屎肠球菌对鲤鱼非特异性免疫酶活性和抗病力的影响

为探讨饲料中添加屎肠球菌对鲤鱼的非特异性免疫酶活性和抗病力的影响,饲喂期间选取初始体质量为(28±0.3)g的健康鲤鱼,饲喂添加3种不同浓度(1×107、1×108、1×109CFU/g)屎肠球菌的颗粒饵作为试验饲料。结果显示,与对照组相比,各组血清中超氧化物歧化酶(SOD)活力随时间增加持续上升,溶菌酶(LZM)、碱性磷酸酶(AKP)、过氧化物酶(POD)的活力和Ig M质量浓度呈上升趋势,但无显著差异(P0.05);在首次免疫后第28天时添加量为1×108CFU/g组的AKP和POD活力最高,在第35天时添加量为1×108CFU/g的SOD和LZM活力最高,1×107CFU/g、1×109CFU/g相比1×108CFU/g活力有所降低,但均高于对照组。Ig M质量浓度显著高于PBS组(P0.05),第14天血清中Ig M水平达到最高。首次免疫后第42天以维氏气单胞菌TH0426攻毒,攻毒14 d后各组的累积死亡率差异显著(P0.05),与对照组相比,添加1×108CFU/g屎肠球菌的鲤鱼存活率最高为58%,添加1×107和1×109CFU/g的存活率分别为42%和38%。综上所述,饲料中添加屎肠球菌可有效增强鱼体非特异性免疫力,且具有较高的免疫保护效果,其中1×108CFU/g和1×109CFU/g效果较好。     

鸡β防御素2在毕赤酵母中的组成型表达及其发酵条件的优化

合成鸡β防御素2(AvBD2)成熟肽基因,构建重组质粒pGHK-AvBD2;将其电转化至毕赤酵母GS115;Tricine-SDS-PAGE和Western-blot检测表达产物,琼脂扩散法测定产物的抑菌活性,并测定产物的溶血活性;响应面法优化接种量、装液量和发酵温度。Tricine-SDS-PAGE和Western blot检测结果显示,在5.8ku位置出现目的蛋白质条带;抑菌活性检测表明,表达产物对粪肠球菌(ATCC29212)、大肠杆菌(CMCC44102)、金黄色葡萄球菌(ATCC25923)和巴氏杆菌具有明显的抑菌活性;发酵产物在500mg/L时的溶血活性仅2.17%。由建立的响应面模型得到重组酵母最佳发酵条件为:接种量528mg/100mL、装液量8.43%、发酵温度27.8℃,产物蛋白浓度较优化前提高20%。本研究实现了AvBD2在毕赤酵母中的组成型表达,表达产物有较好的抗菌活性,为AvBD2作为新型饲料添加剂的应用奠定了基础。     

用响应面法优化四黄止痢复方中药提取工艺

为制备四黄止痢复方中药并建立其高效液相色谱(HPLC)检测方法,在单因素试验的基础上,以浸渍时间、料液比[质量(g)体积(mL)比]、甲醇体积分数为自变量,黄芩苷、盐酸小檗碱质量浓度及干膏率综合评分为因变量,采用HPLC法测定其质量浓度,响应面法进行试验设计、建立数学模型,并进行预测分析。结果显示,四黄止痢复方中药的最佳提取工艺为浸渍时间146 min、料液比1︰333、甲醇体积分数80%。建立的HPLC色谱条件为色谱柱Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm,5 m),流动相甲醇(A)-0.1%磷酸水(B)梯度洗脱,检测波长278 nm,流速1.0 mL/min,进样体积10 L,柱温25℃。结果表明,用响应面法优化的四黄止痢复方中药提取工艺,方法简单,精密度高;所建立的HPLC法可用于四黄止痢复方中药的检测。     

采用正交试验优选三黄连合剂制备工艺的研究

优选出防治罗非鱼链球菌病的中草药制剂最佳提取工艺,测定有效成分的含量,为该复方制剂的开发应用提供参考依据。将黄芩苷、连翘苷、大黄素作为三黄连合剂的质控指标,采用正交试验方法考察了料液比、水浴时间、水浴次数和醇沉浓度等因素对提取得率的影响。应用高效液相色谱法(HPLC)测定三种有效成分含量,建立了黄芩苷、连翘苷和大黄素含量同时测定的方法,优选出三黄连合剂最佳提取工艺条件。结果表明,在提取因素方面,水浴次数是三黄连合剂提取的主要影响因素,最佳提取工艺为A3B2C3D1,即按处方量称取药材,加20倍量水进行水浴3次,每次1 h,醇沉浓度为60%。优化后的三黄连合剂有效成分黄芩苷、连翘苷和大黄素的含量分别为7.34 mg/mL、3.39 mg/mL和32.90 g/mL,该技术工艺路线能有效提高三黄连合剂的有效成分的含量,对抗罗非鱼链球菌病中草药复方制剂的临床应用提供依据。     

