禽流感病毒RT-PCR及多重RT-PCR检测技术的建立

研究建立了禽流感病毒(AIV)A型、H5、N1、H9、N2亚型特异性RT-PCR及H5/N1、H9/N2、A/H5/N1多重RT-PCR检测技术,用于检测或同时检测和鉴别A型及H5N1、H9N2亚型AIV。所建立的RT-PCR和多重RT-PCR从核酸提取、基因扩增到产物分析在3~4h内即可完成,经对36株AIV及相关病毒分离物检测,与病毒分离鉴定的结果完全一致,且与相关病毒或其他亚型无交叉反应。采用多重RT-PCR检测80份棉拭子样品,并与病毒分离鉴定方法比较,二者H5N1、H9N2亚型的鉴定结果完全吻合。结果表明,该方法具有快速、敏感、特异等优点,为临诊样品中AIV型及H5N1、H9N2亚型鉴定和诊断的有效方法。     

H7N9亚型禽流感病毒HRM检测方法的建立

根据H 7N 9亚型禽流感病毒(AIV)的HA和NA基因保守区域,分别设计了2对特异性引物,通过优化反应条件,建立了基于高分辨率熔解曲线(HRM)分析的H7N9亚型AIV检测方法。结果显示,该方法特异性强,其他常见禽源病毒及非H7亚型和非N9亚型的AIV不能形成特异熔解峰形;灵敏度高,对H7和N9阳性质粒的最低检测限分别达到1.0×101 copies/L和1.0×100 copies/L;重复性好,熔解峰Tm 1和Tm2的批内和批间变异系数均1%;临床样本检测与某商品化H7N9亚型AIV定量PCR检测试剂盒比较,符合率为100%。该方法可用于临床疑似病例的应急检测、早期诊断及养鸡场、活禽交易市场等外环境H7N9亚型AIV的监测。     

H5和H7亚型禽流感病毒多重反转录聚合酶链反应快速检测及鉴别方法的建立

参考禽流感病毒(AIV)M基因和HA基因序列设计了3对引物,其中1对为针对不同HA亚型AIV的通用引物,另外2对为分别针对AIVH5和H7亚型的特异性引物。这些引物所扩增的cDNA片段大小分别为244、860和634bp。利用这3对引物,通过对多重RTPCR扩增条件的优化,成功建立了快速检测鉴别AIVH5、H7亚型的多重RTPCR技术。特异性和敏感性试验结果表明,该技术对AIVH5亚型同时扩增出2条大小分别为244bp和860bp的cDNA片段;对AIVH7亚型同时扩增出2条大小分别为244bp和634bp的cDNA片段;对AIVH5和H7亚型混合样品能同时扩增出3条大小分别为244、860和634bp的cDNA片段;对其他AIVHA亚型只扩增出1条244bp的cDNA片段;对其他常见禽病病原扩增均为阴性;该多重RTPCR对AIVRNA、AIVH5和AIVH7亚型RNA的最低检出量分别为10、100和100pg。     

H11亚型禽流感病毒RT-LAMP可视化检测方法的建立

利用反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP),建立一种特异、灵敏和快速的H11亚型禽流感病毒(AIV)RT-LAMP可视化检测方法。根据H11亚型AIV HA基因保守序列,设计6条特异性引物,优化反应条件,进行特异性、敏感性和临床样品检测。结果显示,该方法只能扩增H11亚型AIV,不与其他亚型AIV和禽病病原体发生交叉反应,表明该方法特异性强;对H11亚型AIV RNA的检测下限为10fg,表明该方法敏感性高;在63℃等温条件下作用1h即可完成全部扩增反应;对206份临床样品的检测结果与病毒分离一致。结果表明,本研究中建立的H11-RT-LAMP检测方法具有简便、快速和结果可视化的优点,尤其适合在基层兽医站和养殖场进行快速检测,具有非常广阔的应用前景。     

H9亚型禽流感病毒RT-PCR检测方法的建立

通过分析流感数据库中123个HA序列,根据HA保守区序列设计并合成了1对引物,建立了一步法RT-PCR检测方法,预期扩增片段大小为732 bp。通过对H9亚型禽流感病毒(AIV)不同稀释度的尿囊液和棉拭子浸出液进行检测,证实病毒尿囊液的最低检出量为1×104.7EID50/mL;阳性棉拭子的最低检出量为1×102.5EID50/mL。用该方法检测H1~H15亚型AIV和鸡新城疫病毒等其他14种禽病病原,结果仅有H9亚型AIV出现特异性目的条带,而其他均未出现目的条带。脏器及咽喉、泄殖腔棉拭子样品在1∶10稀释度下,病毒分离和RT-PCR方法可以达到相同的阳性检出率。表明建立的AIV H9亚型RT-PCR方法具有较好的特异性和敏感性。     

