚类鉴定,C12D9株为小鼠IgG1,B4F3、E1 A7为IgG2a和IgG2b.琼脂免疫扩散试验和间接ELISA试验表明,这3株均与BTV11型VP7发生特异性反应,为BTV群特异性McAb.     

马立克氏病病毒gE蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为了获得分泌抗鸡马立克氏病病毒(MDV)gE囊膜糖蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,将pGEX-6P-1表达的重组蛋白gE作为抗原,免疫BALB/c小鼠,通过淋巴细胞杂交瘤技术,共筛选获得4株能够稳定分泌抗MDV gE蛋白抗体的杂交瘤细胞株。抗体亚型鉴定结果表明,4株均为IgG1型,轻链为κ链。间接免疫荧光结果显示,4株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体均能特异性识别MDV,并具有一定的中和活性。本研究对MDV诊断、抗原表位分析及鉴定等具有重要的应用价值。     

具有中和活性的鸭肠炎病毒单克隆抗体的制备与鉴定

为制备抗鸭肠炎病毒(DEV)的单克隆抗体(MAb)并对其生物学活性进行鉴定,本研究采用蔗糖密度梯度离心法提纯DEV鸭胚成纤维细胞适应毒,以此作为抗原免疫BALB/c小鼠,随后取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,有限稀释法克隆杂交瘤细胞株,经间接ELISA筛选,获得了1株稳定分泌抗DEV MAb的杂交瘤细胞株2E3。鉴定结果显示,该MAb为Ig M亚类,ELISA效价可达到1∶10~5以上;间接免疫荧光试验(IFA)中MAb可与细胞中增殖的DEV结合,Western-blot试验中MAb不与变性病毒蛋白作用,表明该MAb可能是构象表位的单抗;病毒中和试验表明,该MAb具有较强的病毒中和活性。上述结果表明,本试验获得的一株具有DEV中和活性的MAb杂交瘤细胞株为建立DEV的检测方法和DEV的相关研究提供了材料支持。     

鸭肠炎病毒单克隆抗体的制备

采用差速离心和蔗糖密度梯度离心法提纯鸭肠炎病毒 (DEV)鸭胚成纤维细胞适应毒 ,免疫BALB/c小鼠 ,取脾细胞与SP2 / 0骨髓瘤细胞融合 ,经间接ELISA筛选 ,有限稀释法 3次克隆 ,获得了 2株稳定分泌DEV单克隆抗体的杂交瘤细胞株 1B6和 2G8。经鉴定 ,2株单克隆抗体分别为IgM和IgG1 亚类 ,腹水ELISA效价均达到 1∶1 0 7以上。以 2G8单抗腹水为材料 ,采用间接免疫荧光抗体技术对DEV标准毒感染的鸭胚成纤维细胞进行检测 ,结果表明 ,用该抗体可特异性检出接毒后 6h感染细胞中的DEV ,且感染后 4 8h免疫荧光强度最高 ,该单抗与细胞成分和鸭肝炎病毒无交叉反应。将杂交瘤细胞冻存 3和 6个月 ,复苏后仍能稳定分泌单克隆抗体     

犬瘟热病毒H蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为制备犬瘟热病毒(CDV)H蛋白单克隆抗体,采用蔗糖密度梯度离心法提纯CDV-Ondetstepoort株,利用RT-PCR方法扩增其H基因截短片段(H1、H2、H3),克隆至pET-28a (+)载体并转化至大肠杆菌Rosetta感受态细胞中进行原核表达,用Ni-NTA亲和层析柱纯化3种截短H蛋白;以纯化病毒为抗原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,采用间接ELISA、间接免疫荧光法(IFA)和病毒中和试验分析杂交瘤细胞的生物学特性。结果表明,纯化的截短H蛋白表达正确,以此筛选到7株能稳定分泌犬瘟热病毒和重组H2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株(3B1、3B5、3C5、3D5、5A6、4G12和7B2),抗体亚类鉴定均为Ig G1κ;IFA检测均为阳性,表明7种单克隆抗体特异性好;病毒中和试验测定其培养上清的抗体中和效价为24～28,诱生BALB/c小鼠腹水的抗体中和效价为1×102～1×106;间接ELISA叠加试验显示,3B5、4G12、5A6、7B2之间的叠加系数均在50%以上,表明这4种单克隆抗体识别不同抗原表位;另外,3B5、4G12、5A6、7B2还能中和当前流行的Asia 1型CDV毒株,具有较好的广谱中和活性。本研究为后续CDV感染的免疫治疗和CDV检测方法的建立提供了材料基础。     