猪流行性腹泻病毒Vero细胞微载体培养条件的优化试验

通过研究搅拌速度、pH值、血清浓度等环境条件对细胞贴壁的影响以及细胞接种密度、微载体浓度与细胞生长的关系 ,对应用微载体技术和生物反应器系统生产猪流行性腹泻病毒(PEDV )的可行性进行了探讨。结果表明 ,搅拌转速、pH值、血清浓度均对Vero(PEDV )细胞在CT 3微载体上的贴壁率和均匀分布有影响 ;当接种密度为 15 .0× 10 4 /mL时 ,即每 1mg微载体接种 5 .0× 10 4 细胞时 ,可以获得较高的细胞密度 ;随着微载体浓度的提高 ,最高细胞密度也增加 ;在CelliGen反应器中 ,采用优化的培养条件 ,细胞密度可达到 174 .0× 10 4 /mL ,是方瓶培养的 3.5倍 ,每个细胞的PEDV含量与方瓶培养相当 ,制备的疫苗免疫原性好     

车前子黄酮的响应面法优化微波提取及其对鸡抗氧化能力的影响

本试验旨在单因素试验的基础上,考察乙醇体积分数、料液比、微波处理时间对车前子黄酮提取率的影响,利用响应面法确定微波提取车前子黄酮的最佳工艺,并研究微波提取的车前子黄酮对环磷酰胺(cyclophosphamide,CY)诱导鸡氧化应激的影响。选用100只1日龄白羽种蛋鸡公雏,随机分为5组(每组20只),即空白组、CY组(环磷酰胺+生理盐水)组、高剂量组(环磷酰胺+60 mg/mL车前子黄酮)、中剂量组(环磷酰胺+40 mg/mL车前子黄酮)和低剂量组(环磷酰胺+20 mg/mL车前子黄酮),比较不同水平车前子黄酮对氧化应激鸡抗氧化能力的影响。结果显示,车前子黄酮最佳提取条件是乙醇体积分数为64.80%、料液比为1∶21.58、微波处理时间为7.08 min,该条件下黄酮的提取率为11.40 mg/g。动物试验结果表明,车前子黄酮可显著提高氧化应激鸡血清的总抗氧化能力,提高超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶的活性,并可以降低血清中丙二醛的浓度。结果表明,采用响应面法对车前子黄酮提取条件进行优化合理可行,车前子黄酮可在一定程度上提高鸡机体的抗氧化能力。     

动物性食品中大肠埃希氏菌O157∶H7特异性二重PCR检测方法的建立

根据大肠埃希氏菌O157∶H7wzx和fliC基因的保守序列设计了2对引物,建立并优化了特异性检测大肠埃希氏菌O157∶H7的二重PCR体系,扩增产物为395bp(wzx)和1057bp(fliC)。人工培养基中大肠埃希氏菌O157∶H7的检测下限为2.3×102CFU/mL,人工污染的牛乳、猪肉及牛肉中大肠埃希氏菌O157∶H7的检测下限分别为5.8×102CFU/mL、4.3×102CFU/g和3.1×103CFU/g。样品经3h预增菌后检测下限可达3.1×100~5.8×100CFU/mL(或CFU/g)。试验结果提示,针对wzx及fliC基因的二重PCR方法可以快速特异地检测出牛乳、猪肉及牛肉中大肠埃希氏菌O157∶H7的污染。     

水貂A型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及免疫原性研究

从送检的疑似多杀性巴氏杆菌感染的水貂中分离到1株病原菌,经培养特性、形态观察、生化试验、PCR鉴定等,确定RC1108菌株为血清A型多杀性巴氏杆菌。水貂回归试验表明,该菌株毒力较强,最小致死剂量为2.5×10~8CFU。制备的灭活疫苗在含菌量为1.5×10~9 CFU/m L时,即可在免疫后第21天提供保护。表明,该分离菌株可以作为水貂血清A型多杀性巴氏杆菌疫苗的候选株。     

