H5亚型禽流感病毒HA蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为制备Clade 2.3.2分支H5亚型禽流感病毒HA蛋白的单克隆抗体,以灭活的超速离心浓缩纯化的H5N1亚型禽流感病毒A/duck/Guangdong/S1322/2010(DK/GD/S1322/2010)免疫6~8周龄的雌性BALB/c小鼠。取免疫后小鼠脾细胞,使其与骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,通过血凝抑制(HI)和ELISA方法筛选,共获得2株能够稳定分泌HA蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株A4和D11。2株单克隆抗体的重链均为IgG1,轻链均为κ链。经HI检测,A4和D11的细胞培养上清和腹水的抗体效价分别为23、22和211、211。HI和中和试验结果显示,这2株单克隆抗体与Clade 2.3.2.B分支和Clade 2.3.2.C分支的病毒反应性良好,而与Clade 2.3.4和Clade 7分支的病毒均不反应。间接免疫荧光试验结果表明,这2株单克隆抗体能够识别MDCK细胞内感染的H5亚型禽流感病毒DK/GD/S1322/2010。结果表明,本研究制备的2株单克隆抗体为H5亚型禽流感病毒的检测和诊断奠定了物质基础。     

抗牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体的制备及其特性研究

利用牛病毒性腹泻病毒(BVDV)基因疫苗和重组E2蛋白分别免疫BALB/c小鼠,制备了5株单克隆抗体(4G3、3B2、3F8、2H6、3A11),并对这些单克隆抗体的亚类、免疫原性及其与瘟病毒的反应性进行了检测.结果显示,4G3、382、3F8、2H6为IgM类抗体,3A11为IgG类抗体;纯化后的单克隆抗体与纯化前比较,与抗原的反应性略有提高;5株单克隆抗体与BVDV和猪瘟病毒(CSFV)均有交叉反应性.表明,制备的5株单克隆抗体所针对的是BVDV和CSFV共有的抗原表位.     

减蛋综合征病毒WPDV205株的多肽图谱分析

减蛋综合征病毒ＷＰＤＶ２０５株的多肽图谱分析孔德迎，辛朝安，杨克军（华南农业大学广州５１０６４２）减蛋综合征（ＥＤＳ－７６）自１９７６年报道以来，已成为世界范围内引起产蛋损失的主要疫病。该病的病原为减蛋综合征病毒，属于禽腺病毒，具有血凝活性，一般认为...     

抗水貂肠炎病毒单克隆抗体的制备及其生物学特性鉴定

将水貂肠炎病毒SMPV-11株纯化后免疫4～6周龄雌性BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经亚克隆和间接ELISA筛选,获得了8株稳定分泌抗水貂肠炎病毒SMPV-11株单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为D3、H5、F5、F4、A9、B7、H11和H8.经过鉴定:其腹水ELISA效价分别在1:6.4×103和1:2.56×104之间;且与犬瘟热病毒、阿留申病病毒、犬腺病毒不发生交叉反应;而与水貂肠炎病毒、犬细小病毒和猫泛白细胞减少症病毒呈特异性反应;这8株单克隆抗体均为IgG类型.     

抗山羊IgMμ链单克隆抗体的制备及鉴定

将构建的山羊IgMμ链的原核表达重组质粒pET30a-IgMμ转化至大肠杆菌BL21中,诱导表达获得重组蛋白His-IgMμ;以Ni-NTA亲和层析法纯化His-IgMμ重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,经细胞融合、抗体筛选和细胞克隆等杂交瘤细胞技术,筛选能稳定分泌抗山羊IgMμ链单克隆抗体的杂交瘤细胞株;采用小鼠腹腔诱生腹水的方法制备出抗IgMμ链单抗,并鉴定单抗的生物学特性。结果,成功构建了重组表达载体pET30a-IgMμ,诱导表达、纯化得到了目的蛋白;获得了4株能稳定分泌抗山羊IgMμ链单克隆抗体的杂交瘤细胞株,4株单抗腹水的效价均达到了1×10~(-4)以上,其中1D8、5D1和6G10株单抗亚型为IgG1,9H8株的亚型为IgG 2a,轻链均为κ;1D8、5D1、6G10和9H8的亲和力平衡解离常数KD分别为1.87×10~(-11)、8.46×10~(-7)、4.26×10~(-9)和4.07×10~(-10);经Western-blot鉴定,单克隆抗体6G10能特异性识别原核表达的HisIgMμ蛋白。上述研究结果表明,本研究获得了4株高亲和力和效价的抗山羊IgMμ链特异性单克隆抗体,这为山羊感染性疾病的早期诊断、预报预警和防控提供了基础条件。     