H5亚型禽流感病毒HA1基因在Sf9昆虫细胞中的表达及其抗原性检测

利用pBlueBacHis2杆状病毒载体在昆虫细胞Sf9中表达H5亚型禽流感病毒(AIV)的 HA1基因。Western-blotting证明HA1在昆虫细胞中得到了表达,其产物具有抗原性;且不与 H7、H9 AIV的抗血清发生交叉反应,具有良好的特异性。Dot-ELISA结果显示,表达蛋白可以在非变性条件下与相应抗体作用,同样具有良好的抗原性。试验结果证明,表达的H5亚型AIV的 HA1蛋白,为检测禽类体内是否感染H5亚型AIV和监测免疫禽类血清H5抗体水平提供了优良的检测抗原。     

H5亚型禽流感病毒反应原性差异及ELISA检测方法的研究

在获得禽流感病毒多克隆抗体及H5亚型特异性单克隆抗体的基础上,建立了H5亚型特异性抗原捕捉ELISA检测方法。通过分析不同单克隆抗体与不同禽流感毒株的反应性差异,筛选高特异性和高敏感性的H5亚型单克隆抗体。优化反应条件,确定包被抗体、检测抗体及酶标抗体的最佳工作浓度,进行敏感性、特异性、重复性及稳定性分析,并与斑点ELISA、H5N1多重RT-PCR或病毒分离鉴定的结果相比较,同时使用该方法对野外样品进行了检测。结果表明,该方法敏感、特异,具有良好的重复性和稳定性,可用于检测临床样品、鸡胚培养物及细胞培养物中的H5亚型禽流感病毒。     

高致病性H7N9流感病毒荧光RT-PCR检测方法的建立

2017年初在中国出现的H7N9流感病毒变异株表现出对禽高致病性的特征,根据高致病性H7N9流感病毒(HP-H7N9)的HA基因序列,设计1组HP-H7N9特异性的引物和探针,在对反应体系进行优化的基础上,建立了HP-H7N9的荧光RT-PCR检测方法并进行了特异性、敏感性和重复性试验,制作了标准曲线。结果显示,本方法只对HP-H7N9特异性扩增,而对低致病性H7N9病毒(LP-H7N9)、H7N3流感病毒(H7N3)、H3N2流感病毒(H3N2)、H5N1禽流感病毒(H5N1)、H9亚型禽流感病毒(H9)、新城疫病毒(NDV)、甲型H1N1流感病毒(H1N1)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)等病原未见扩增。该方法最低能够检测到35.45 copies的阳性质粒,具有良好的检测灵敏度。本方法的建立将为HP-H7N9的诊断、监测和防控提供快速、特异、敏感的技术手段。     

雏鸭感染H5N1亚型禽流感病毒后主要组织器官超微病理变化及病毒抗原分布的动态变化研究

应用电子显微镜技术和RT-PCR检测方法,对H5N1亚型禽流感病毒(AIV)感染雏鸭后的主要组织器官超微结构变化和病毒抗原分布的动态变化进行了研究,为进一步探讨H5N1亚型AIV的致病机制提供了十分重要的参考依据。21日龄雏鸭感染AIV后第3~7天,RT-PCR结果显示,雏鸭各个实质器官内均有AIV分布,但不同组织无论病毒出现时间,还是病毒的持续时间,均有较大差异,其中肝脏和胰脏,检出病毒时间最短,持续时间最长;组织显微病理学结果显示法氏囊、脾脏和胸腺等免疫器官内淋巴细胞数量减少,部分细胞核固缩、染色质边集或溶解;肺泡上皮细胞部分细胞核固缩变形等。上述研究结果表明,H5N1亚型AIV感染雏鸭后具有广泛的组织细胞嗜性,其中,肝脏和胰脏是该株AIV复制的主要靶器官,AIV诱导呼吸器官和免疫器官发生明显的细胞坏死或凋亡可能是H5N1亚型AIV致病性的重要表现形式。     

禽流感病毒等RNA病毒鉴别基因芯片的制备

将克隆和鉴定的AIV的HA、NA、M、NS、NP基因以及NDV、IBDV,IBV的保守基因片段作为探针,同时以克隆的GAPDH基因作为阳性对照,利用芯片点样系统spotArray<'TM>24将探针与阳性对照、阴性对照和空白对照按照设计好的阵列点在基片上,制备了AIV等RNA病毒诊断芯片,并从点样条件和杂交条件两个方面进行了优化.结果显示,探针浓度在300～1 200 μg/mL时点样,Cy3-dUTP终浓度为0.05μmol/mL,杂交温度在42℃,杂交时间在8～12 h时,杂交信号比较理想.该方法对20份已鉴定的H5N1亚型禽流感病毒的检出率为100%(20/20);10份现地送检的疑似AIV样品的检出率为70%(7/10),检测结果与RT-PCR和鸡胚传代分离鉴定的符合率为100%.结果表明,制备的DNA芯片可有效诊断上述病毒.     

