新城疫病毒传染性支气管炎病毒和传染性喉气管炎病毒共检基因芯片的构建

本试验在前期研究的基础上,进一步构建了联合检测新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)的基因芯片。克隆和鉴定了NDV-F、NDV-HN、IBV-M、IBV-N、ILTV-TK、ILTV-gB共6个基因,将其特异cDNA/DNA片段作为靶基因点制于氨基修饰的玻片上,制备了NDV-IBV-ILTV共检基因芯片阵列。以这3种病毒的核酸作为模板,引入Cy3-dCTP进行探针的PCR扩增标记,标记产物与芯片杂交,进行基因芯片的有效性评价,同时对该芯片的特异性、敏感性和稳定性进行了评价,并进行了临床初步检测验证。结果,确定了NDV-IBV-ILTV共检芯片的探针PCR扩增标记体系,确定Cy3-dCTP终浓度为100μmol/L;以禽流感病毒和传染性囊病病毒为模板制备的探针不与NDV-IBVILTV芯片杂交,NDV、IBV、ILTV之间无交叉反应;该芯片检测的灵敏度为20pg/μL;随机抽取3张不同批次制备的芯片,与NDV-F和NDV-HN的杂交结果显示,SNR均大于3。分别用该基因芯片和PCR/RTPCR检测了12份临床病料,结果显示,NDV检出率为16.67%,IBV检出率为41.67%,ILTV检出率为0,两者的检测结果一致。结果表明该检测技术能够用于NDV、IBV和ILTV快速诊断和临床病料的检测。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒和日本脑炎病毒二联基因芯片的构建与应用

针对靶基因库中猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的重组质粒T/PRRS-PS9、T/Y11和日本脑炎病毒(JEV)的重组质粒T/PRM/M、T/JEV-C,设计4对特异性引物,采用PCR扩增获得4个靶基因片段,并用PCR标记Cy3探针,建立了一种检测PRRSV和JEV的芯片方法。特异性试验结果显示,PRRSV、JEV之间无交叉杂交,猪瘟病毒、猪细小病毒、伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒与PRRSV-JEV基因芯片无杂交反应。灵敏性试验结果显示,50μL杂交体系中探针DNA的质量浓度为0.295pg/μL时仍为杂交阳性。对从猪场收集的31份样品进行处理并用基因芯片检测,PRRSV的检出率为12.9%(4/31),JEV的检出率为9.68%(3/31),PRRSV与JEV混合感染的检出率为0(0/31)。此方法的结果与PCR的检测结果完全符合。结果表明,所建立的二联基因芯片有望成为一种快速鉴别PRRSV与JEV的新方法。     

五种重要猪病病毒基因芯片探针的建立及其应用

将猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病痛毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)的特异cDNA片段作为探针点制于氨基修饰的玻片上,以这5种细胞毒的核酸作为模板,进行不对称PCR扩增,制备靶物,经绿色荧光染料Cy3标记后,分别与cDNA微阵列的芯片探针进行杂交,杂交信号经Genepix 4000A扫描仪扫描.结果显示,该芯片探针可以特异地与Cy3标记的这5种靶物结合.用该基因芯片对100份现地采集的猪全血样品进行检测,检出PRRSV阳性样品26份,PCV-2阳性样品47份,PRRSV和PCV-2混合感染阳性样品17份,PPV阳性样品5份,PRV阳性样品2份,CSFV阳性样品20份.表明,本试验研制的cDNA芯片探针可以特异地检测这5种猪病病毒,具有良好的诊断应用前景.     

H5、H7和H9亚型禽流感病毒液相芯片检测方法的建立

为应用液相芯片技术建立同时检测H5、H7、H9亚型禽流感病毒(AIV)的方法,在GenBank中收集H5、H7、H9亚型AIV的HA基因序列,利用DNAMAN软件分析比较筛选出特异的保守片段,设计引物和探针。将多重不对称RT-PCR扩增产物与偶联荧光微球的探针进行杂交,建立多重液相芯片方法。结果显示,多重液相芯片技术对H5、H7、H9亚型AIV核酸的最低检出量分别为18.5、28.7、20.7pg/μL,检测的特异性和重复性都很好,应用该方法和禽流感检测试剂盒双盲试验同时对50份已知病毒的样品进行了检测,两者符合率为100%。该方法为禽流感病毒核酸液相芯片的进一步研究奠定了基础。     