犬瘟热病毒H蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为制备犬瘟热病毒(CDV)H蛋白单克隆抗体,采用蔗糖密度梯度离心法提纯CDV-Ondetstepoort株,利用RT-PCR方法扩增其H基因截短片段(H1、H2、H3),克隆至pET-28a (+)载体并转化至大肠杆菌Rosetta感受态细胞中进行原核表达,用Ni-NTA亲和层析柱纯化3种截短H蛋白;以纯化病毒为抗原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,采用间接ELISA、间接免疫荧光法(IFA)和病毒中和试验分析杂交瘤细胞的生物学特性。结果表明,纯化的截短H蛋白表达正确,以此筛选到7株能稳定分泌犬瘟热病毒和重组H2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株(3B1、3B5、3C5、3D5、5A6、4G12和7B2),抗体亚类鉴定均为Ig G1κ;IFA检测均为阳性,表明7种单克隆抗体特异性好;病毒中和试验测定其培养上清的抗体中和效价为24～28,诱生BALB/c小鼠腹水的抗体中和效价为1×102～1×106;间接ELISA叠加试验显示,3B5、4G12、5A6、7B2之间的叠加系数均在50%以上,表明这4种单克隆抗体识别不同抗原表位;另外,3B5、4G12、5A6、7B2还能中和当前流行的Asia 1型CDV毒株,具有较好的广谱中和活性。本研究为后续CDV感染的免疫治疗和CDV检测方法的建立提供了材料基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为了鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白抗原表位,本研究将PRRSV N蛋白进行了原核表达和纯化,并用纯化后的N蛋白免疫BALB/c小鼠。利用淋巴瘤细胞融合技术和间接ELISA抗体筛选方法,制备获得4株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株3D10、3G12、6E2和6F4,Western-blot和IFA鉴定其均能与PRRSV特异性反应。4株单抗均属于Ig G1亚类,轻链均为κ链。ELISA结果显示,3D10、3G12、6E2和6F4之间的叠加系数均在50%以上。选择N蛋白3个主要抗原表位合成肽进行ELISA检测,证明4株单抗识别的抗原表位均为30～52 aa,提示4株单克隆抗体亲和力可能存在一定差异,为该病毒研究提供了重要材料。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体的研究

采用差速离心和蔗糖不连续密度梯度离心法提纯猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)北京地区分离株BJ-4病毒抗原,免疫BALB/c小鼠,按常规杂交瘤技术制备杂交瘤细胞株,经间接ELISA筛选和克隆化,获得1株能稳定分泌PRRSV抗体的单克隆杂交瘤细胞株,命名为GE3.经过鉴定,GE3株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体亚类为IgG1;分子质量为161.64 ku;腹水效价为18×104;不与猪瘟病毒(HCV)和伪狂犬病病毒(PRV)发生交叉反应;蛋白质印迹(Westren-blotting)试验结果表明,该株单克隆抗体为针对核衣壳蛋白(NP)的单克隆抗体;腹水与欧洲株(Lv)、美洲株(VR-2332)和北京分离株BJ-1、BJ-2、BJ-5、BJ-6均能发生反应,说明其所针对的位点为NP上的保守位点.     

马立克氏病病毒gE蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为了获得分泌抗鸡马立克氏病病毒(MDV)gE囊膜糖蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,将pGEX-6P-1表达的重组蛋白gE作为抗原,免疫BALB/c小鼠,通过淋巴细胞杂交瘤技术,共筛选获得4株能够稳定分泌抗MDV gE蛋白抗体的杂交瘤细胞株。抗体亚型鉴定结果表明,4株均为IgG1型,轻链为κ链。间接免疫荧光结果显示,4株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体均能特异性识别MDV,并具有一定的中和活性。本研究对MDV诊断、抗原表位分析及鉴定等具有重要的应用价值。     