姜射栀提取物涂膜剂对家兔人工感染真菌皮癣病的疗效观察

为筛选天然抗皮癣病真菌新药,观察了姜黄射干栀子(姜射栀)中药组方涂膜剂对家兔真菌皮癣病的疗效。用犬小孢子菌标准菌株人工感染健康家兔,采取有皮肤症状家兔的皮屑、被毛,进行真菌学分离培养及鉴定以确定真菌菌悬液造模成功的最低浓度。采用最低浓度的菌悬液造模。分别用22.5、67.5、202.5g/L姜射栀提取物涂膜剂通过皮肤涂擦法治疗家兔真菌皮癣病,比较观察涂膜剂的疗效。结果显示,通过培养特性、菌落性状、菌丝形态、孢子性状特征等鉴定,确定造模成功的犬小孢子菌悬液的最低浓度为1×108 CFU/mL;67.5、202.5g/L剂量组涂膜剂对家兔真菌皮癣病均有较好的疗效,其中202.5g/L涂膜剂对家兔人工感染真菌皮癣病有治愈的作用。结果表明,姜射栀提取物涂膜剂对家兔人工感染真菌皮癣病具有一定的疗效,为进一步筛选抗真菌外用新药提供了重要依据。     

金黄色葡萄球菌和大肠杆菌感染对BMEC炎性因子mRNA表达的影响

为了探讨金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)在不同时间点对奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)相关炎性因子转录水平的调节作用。本试验通过体外培养BMECs并对其进行免疫细胞化学方法鉴定。选取纯化后的原代BMECs,分别加入活菌比(MOI)为100∶1的最佳浓度的金黄色葡萄球菌或大肠杆菌对细胞进行感染,分别在感染后第0、3、6、9、12小时采样,采用qRT-PCR法检测IL1R1、IL-1β及TNF-α基因mRNA的表达情况。结果显示,在添加1×102CFU/m L金黄色葡萄球菌作用至第6小时IL1R1基因相对表达量显著高于其他时间点(P0.5);在添加1×104CFU/m L金黄色葡萄球菌作用至第9小时,IL-1β基因相对表达量显著高于其他时间点(P0.5);在添加1×103CFU/m L金黄色葡萄球菌作用至第12小时,TNF-α基因相对表达量显著高于其他时间点(P0.5)。在添加1×101CFU/m L大肠杆菌作用至第6小时,IL1R1基因相对表达量显著高于其他时间点(P0.5);在添加1×103CFU/m L大肠杆菌作用至第9小时,IL-1β基因相对表达量显著高于其他时间点(P0.5);在添加1×104CFU/m L大肠杆菌作用至第12小时,TNF-α基因相对表达量显著高于其他时间点(P0.5)。本试验结果表明,使用最佳浓度金黄色葡萄球菌或大肠杆菌作用于BMECs时,在最佳感染时间点可显著上调IL1R1、IL-1β及TNF-α基因mRNA的表达量。IL1R1、IL-1β及TNF-αmRNA表达量在临床上可作为创伤后炎症反应的敏感指标,能评价炎症反应的严重程度,对乳腺炎的病程诊断具有重要意义。本试验结果为进一步研究细菌感染引起乳腺炎的致病机理提供了理论依据。     

貂源铜绿假单孢菌的分离鉴定及其致病性研究

为确定山东威海某养殖场发病水貂的病原菌,从发病水貂肺中分离并纯化细菌,根据其形态特征、培养特性、生化试验结果及PCR鉴定,确定其为铜绿假单孢菌。致病性试验中,将8.0×1010CFU/mL的菌液10倍系列稀释后,感染60日龄健康昆明系小鼠,半数致死量和最小致死量分别为1.4×107 CFU/mL和8.0×106 CFU/mL。剖检死亡小鼠可见皮下和肺出血,并能从死亡小鼠的肺中分离出与感染菌株形态特征完全一致的菌落。药敏试验结果显示,该分离菌株对庆大霉素、环丙沙星、诺氟沙星、头孢哌酮等较为敏感,而对青霉素、链霉素不敏感。系统发育分析结果表明,该分离菌株与从小麦中分离的铜绿假单孢菌的亲缘关系最近,据此怀疑该发病水貂有可能是食用了污染的饲料引起的。     

不同部位贯众黄酮的响应曲面法优化微波提取和体外抗氧化及细胞增殖试验的研究

本试验旨在研究响应曲面法制备贯众黄酮的最佳提取工艺条件。在单因素试验的基础上,采用响应曲面法考察乙醇体积、料液比以及微波处理时间对贯众黄酮提取率的影响,并研究提取不同部位的贯众黄酮对细胞进行增殖试验和体外抗氧化能力的测定。结果显示,黄酮的最佳提取工艺:乙醇浓度70%,料液比1∶56.04,微波处理时间10.74 min,在此条件下黄酮得率的实测值为2.63%,与预测值2.69%相接近。不同部位的贯众黄酮,在一定质量浓度范围内,对羟自由基、DPPH自由基清除率和总还原能力表现良好。细胞增殖试验表现出贯众黄酮对巨噬细胞有显著的增殖作用。结果表明,采用响应曲面法对贯众黄酮提取条件进行优化合理可行,贯众黄酮具有较好的体外抗氧化和细胞增殖能力。     

