牦牛PGF基因特征的分析及其在不同来源囊胚中表达情况的检测

为了探讨牦牛(Bos grunniens)胎盘生长因子(PGF)的特征及其在不同来源囊胚中的表达差异,依据黄牛(Bos taurus)PGF基因序列5′端和3′端的保守序列设计特异性引物,RT-PCR克隆得到牦牛PGF基因,利用生物信息学软件对牦牛PGF基因进行特征进行预测分析,同时采取实时荧光定量(RT-qPCR)检测PGF基因在牦牛体外受精囊胚和体内来源囊胚中表达的差异性。结果,本研究成功克隆得到牦牛PGF基因序列(GeneBank登录号:KU902418),在组成蛋白质的149个氨基酸中,含量最高的是半胱氨酸Cys(27.9%),最低的是丙氨酸Ala(21.4%),PGF基因编码的蛋白为亲水性蛋白。同源性分析和系统进化树分析结果表明,牦牛PGF基因与黄牛PGF基因具有高度同源性,为99.3%,表明PGF基因在进化过程中有高度的保守性。实时荧光定量结果显示,体内来源囊胚的PGF基因表达水平显著高于体外囊胚(P0.05),约为体外囊胚的6.3倍。结果表明,PGF基因体外囊胚低水平表达在一定程度上影响囊胚附植。上述研究结果为哺乳动物囊胚附植机制研究提供了一定的理论基础。     

鸡IL-2受体α亚基成熟蛋白基因的克隆及其胞外段的原核表达

以鸡脾淋巴细胞总RNA为模板,采用RT-PCR方法克隆了鸡白细胞介素-2受体α亚基(ChIL-2Rα)编码区基因。将ChIL-2Rα胞外段基因克隆到pET-32a(+)中,获得重组质粒pET32a-exChIL-2Rα,转化宿主菌E.coli RossetaTM(DE3)后,经IPTG诱导表达的融合蛋白大小约为34 ku。序列分析发现,鸡IL-2Rα编码区基因与GenBank上已登录序列的核苷酸同源性为99.2%,氨基酸同源性为99.5%。ChIL-2Rα与其他哺乳动物IL-2Rα在核苷酸和氨基酸水平上的同源性分别为29.6%~54.5%和18.8%~28.0%。表明,禽类IL-2Rα与哺乳类的差异较大。     

新兴猪IFN-α成熟蛋白基因的克隆与序列分析

根据NCBI GenBank上登录的猪IFN-α基因序列设计了 1 对引物,应用 PCR技术直接从3周龄新兴猪肝细胞中扩增出了约 500 bp 的基因片段;将该片段克隆到 pMD 18-T 载体,经PCR、酶切及序列测定,该克隆片段由501个核苷酸组成,共编码 166 个氨基酸,与 NCBI GenBank上登录的 2 个猪 IFN-α基因序列(登录号为 M28623 和 X57191)比较,核苷酸的同源性分别为99.4%和99.2%。     

猪伪狂犬病病毒SL株gK基因的生物信息学分析

对猪伪狂犬病病毒(PRV)四川分离株(SL株)gK基因进行分子克隆,并利用生物信息学软件对gK基因进行了同源性、遗传进化树、密码子偏向性、蛋白质二级结构预测及抗原表位分析。结果显示,成功克隆了PRVSL株gK全基因,其编码区长939bp,编码313个氨基酸残基,与其他PRV分离株核苷酸序列同源性为97.6%～99.9%,与国外分离株的同源性略高于国内分离株。gK基因存在4个跨膜区及1个明显的CpG岛。表明成功克隆了PRVSL株gK基因,该基因具有潜在的抗原性。     

不同生理状态乳牛卵巢卵母细胞基因的差异表达

为了研究不同生理状态下的卵巢卵母细胞基因的表达情况,采集乳牛的卵巢,分离了卵母细胞,以单个卵母细胞的mRNA作为模板,用设计的随机引物和锚定引物,采用一步法RT-PCR扩增了卵母细胞基因.经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,发现有功能黄体和无黄体卵巢卵母细胞基因的电泳条带之间无明显差异,对一条明显差异条带进行回收、纯化,将纯化的PCR产物连接到T栽体,阳性克隆经鉴定后,进行测序和同源性比较.结果显示,与体外培养的牛早期胚胎的一条序列具有很高的同源性.     