A型流感病毒NS1蛋白单克隆抗体的制备及其亚细胞定位分析

以A型流感病毒A/Swine/Guangdong/(H3N2,H3病毒)株的基因组作为模板,扩增NS1基因并构建原核表达载体p ET-28a(+)-NS1。以大肠杆菌表达的NS1蛋白为抗原免疫小鼠,制备单克隆抗体,获得了2株分泌单克隆抗体细胞株2H9和3A4。IFA和Western-blot检测显示,抗NS1单克隆抗体与H3病毒感染的细胞有良好的反应性和特异性。亚细胞定位分析显示,H3N2病毒的NS1聚集于核仁处,H1N1病毒NS1聚集于核内周边,PR8毒株的NS1少部分在核内聚集、多数胞质呈颗粒状分布。流感病毒NS1单克隆抗体的制备为流感病毒流行病学监测、鉴别诊断及对其蛋白功能研究提供了工具。     

H5N1和H9N2亚型禽流感病毒型特异性抗原捕捉ELISA检测方法的建立

采用禽流感病毒多克隆抗体及型特异性单克隆抗体,研究建立了型特异性抗原捕捉ELISA检测方法,用于检测H5N1和H9N2亚型禽流感病毒。优化了反应条件,确定了包被抗体、检测抗体及酶结合物的最佳工作浓度,对该方法的敏感性、特异性、重复性及稳定性进行了分析,并与病毒分离鉴定的结果进行了比较。结果表明,该方法敏感、特异,具有良好的重复性和稳定性,可用于临床样品及鸡胚、细胞培养物中禽流感病毒的检测。     

H5亚型禽流感病毒反应原性差异及ELISA检测方法的研究

在获得禽流感病毒多克隆抗体及H5亚型特异性单克隆抗体的基础上,建立了H5亚型特异性抗原捕捉ELISA检测方法。通过分析不同单克隆抗体与不同禽流感毒株的反应性差异,筛选高特异性和高敏感性的H5亚型单克隆抗体。优化反应条件,确定包被抗体、检测抗体及酶标抗体的最佳工作浓度,进行敏感性、特异性、重复性及稳定性分析,并与斑点ELISA、H5N1多重RT-PCR或病毒分离鉴定的结果相比较,同时使用该方法对野外样品进行了检测。结果表明,该方法敏感、特异,具有良好的重复性和稳定性,可用于检测临床样品、鸡胚培养物及细胞培养物中的H5亚型禽流感病毒。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3A单克隆抗体的制备和鉴定

以原核表达并纯化的口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白3A免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,用间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞,有限稀释法进行亚克隆,获得3株能稳定分泌抗3A蛋白单抗的杂交瘤细胞,分别命名为3H2、4B1、7F5,并对这3株单抗进行了生物学鉴定。结果显示,单抗3H2和4B1为IgG2a亚型,7F5为IgG2b亚型。单抗7F5针对的表位与3H2和4B1两株单抗的表位不一致;这3株单抗均能够与FMDV特异性结合,且单抗4B1与所有3A相关蛋白均反应。稳定性鉴定结果表明,获得的3株杂交瘤细胞均能稳定分泌单克隆抗体。研究结果为进一步探索3A蛋白的结构和功能以及建立诊断方法奠定了基础。     

弓形虫代谢分泌抗原对猪T细胞亚群的影响

为了研究弓形虫代谢分泌抗原对仔猪T细胞亚群及抗体的影响,将仔猪随机分为6组,每组5只,分别为E/SA组、E/SA+CPG(未乳化)组、E/SA+CPG组、E/SA+IL-2组、E/SA+IL-2+CPG组及对照组.分别于免疫前、免疫后第2周、免疫后第4周、感染后第1周及感染后第2周采集仔猪外周血,用流式细胞仪对各试验组外周血中CD4+及CD8+T淋巴细胞亚群的动态变化规律进行检测,用IHA对抗弓形虫抗体水平做检测.结果显示,弓形虫代谢分泌抗原免疫仔猪后第4周,免疫组外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞水平和特异性抗体效价与对照组相比均有大幅度升高;感染后第1周,免疫组CD4+T细胞水平及CD4+/CD8+比值较感染前有不同程度降低,感染后第2周,免疫组CD4+T细胞水平及CD4+/CD8+比值上升至免疫后水平,CD8+水平下降,感染后特异性抗体效价进一步升高.表明,弓形虫代谢分泌抗原能够提高仔猪外周血CD4+及CD8+T淋巴细胞水平和特异性抗体水平.     