柔嫩艾美耳球虫DF-1细胞培养体系的建立及应用

为了建立柔嫩艾美耳球虫的鸡胚成纤维传代细胞(DF-1)培养体系,并应用于柔嫩艾美耳球虫子孢子的细胞入侵活力检测,将CFDA-SE标记的子孢子接入DF-1细胞,利用流式细胞仪测定子孢子的细胞入侵活力。比较了37℃和41℃培养温度下,子孢子对DF-1、MDBK、Vero、BHK、MDCK五种细胞的入侵活力。优化了在子孢子入侵活力检测时,DF-1细胞最佳培养条件。结果表明,柔嫩艾美耳球虫子孢子在DF-1细胞中可发育为第一代裂殖子。在不同培养温度下,子孢子对DF-1细胞的入侵活力均高于其他细胞。优化后的DF-1细胞培养体系的培养程序为:用含100mL/L胎牛血清的DMEM稀释DF-1细胞,以每孔1×105个细胞铺被24孔板,37℃、50mL/L CO2培养24h后,用含50mL/L胎牛血清的DMEM换液后,每孔接入3×105个子孢子,41℃、50mL/L CO2培养8～12h,收集细胞进行检测。     

绵羊PRNP等位基因PCR-SSCP分析条件的优化

为进行绵羊PRNP等位基因密码子136、154、171的多态性研究,建立适合于绵羊PRNP等位基因开放阅读框(ORF)内高变区PCR-SSCP分析方法,对凝胶浓度、交联度、甘油浓度、电泳电压、电泳时间、PCR产物与变性缓冲液比例、电泳缓冲液浓度、上样量等影响因素进行了优化试验.在优化中引入了正交试验法,以使优化过程简化,结果可靠.结果表明,交联度49:1、甘油浓度0%、凝胶浓度12%、电泳电压200 V、PCR产物上样量≥2.0μL且<4.0μL、PCR产物与变性缓冲液比例1:4、0.5×TBE缓冲液及4℃电泳45 h为最佳试验条件,据此建立了绵羊PRNP等位基因136、154、171密码子的PCR-SSCP分析方法.     

响应曲面法优化硒太子参多糖纳米微球的制备工艺

本试验旨在研究响应曲面法优化硒太子参多糖纳米微球的制备工艺。在单因素试验的基础上,采用响应曲面法考察有机相(O)和内水相(W)之比、PLGA的浓度、泊洛沙姆(F68)浓度对硒太子参多糖纳米微球包封率的影响。结果表明,硒太子参多糖纳米微球的最佳制备工艺如下:O∶W为4.83,PLGA浓度为45.07 mg/m L,F68浓度为0.39%,此时硒太子参多糖纳米微球的包封率为92.46%,平均粒径为133.3 nm,zeta电位为-28.08 m V。扫描电镜结果显示,SRPP-PLGA-NPs粒径均匀,表面光滑圆整,粒子之间界限清晰,无黏连现象,具有较好的稳定性。结论表明,采用响应面法对太子参多糖纳米微球的制备工艺的条件进行优化合理可行。     

一株鸭源巴氏杆菌强毒株的分离鉴定及致病性研究

为确定导致山东某地区种鸭发病的病原,从病鸭肝、心、肺中分离并纯化细菌,根据其形态特征培养特性、生化试验结果及PCR鉴定,确定为禽多杀性巴氏杆菌。致病性试验结果表明,1.3×109CFU/m的菌液10倍系列稀释后,感染20日龄健康雏鸡和1日龄健康雏鸭,该分离菌对20日龄健康雏鸡和1日龄健康雏鸭的半数致死量分别为10-4.5CFU/mL、10-5.3CFU/mL;死亡雏鸡(鸭)的剖检病变与发病鸭类似并分离出与感染菌株形态特征完全一致的菌落。药敏试验结果显示,该分离菌株对头孢曲松、氨苄西林、阿莫西林、环丙沙星、卡那霉素等较为敏感。     