牦牛hepcidin基因编码区的克隆和原核表达

采用RT-PCR从牦牛肝中扩增到了hepcidin基因,将其克隆至pGEM-T载体,转化DH5α感受态细胞,获得了阳性重组质粒,牦牛hepcidin基因编码区长289 bp,编码82个氨基酸(GenBank:EU863791);与黄牛相比,牦牛hepcidin基因编码区序列存在1个碱基的变异,但未引起氨基酸的改变;将牦牛hepcidin基因编码区连接至pGEX-4T-1表达载体,成功构建了原核表达栽体pGEX-4T-hepcidin;IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳显示,35 ku处有特异性蛋白条带,表明牦牛hepcidin抗菌肽基因成功实现了原核表达.     

牛IgG2 Fc受体在COS-7细胞表面的稳定表达

将牛IgG2 Fc受体(boFcγ2R)编码区cDNA亚克隆到真核表达载体pcDNA3的巨细胞病毒启动子下游,构建了重组表达质粒pc3bo2R;以重组质粒转染COS-7细胞,用玫瑰花环试验检测boFcγ2R在转染细胞表面的表达,通过G418抗性筛选和连续克隆化,在转染细胞表面稳定表达了boFcγ2R受体分子,转染细胞的玫瑰花环形成率达90%。最后获得稳定表达boFcγ2R受体分子的COS-7转染细胞系,为受体的功能研究提供了良好的技术平台。     

大通牦牛LF基因的克隆与分子特征

通过RT-PCR克隆了牦牛包含LF基因编码区的cDNA序列(GenBank登录号为EU547251);将克隆获得的LF基因的cDNA与乳牛相应序列进行了比对;对牦牛LF蛋白的氨基酸序列(GenBank登录号为ACB29794)与其他物种的相应序列进行了比较,应用在线生物软件对牦牛LF蛋白的特性和结构进行了预测.结果表明,克隆获得的牦牛LF基因cDNA片段长度为2 344 bp,其中LF基因编码区全长2 124bp,编码708个氨基酸;克隆获得的牦牛cDNA序列与乳牛该序列存在15个碱基的变异;各物种LF蛋白具有较高的同源性,LF蛋白进化树符合物种进化规律;牦牛LF蛋白含有α-螺旋36.0%、β-折叠22.4%、β-转角31.1%、无规卷曲12.9%;同源建模预测的LF 3D模型显示,LF为多肽链在二级结构基础上折叠形成的2个极相似的、对称的球状叶,即N叶和C叶,中间由一段对蛋白酶敏感的α-螺旋连接,呈"二枚银杏叶型"结构.     

三种哺乳动物朊蛋白基因的克隆与分析

以外周血液的总DNA为模板,运用PCR方法克隆了汉族人、秦川黄牛和甘肃土种绵羊的Prnp基因,运用分子生物学软件对这些序列进行了分析比较。结果表明,获得的3种哺乳动物的Prnp基因均位于1个单一的外显子内,与GenBank中登录的相应序列具有高度同源性,达99.0%。牛与绵羊Prnp基因同源性为97.3%,推导氨基酸序列同源性为96.5%。人Prnp基因与黄牛和绵羊Prnp基因的同源性分别为86.7%和87.1%,其氨基酸序列的同源性均为90.0%。3种Prnp基因均有富含G-C的重复区,编码的PrP蛋白均由氨基端的信号肽、中间的成熟蛋白和羧基端的GPⅠ锚结合位点组成。基因型分析表明,秦川黄牛和甘肃土种绵羊可能存在感染海绵状脑病的风险。     

天府肉鹅IFN-α基因的克隆及生物信息学分析

采用RT-PCR方法从天府肉鹅外周血单核细胞中扩增了IFN-α基因;并将上述扩增片段克隆到pMD18-T载体中,构建了重组质粒。用生物信息学软件及在线分析方法对IFN-α基因的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列进行了分析,同时与13个物种的IFN-α基因进行了同源性比较。结果表明,成功地克隆了IFN-α基因,该基因与同类水禽(鸭、鹅)的IFN-α基因有90%以上的同源性,在进化树中位于同一分支,研究结果为开发鹅的干扰素制剂奠定了基础。     