抗弓形虫单克隆抗体试剂的研究——分泌抗弓形虫单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

本研究选用了弓形虫QHO株活虫抗原免疫BALB/C小鼠,摘取脾细胞与SP_2/O骨髓瘤细胞融合,获得了分泌抗弓形虫McAb杂交瘤细胞株(2A_(11),3C_2)。其细胞分泌抗体效价为1:64(IHA),诱生腹水效价为1:1024和1:16384,经3个月连续培养和2次液氮冻存复苏培养,细胞生长良好,持续稳定分泌抗体效价不变,用诱生腹水经(NH_4)_2SO_4盐析、DEAE-Sephadex-A50层析和PEG浓缩,所得McAb致敏5％鞣酸化绵羊红细胞,与弓形虫可溶性抗原显示良好凝集效果,证明McAb与弓形虫可溶性抗原反应特异、敏感,并在血凝诊断试剂上具有应用价值。     

抗鱼类致病性嗜麦芽寡养单胞菌单克隆抗体的制备及其生物学特性鉴定

以福尔马林灭活的嗜麦芽寡养单胞菌免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术制备针对鱼类致病性嗜麦芽寡养单胞菌的单克隆抗体(McAb),用软琼脂法进行克隆化培养,通过间接ELISA法对所得的杂交瘤细胞株进行特异性筛选,并鉴定其Ig亚类,测定腹水效价,进行了相对亲和力和抗原位点等生物学特性分析。结果显示,获得了8株可分泌特异性McAb的杂交瘤细胞,分别命名为1C3、1C6、4H8、3D9、2B11、3G3、2H11、1B8。经过鉴定,这8株McAb能够特异性地针对嗜麦芽寡养单胞菌,与其他测试菌之间无交叉反应;其抗体主要分为4个亚类,分别为IgG2a型、IgG2b型、IgG3型和IgM型;腹水效价均在10-6以上;相对亲和力较高;2B11针对的嗜麦芽寡养单胞菌脂多糖表位,而其余7株McAb针对的非脂多糖抗原位点。试验结果证实成功制备了能稳定分泌抗嗜麦芽寡养单胞菌McAb的细胞株,为水产养殖中该菌的快速检测和免疫学研究奠定了基础。     

口蹄疫病毒受体猪源整联蛋白β6亚基配体结合域单克隆抗体的制备

以纯化的口蹄疫病毒受体猪源整联蛋白β6亚基配体结合域重组蛋白为抗原,免疫雌性BALB/c小鼠,经3次免疫后取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,制备口蹄疫病毒受体猪源整联蛋白β6亚基配体结合域单克隆抗体(McAb);采用有限稀释法和间接ELISA克隆和筛选阳性杂交瘤细胞株,并用SDS-PAGE、间接ELISA以及间接免疫荧光法对制备的McAb的特异性进行鉴定。结果显示,成功获得5株能稳定传代并分泌抗β6亚基配体结合域的杂交瘤细胞株,分别命名为C4C7、E7C7、B8C9、C2D8和B7B6,其分泌的McAb为IgG2b(C2D8)和IgG2a(C4C7、E7C7、B8C9、B7B6)亚类。制备的口蹄疫病毒受体猪源整联蛋白β6亚基配体结合域McAb可为深入研究整联蛋白αvβ6在口蹄疫病毒感染过程中的作用奠定基础。     

抗禽脑脊髓炎病毒单克隆抗体的制备及鉴定

利用提纯的禽脑脊髓炎病毒(AEV)VR株CEF适应毒制备抗原,免疫BALB/c小鼠,应用杂交瘤技术以间接ELISA筛选获得1株分泌抗AEV(VR)单克隆抗体的杂交瘤细胞.对制备的细胞上清及腹水进行单克隆抗体特性鉴定,经染色体计数、免疫球蛋白类及亚类测定、特异性试验、稳定性试验、SDS-PAGE电泳,表明该杂交瘤细胞染色体数目介于90-110条,该单克隆抗体亚类为IgG2a,分子质量为142 ku,ELISA测定细胞上清效价为11×104,腹水效价为11×106,与其它病原无交叉反应,抗体分泌稳定.     

Bac-to-Bac系统双表达蛋白IBDV VP2-IL-18免疫原性的研究

把用Bac-to-Bac系统单表达或双表达的蛋白IL-18、传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2和IBDV VP2-IL-18与IBD疫苗同时腿部肌肉多点注射免疫14日龄SPF鸡,14d后加强免疫1次;免疫前、后均采血检测外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞数量和ELISA抗体效价。二免后第21天用vvIBDV-GX8/99毒株进行攻毒。结果显示,VP2-IL-18、VP2+IL-18、IL-18+IBD疫苗、VP2分别免疫雏鸡后均能促进CD4+、CD8+T淋巴细胞的增殖和抗体水平的增加,能明显增强攻毒保护率,但VP2-IL-18免疫组要优于VP2+IL-18混合免疫组及其他免疫组和对照组,差异显著(P0.05)。上述结果表明,双表达蛋白VP2-IL-18不仅能够诱导机体产生细胞免疫和体液免疫,而且还可以产生较高保护率,为新型IBD疫苗的研制奠定了基础。     

克伦特罗单克隆抗体的制备与鉴定

将克伦特罗(Clenbuterol)重氮化后与牛血清白蛋白偶联,免疫BALB/c小鼠,用杂交瘤技术获得1株稳定分泌抗克伦特罗单克隆抗体的杂交瘤细胞株.该单克隆抗体为IgG1亚类,用间接ELISA测定细胞上清液抗体效价为11.6×106,腹水抗体效价为13.2×108.抗体与沙丁胺醇无交叉反应.该细胞株体外传代培养和冻存复苏后仍能稳定分泌抗体.     