绵羊睾丸原代细胞培养及接种羊痘弱毒后的病变观察

研究了在相同培养条件下不同培养液、不同血清和不同细胞密度对绵羊睾丸细胞生长的影响 ,并对该细胞接种羊痘弱毒后的病变情况进行了观察。结果 ,3种培养液对绵羊睾丸细胞生长的支持作用表现为MEM液 >199液 >乳汉液 ,但差异不显著 ;用犊牛血清的最适细胞密度为8.0× 10 5～ 1.0× 10 6 /mL ,用成年牛血清的最适细胞密度为 1.0× 10 6 /mL ,用绵羊血清的最适细胞密度为 8.0× 10 5/mL ;原代培养生长良好的细胞接种羊痘弱毒后出现了明显的细胞病变     

新生仔猪大肠埃希氏菌性腹泻K88ac-ST1-LTB三价基因工程灭活疫苗生产工艺的研究

以实验室工艺为基础,用发酵罐培养,对培养基、诱导剂及诱导条件、通气量、菌液灭活条件等进行了筛选优化。结果表明,重组菌株BL21(DE3)(pXK88acST3LT5)培养的最适培养基为改良LB培养基;乳糖为适合于工业化生产的诱导剂,其最适浓度为100 mmol/L,诱导时间不低于6 h;2×105mL发酵罐培养的最佳通气量为500 L/min;培养菌液的灭活条件为按菌液总量加入4 mL/L甲醛溶液,37℃灭活48 h。按上述工业化生产条件生产疫苗5批,检验结果均安全有效。     

噬菌体制剂沙立宁对鹅源沙门菌感染的抑菌效果研究

为了探讨噬菌体制剂沙立宁对鹅源沙门菌的抑菌效果,本研究选取血清型分别是鼠伤寒沙门菌和乙型副伤寒沙门菌的2株鹅源沙门菌,首先利用改良寇氏法计算2株菌的半数致死量(LD_(50)),然后利用2株菌人工感染3日龄SPF雏鸡,再用噬菌体制剂沙立宁和头孢噻肟处理感染后的SPF雏鸡,观察雏鸡的临床症状及内脏解剖学变化,检测肝和盲肠的载菌量及两种组织的病理组织学变化。结果显示,鼠伤寒沙门菌和乙型副伤寒沙门菌的LD_(50)分别为1.43×10~7CFU/mL和4.40×10~6CFU/mL;感染2株沙门菌后,雏鸡表现精神萎顿、垂头呆立、闭眼昏睡、绒毛松乱、食欲减退、排白色浆糊状稀便,严重者全身抽搐、呼吸困难,甚至死亡。雏鸡肝中的载菌量随着感染时间延长呈先增加后减少的现象,盲肠载菌量则表现为逐渐减少。组织学方面,肝细胞出现肿胀、胞质疏松、炎性细胞浸润现象,盲肠则表现出固有层炎性细胞浸润、绒毛断裂现象。利用噬菌体制剂沙立宁和头孢噻肟治疗后,雏鸡肝和盲肠载菌量明显减少,两种组织形态趋于恢复正常,炎症反应减轻或消失。结果表明,鹅源沙门菌可以感染雏鸡,噬菌体制剂沙立宁和头孢噻肟对2株鹅源沙门菌的感染均具有抑制效果。     

地昔尼尔乳剂的制备及其HPLC测定方法的建立

为制备地昔尼尔乳剂并建立其质量浓度的测定方法,以稳定常数和离心稳定性作为乳剂稳定性评价指标,采用单因素试验和正交设计试验法考察处方因素和工艺因素对乳剂稳定性的影响,以筛选出乳剂的最优处方和制备工艺;采用高效液相色谱法(HPLC)测定乳剂的药物质量浓度。结果显示,地昔尼尔乳剂的最优处方为地昔尼尔50g/L、乳化剂70mL/L、油相125mL/L、助乳化剂160mL/L、稳定剂为3.5g/L;地昔尼尔乳剂的制备方法为乳化温度50℃,20 000r/min高速搅拌10min。建立的HPLC色谱条件为色谱柱X Bridge C18(4.6mm×250mm,5μm),流动相乙腈与水(6mL/L三乙胺+2mL/L甲酸)的体积比为10∶90,流速0.8mL/min,柱温30℃,紫外检测波长267nm,进样体积20μL。在10~100μg/mL的质量浓度范围内,峰面积与药物浓度呈良好线性关系(r2=0.999 9,n=7),回归方程为y=148.01x+91.629。精密度试验相对标准偏差均小于2%,在80%、100%和120%3个添加水平时,平均回收率为98.36%,精密度、回收率均符合要求。定量限和检测限分别为10ng/mL和20ng/mL,测得3批地昔尼尔乳剂的平均质量浓度为49.29mg/mL,为标示量的98.57%。结果表明,该处方合理、制备工艺可靠,所建立的高效液相色谱法可用于地昔尼尔乳剂的检测。