两株不同来源的猪圆环病毒1型ORF2基因的克隆与序列分析

根据GenBank中猪圆环病毒1型(PCV1)ORF2基因序列,设计了1对引物,应用PCR方法从PK-15细胞和疑似患断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的仔猪组织病料中分别扩增出了PCV1 ORF2全基因(702bp)。将此基因片段克隆入pMD 18-T载体,筛选获得了重组质粒pMD-PCV1-ORF2,并对其进行了测序与分析。结果表明:所克隆的PK-15来源和组织病料来源的ORF2基因的同源性为99.4%,二者与GenBank中登录的PCV1 ORF2基因的同源性为97.3%~99.9%,与PCV2 ORF2基因的同源性为67.9%~68.4%,二者编码的蛋白在几个功能区比较保守。抗原表位预测表明,PCV1 ORF2编码的蛋白具有良好的免疫原性。     

发情周期关中奶山羊卵巢中GPR30和NGF的表达

为了研究G蛋白偶联受体30(GPR30)和神经生长因子(NGF)在发情周期山羊卵巢中的表达规律,运用免疫组织化学SP法分别对发情前期、发情期、发情后期和间情期关中奶山羊卵巢中GPR30和NGF的定位和相对表达量进行了研究。结果表明,GPR30和NGF免疫反应阳性产物不同程度地分布于发情周期山羊卵巢各级卵泡的颗粒细胞、膜细胞、卵母细胞以及黄体细胞和间质细胞;两者在各级卵泡中的表达量不同,GPR30在各级卵泡的相对表达量以发情期极显著高于其他3个时期(P<0.01);NGF在原始卵泡中以发情期和发情前期表达量极显著高于其他2个时期(P<0.01),在初级卵泡以间情期极显著低于其他3个时期(P<0.01),在发情周期的次级卵泡和三级卵泡中的表达规律和GPR30相似,间情期NGF在黄体细胞的表达强度极显著高于发情后期(P<0.01)。表明GPR30和NGF不同程度地参与关中奶山羊卵巢卵泡的发育和成熟以及激素分泌的调节。     

鸡抗病毒Mx基因的克隆与序列分析

用干扰素诱导剂poly(I)/(C)诱导鸡胚成纤维细胞,提取细胞总RNA,采用RT-PCR方法扩增了北京白鸡Mx基因全长编码区序列.序列分析表明该基因编码区长2118 bp,编码705个氨基酸残基,其第631位为天冬酰胺,理论上推测具有抗病毒活性.通过与GenBank中已登录的7个品系鸡Mx基因进行核苷酸系统进化树分析,结果显示,北京白鸡Mx基因与WL-N品系鸡Mx基因的亲缘关系最近.北京白鸡Mx基因序列与其他动物Mx基因序列的比较结果显示,核苷酸同源性为49.5%～76.8%,氨基酸同源性为44.1%～61.6%.据此可以推断克隆的Mx基因具有抗病毒活性的分子特征和特征性功能结构,不同种属动物Mx基因的同源性与其亲缘关系呈正相关.     

禽流感病毒A/Turkey/Canada/63毒株HA和NA基因的克隆及序列分析

用SPF鸡胚增殖禽流感病毒(AIV)A/Turkey/Canada/63毒株,提取病毒基因组总RNA,应用RT-PCR技术分别扩增该病毒分离株的HA和NA基因全片段,并克隆到pMD18-T载体上。测序结果表明,该毒株的HA基因全长为1745bp,含有完整的阅读框架,编码566个氨基酸；NA基因全长1467bp,编码469个氨基酸。BLAST序列比较结果显示,该毒株HA基因属于H6亚型,NA基因属于N2亚型。将获得的HA和NA基因与AIV数据库中H6和N2基因进行遗传演化分析,表明该毒株HA基因与其他H6基因核苷酸的同源性为80.5%～87.3%,氨基酸的同源性为88.0%～93.1%；NA基因与其他N2基因核苷酸的同源性为86.0%～93.5%,氨基酸的同源性为90.6%～96.3%。     

猪IgGⅡ类Fc受体基因的真核表达及其在组织中的分布状况

利用已克隆的猪IgGⅡ类Fc受体cDNA(swFcγR Ⅱ)基因序列(DQ026064)设计的引物S29和S2,通过RT-PCR技术从猪外周血白细胞cDNA中扩增了完整的960 bp swFcγR Ⅱ ORF序列.利用基因重组技术将swFcγRⅡORF基因成功亚克隆到真核表达载体pcDNA3中.然后用脂质体法转染COS-7细胞,用玫瑰花环试验鉴定了swFcγRⅡ受体的亲和特性.半定量PCR检测表明,swFcγR ⅡmRNA在外周血白细胞、肝、肺和肠系膜淋巴结有较高表达.     