牛型布氏杆菌苹果酸脱氢酶单克隆抗体的制备及鉴定

为制备牛型布氏杆菌(Brucella abortus)苹果酸脱氢酶(MDH)单克隆抗体,将牛型布氏杆菌A19菌株的MDH基因进行克隆和表达,表达产物被纯化后作为免疫原,按常规方法免疫BALB/c小鼠。取免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经亚克隆和间接ELISA筛选,最终获得3株分泌牛型布氏杆菌MDH蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别被命名为C2、D5和F4。ELISA检测结果表明,3株杂交瘤细胞培养上清的抗体效价为1∶1 600～1∶3 200,小鼠腹水效价为1∶12 800～1∶25 600;Western-blot检测结果表明,3株单克隆抗体均能与牛型布氏杆菌MDH重组蛋白发生特异性反应。结果表明,本研究成功制备了牛型布氏杆菌MDH蛋白单克隆抗体,为基于MDH的布氏杆菌检测方法的建立奠定了基础。     

单克隆抗体鉴定的鸡T细胞体内功能特性试验

对鸡Ｔ细胞特异性单克隆抗体１Ｂ６鉴定的Ｔ细胞亚群进行了体内功能试验，表明１Ｂ６＋Ｔ细胞缺陷鸡接种新城疫ＬａＳｏｔａ疫苗后，抗体效价明显降低，证明１Ｂ６＋Ｔ细胞具有辅助Ｂ细胞产生抗体的重要功能。     

抗O型口蹄疫病毒单克隆抗体的制备及其生物学特性分析

用灭活O型口蹄疫病毒为抗原免疫BALB/c小鼠4次后,取致敏的脾B淋巴细胞和SP2/0小鼠骨髓瘤细胞进行融合,在HAT选择培养基中培养2周,经间接ELISA法筛选,最终获得了3株抗O型FMDV的阳性杂交瘤细胞株,命名为2F1、2G7和6H4。血清学试验证明该McAbs能与FMDV抗原结合,具有高度特异性。     

口蹄疫病毒VP1基因的原核表达及免疫原性检测

将口蹄疫病毒VP1基因克隆至原核表达载体 pBAD/TOPO中 ,经鉴定后得到了重组质粒 pBAD VP1。将此重组质粒转化到受体菌TOP10中 ,分别以不同浓度的诱导剂L 阿拉伯醛糖进行诱导 ,并在不同诱导时间进行采样 ,经处理后做SDS PAGE和蛋白质印迹分析。结果 ,以终浓度为 0 .0 2 g/L的L 阿拉伯醛糖进行诱导 ,4h后表达可达到高峰 ,表达产物大小约为 4 0ku。软件扫描结果显示 ,VP1融合蛋白的表达量占细菌总蛋白的 2 6 .3% ,能与抗FMDV抗体发生特异性反应 ,融合蛋白以包涵体和可溶形式存在。抽提融合蛋白的包涵体 ,经过洗涤后制成油乳剂疫苗 ,经皮下注射免疫豚鼠 ,用乳鼠中和试验测定豚鼠血清中和指数 ,并用口蹄疫病毒对豚鼠进行攻毒。结果表明 ,用此融合蛋白的包涵体免疫豚鼠能诱导产生中和抗体 ,并对病毒的攻击提供免疫保护。     

禽脑脊髓炎病毒单克隆抗体的制备与初步应用

利用提纯的禽脑脊髓炎病毒(AEV)Van Roekel株作为免疫原,免疫6周龄BALB/c小鼠,采取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,用间接ELISA法筛选,间接免疫荧光法(IFA)和免疫组织化学法鉴定,经3次亚克隆得到了稳定分泌抗AEV单克隆抗体的杂交瘤细胞株F11和G2,制备了腹水,并利用该单克隆抗体初步建立了Dot-ELISA、间接ELISA和IFA等特异性检测AEV抗原的方法。     

猪瘟病毒石门株E2蛋白的单抗制备及抗原表位鉴定

用猪瘟病毒石门株E2(SM-E2)的BC区原核表达蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,应用杂交瘤技术制备单抗,测定其效价并鉴定抗原表位。结果表明,制备了1株持续、稳定分泌抗SM-E2的单克隆抗体2B10,效价在1∶600～1∶1 000之间。单抗2B10能与常规SDS-PAGE转膜的SM-E2蛋白发生反应,表明其识别的是线性表位,并且该单抗只能识别石门毒株,而不能与C株疫苗及2型流行毒株发生反应。点突变E2蛋白ELISA分析结果表明,该单抗不与707、709、711、713和714位突变蛋白发生反应,表明单抗2B10识别的线性表位为707I-X-P-X-G-X-G-G714。该单抗对猪瘟病毒抗原多样性分析和致病机制研究有一定的应用价值。