用重组腺病毒免疫方法制备伪狂犬病病毒gC蛋白单克隆抗体

将表达伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)gC基因的重组腺病毒经肌肉免疫BALB/c小鼠,测试了重组腺病毒免疫小鼠制备抗目的蛋白单克隆抗体的效果。ELISA分析表明,BALB/c小鼠接种重组腺病毒后能产生针对gC蛋白的特异性抗体。给BALB/c小鼠用大肠杆菌表达的gC融合蛋白MBP-gC-NC加强免疫后第3 d,取小鼠脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞在PEG4000作用下进行杂交融合,经筛选、克隆,获得了3株稳定分泌抗PRV gC蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1B4、1H4和2C8。单抗特性分析结果表明,1B4、2C8属IgG2a亚类,1H4属IgG1亚类;腹水抗体的ELISA效价为1∶2×105~1∶2×106;3株单抗都具有间接免疫荧光试验(IFA)和免疫印迹试验(Western-blotting)反应特性,能够特异地识别PRV gC蛋白。证实重组腺病毒免疫可用于制备目的蛋白单克隆抗体,为制备单抗提供了一种新的方法。     

沙丁胺醇单克隆抗体的制备及其鉴定

将沙丁胺醇 (salbutamol)琥珀酰化后 ,应用混合酸酐法与牛血清白蛋白偶联 ,免疫BALB/c小鼠 ,采用杂交瘤技术获得了 1株能稳定分泌抗沙丁胺醇单克隆抗体的杂交瘤细胞株。该单抗为IgG1亚类。经间接ELISA方法测定 ,其细胞上清抗体效价为 1∶3 .2× 10 6,腹水抗体效价为 1∶6.4× 10 8。该抗体与克仑特罗交叉反应率为 5 0 .0 0 % ,与莱克多巴胺交叉反应率为 0 .3 0 %。体外传代培养和冻存复苏后抗体分泌稳定。     

抗O型口蹄疫病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

以高浓缩的O型口蹄疫病毒(FMDV)灭活疫苗为抗原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,以重组表达的O型重组VP1蛋白(O-r VP1)为筛选抗原,利用杂交瘤技术获得1株可稳定分泌抗O型FMDV VP1蛋白抗体的杂交瘤细胞株1C7,染色体数高于任一亲本细胞的染色体数目;腹水的抗体效价为1︰105,质量浓度为4.7 mg/m L。1C7单克隆抗体为IgG2b亚型,相对亲和力常数为1.5 mol/L,能够与O型FMDV特异性地结合,且仅与结构蛋白VP1反应。稳定性鉴定结果表明1C7株能稳定分泌抗体。阻断ELISA试验表明1C7单克隆抗体能够被O型FMDV免疫阳性血清特异性地阻断。本研究为进一步建立O型FMDV抗体的阻断ELISA及胶体金免疫层析快速检测方法奠定了基础。     

鹌鹑减蛋综合征病毒单克隆抗体的制备及生物学特性

以鹌鹑减蛋综合征QAV C94病毒为抗原免疫BALB/c小鼠 ,制备单克隆抗体并对其生物学特性进行鉴定。获得 5株分泌单克隆抗体的细胞株 (命名为H1、H3、H4、H6和H8)。这 5株杂交瘤细胞可长期稳定地分泌单克隆抗体 ,分泌的单克隆抗体为IgG2a亚类 ,具有高度的特异性 ,只特异地作用于鹌鹑减蛋综合征病毒 ;微量血凝抑制试验显示H4有血凝抑制活性 ,腹水效价为 1∶2 6 ;这 5株单克隆抗体都没有沉淀活性 ,也不与CELO抗原发生沉淀反应 ;它们的亲和力以H4最大 ,相对亲和力依次为H4 >H6 >H1 >H8>H3。     

分泌抗鸭瘟病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

通过二次感染鸭瘟病毒的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞系SP_2/0融合试验和多次筛选及克隆化,建立了二株分泌抗鸭瘟病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株,用间接血凝和ELISA等方法证实二株细胞分泌的单克隆抗体对鸭瘟病毒具有良好的专一性,与同属病毒马立克氏病毒以及不同属的鸭肝炎病毒、鸡新城疫病毒无交叉反应,免疫球蛋白亚类鉴定,表示二株均为IgG_1。腹水效价,间接血凝达1280,ELISA达20000。这二株细胞已在体外培养下稳定地分泌特异性抗体达8个月之久。