边缘无浆体MSP5蛋白基因的克隆及原核表达

参照已发表的边缘无浆体主要表面蛋白5(MSP5)基因的核苷酸序列,设计了1对特异性引物,以边缘无浆体基因组DNA为模板,采用PCR技术扩增获得了MSP5蛋白基因。将其克隆到pGEM-T Easy载体,并进行测序分析。结果表明,克隆的MSP5基因与GenBank上登录的Florida株MSP5蛋白基因的序列同源性达98.6%,编码氨基酸的同源性为99.0%,并且该序列包含有完整的开放阅读框,大小为633 bp。将该基因亚克隆入原核表达载体pGEX-4T-1,构建了重组原核表达载体。将其转化到DH5α宿主菌中,用IPTG进行诱导表达,实现了融合表达,表达产物的分子质量为45 ku。Western-blot分析表明,此表达产物能够被抗边缘无浆体阳性血清所识别。     

日本血吸虫丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的克隆和分析

为筛选新的有潜在保护性的抗原分子编码基因 ,采用重复感染兔血清免疫筛选日本血吸虫成虫cDNA文库 ,将阳性克隆的插入序列进行了PCR扩增和序列分析。结果发现 ,所筛选的阳性克隆中有 2个为日本血吸虫丝氨酸蛋白酶抑制剂基因 (SPI)。序列分析表明 ,它可编码分子质量为 4 .6ku ,等电点为 5 .76的蛋白 ,与GenBank中日本血吸虫SPI基因 (大陆株 )、曼氏血吸虫SPI基因和埃及血吸虫SPI基因编码的氨基酸序列的同源性分别为 98%、6 2 %和 6 2 %。TMpred分析表明 ,该蛋白具有 2个明显的跨膜区即 36～ 5 5和 35 6～ 372位氨基酸。     

马动脉炎病毒大囊膜蛋白和膜蛋白基因的克隆与序列分析

参考GenBank收录的马动脉炎病毒(EAV)读码框大囊膜蛋白基因 ORF5、膜蛋白基因ORF6的核苷酸序列,分别设计了2对引物,对EAV的这两种主要结构蛋白基因进行了 RT PCR;将扩增产物克隆于pUC18通用载体,对重组质粒进行限制性内切酶分析和基因测序,证实克隆片段的可靠和准确性。测序结果,ORF5目的片段包含768 bp,编码255个氨基酸组成的多肽;ORF6目的片段包含489 bp,编码162个氨基酸组成的多肽。与EAV NC 002532标准毒株比较,ORF5、ORF6核苷酸的同源性分别为99.1%和99.4%;推导氨基酸的同源性分别为96.9%和98.2%。     

鹅副粘病毒HN基因的克隆与序列分析

以鹅副粘病毒GPVSF0 2毒株的基因组RNA为模板 ,通过RTPCR方法扩增出HN基因片段 ,然后将其克隆至T载体中。经PCR鉴定后 ,对阳性克隆进行测序 ;测序后拼接得出HN基因的全序列。经分析HN基因编码区核苷酸序列 ,所测GPVSF0 2毒株与参考毒株NL 96核苷酸序列的同源性为 86 %。     

猪瘟流行毒株E2基因的克隆及其杆状病毒表达载体的构建

用RT PCR方法扩增了陕西省近期猪瘟流行野毒株E2基因 ,并将其克隆到 pMD 18 T载体 ;经转化、筛选、鉴定后 ,测定了核苷酸序列 ,根据C株、Brescia株和Alfort株确定起始氨基酸三联体的正确位置后进行 gp5 5氨基酸序列推导 ,并进行同源性比较。结果表明 ,该猪瘟流行毒株的E2核苷酸序列与C株、Brescia株和Alfort株的E2核苷酸序列同源性分别为 81.9%、83.4 %和83.5 % ;相应地 ,gp5 5氨基酸同源性分别为 94 .8%、95 .6 %和 95 .3%。将此E2基因亚克隆到杆状病毒转移载体 pFastBacHTb后获得了重组质粒 pFBHT E2 ,进而转化入含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中 ,发生转座作用 ;经抗性及蓝白斑筛选得到了含E2基因的重组DNA ,将其命名为rBacmid E2。此研究为进一步在昆虫细胞中表达E2基因、开发研制猪瘟基因工程疫苗奠定了基础。