用于诊断4种猪病毒病的寡核苷酸芯片的研制

制备可同时检测引起集约化养猪业常见4种传染病,病毒(猪流感病毒、口蹄疫病毒、猪伪狂犬病毒、猪蓝耳)的寡核苷酸芯片。根据4种猪疫病病毒特异性基因的保守区域设计合成了60 mer寡核苷酸探针,制备寡核苷酸芯片。采用不对称PCR和间接荧光标记技术进行单链DNA扩增和荧光标记,标记样品与寡核苷酸芯片杂交后,进行芯片清洗、扫描及结果分析。杂交结果显示,4种病毒的寡核苷酸检测探针均特异地与相应的标记样品杂交,芯片上呈现较强的阳性杂交信号,而除阳性质控探针外,阴性对照和空白对照均检测不到荧光信号。证明寡核苷酸芯片适用于快速、准确、高通量地诊断影响集约化养猪业的多种猪疫病病毒。     

禽流感病毒NS1抗体间接阻断ELISA检测方法的建立

以禽流感病毒(AIV)重组NS1蛋白作为检测抗原,兔抗NS1血清为阻断抗体,建立了检测AIVNS1抗体的间接阻断ELISA方法.经筛选确定,抗原的最佳包被浓度为0.6 tμg/mL,阻断抗体的最佳稀释度为1:10 000,待检血清最佳稀释度为1:10.用该方法对42份AIV感染禽类血清样本和50份用AIV灭活疫苗免疫的禽类血清样本进行检测,结果显示,该方法的敏感性为95.2%,特异性为90.0%.交叉反应试验证明,该方法与新城疫等8种其他禽病阳性血清不发生交叉反应.临床检测结果显示,185份AIV灭活疫苗免疫禽血清样本的阴性率为89.2%,20份基因工程疫苗免疫禽血清样本的阴性率为95.0%,42份健康非免疫禽血清样本的阴性率为100%.表明,建立的间接阻断ELISA方法可用于区分AIV自然感染禽和疫苗免疫禽.     

几种动物病毒的基因芯片检测技术

分别用水疱性口炎病毒、蓝舌病病毒、口蹄疫病毒、猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒、鹿流行性出血热病毒和赤羽病病毒各一段高度保守的基因片段构建质粒 ,在此基础上制备了芯片探针。提取样品中的核酸 ,经反转录和荧光标记后滴加到芯片上进行特异性杂交 ,对杂交结果扫描检测 ,可同时对上述 7种动物传染病进行快速、准确的诊断 ,此方法敏感性高 ,特异性强 ,适合于大批动物高通量检疫。     

禽流感病毒N1和N2亚型神经氨酸酶RT-PCR鉴别方法的建立

针对家禽中流行较为广泛、危害相对大的禽流感病毒(AIV)N1、N2亚型神经氨酸酶基因设计了2对引物,建立了一种RT-PCR鉴别方法,其目的片段大小分别为358 bp、377 bp.经对A/goose/Guangdong/1/96(H5N1)、A/Turkey/England/N28/73(H5N2)、A/African starling/983/79(H7N1)和A/Turkey/Wiscosin/1/66(H9N2)病毒株的鸡胚尿囊液样品进行扩增,扩增片段的大小与预期大小完全相符.经对国内不同地区分离的16株AIV N1亚型和21株AIV N2亚型用RT-PCR方法检测,阳性检出率分别为87.5%(14/16)和95.2%(20/21);对50份样品进行盲检,准确率为98%(49/50).     

犬瘟热病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立快速检测犬瘟热病毒的诊断方法,根据GenBank中犬瘟热病毒核衣壳蛋白(NP)基因的保守序列设计1对特异性引物和1条特异性探针,通过对反应体系和反应条件的优化,建立了TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法。结果显示,该方法对犬瘟热病毒最低检出量为80copies/μL,是常规RT-PCR的100倍;与其他犬类病毒不发生交叉反应;组内、组间变异系数均小于5%。对收集的67份临床样品进行检测,阳性检出率为64.2%,而常规RT-PCR的阳性检出率为44.8%。研究结果表明,建立的TaqMan实时荧光定量RT-PCR具有良好的敏感性、特异性和稳定性,为犬瘟热的早期诊断提供了技术手段。     

禽流感病毒M1抗体间接阻断ELISA检测方法的建立

以禽流感病毒(AIV)重组M1蛋白作为检测抗原,兔抗M1血清为阻断抗体.建立了检测AIVM1抗体的间接阻断ELISA方法.经筛选确定,抗原最佳包被浓度为0.78 μg/mL,阻断抗体最佳稀释度为1:15 000,待检血清最佳稀释度为1:10.用该ELISA方法对38份AIV阳性禽类样本和26份A1V阴性禽类样本进行检测,结果显示.该方法的敏感性为97.37%,特异性为96.15%.交叉试验证明该方法与新城疫等8种其他禽病阳性血清不发生交叉反应.用该ELISA方法对268份已知HI效价的临床样品进行检测,结果与HI的符合率达92%以上.表明,建立的间接阻断ELISA方法可用于AIV抗体的检测和禽流感的流行病学调查.