禽流感病毒H7亚型血凝素基因的原核表达及鉴定

参考已发表的禽流感病毒 (AIV)H7亚型血凝素 (HA)基因序列设计引物 ,经RT PCR扩增了AIV H7亚型的HA1基因片段 ,再将该片段定向插入到原核表达载体 pGEX 4T 2中 ,转化大肠埃希氏菌。重组表达载体经酶切和测序鉴定后 ,用IPTG诱导表达。用Western blotting和ELISA试验鉴定表达产物的抗原性。结果表明 ,融合表达蛋白能与AIVH7N1、H7N2、H7N7和H1N1亚型标准抗血清反应 ,而与H5N1、H9N 2等其他 13个亚型的抗血清无交叉反应。     

贵州省部分地区8种鸭病毒性疾病流行情况调查

为掌握贵州省部分地区2016—2018年鸭的8种重要病毒病的流行情况。以贵阳、安顺、黔南及黔东南地区的7个养鸭场共计28 230羽发病鸭为调查分析对象,通过走访调查,现场随机采集血清样本168份,病料样本64份。采用血凝HA与血凝抑制HI试验检测发病鸭血清中H9亚型AIV和NDV感染抗体;采用ELISA方法检测发病鸭血清DHV、NDRV、DTMUV、MDPV、DuCV和NGPV感染抗体;采用PCR/RT-PCR方法检测8种病原核酸。结果显示,贵州省鸭群免疫接种了高致病性禽流感(H5、H7亚型)及鸭瘟疫苗;血清学方法检测出NDV、DuCV、DTMUV及H9亚型AIV感染抗体阳性率分别为47.62%(80/168)、22.61%(38/168)、8.93%(15/168)及7.14%(12/168),而DHV、NDRV、NGPV和MDPV感染抗体检测结果均为阴性;PCR/RT-PCR方法对64份临床样本进行8种病原核酸检测,NDV、H9亚型AIV、NGPV及DuCV特异性核酸片段检出率分别为34.38%(22/64)、21.88%(14/64)、12.50%(8/64)及7.81%(5/64),NDV与AIV H9亚型混合感染检出率为18.75%(12/64),而DHV、NDRV和MDPV特异性核酸片段均未被检测出。结果表明,贵州省鸭存在NDV、H9亚型AIV、DTMUV、DuCV及NGPV五种病毒感染,不同病毒以单纯和混合感染形式感染贵州鸭。本研究旨在为贵州省鸭的病毒性疾病防控提供参考依据。     

H5N1亚型禽流感病毒神经氨酸酶基因的表达及纯化

用RT-PCR方法从H5N1亚型禽流感病毒(AIV)A/Duck/Zhejiang/12/00中获得NA基因,将目的基因定向克隆到原核表达载体pET-32a中,将序列测定和双酶切验证准确的阳性重组质粒转化大肠杆菌BL21,用IPTG诱导,经SDS-PAGE和Western-blot分析,结果显示,重组蛋白得到了可溶性表达,表达的蛋白质分子质量为33 ku;该蛋白可以与禽流感H5N1亚型阳性血清反应,具有良好的免疫原性;ELISA检测结果表明,用此纯化蛋白作为包被抗原检测H5N1亚型AIV神经氨酸酶抗体具有良好的灵敏性。     

H1N1和H3N2亚型流感病毒基因芯片检测方法的建立

为建立同时能鉴别甲型H1N1和猪流感病毒常见亚型的新型基因芯片检测方法,根据GenBank中已发表的甲型流感病毒MP的基因序列和甲型H1N1(2009)和猪流感病毒H1N1、H3N2亚型的基因序列,设计、筛选并合成7对特异性引物和1对通用引物;根据扩增的靶序列,设计并合成14条特异性探针和3条质控探针,制备了甲型H1N1(2009)流感病毒和猪流感病毒H1N1、H3N2亚型基因芯片;并进行了特异性试验、敏感性试验和田间样品的检测。结果显示,该芯片检测方法与猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)等猪常见病毒无交叉反应;对猪H1N1、猪H3N2和甲型H1N1(2009)流感病毒而言,最低可检测到105、104和105稀释的病毒株。结果证实,该方法特异性强、敏感性高,是一种高通量的甲型H1N1和猪流感常见亚型筛查方法。     

禽流感H9亚型油乳剂灭活疫苗的改进

用新引进的 6株禽流感病毒 (AIV )H9亚型和现制苗用的AIV H9毒株分别制备AIV H9、AIV H5、NDV二联三价油乳剂灭活疫苗 ,免疫 5日龄和 10日龄雏鸡 ,于免疫当日直至 80日龄鸡出栏期间定期采血 ,用HI法检测相应的AIV H9、AIV H5和NDV抗体。结果表明 ,10日龄免疫鸡的AIV H9抗体效价最高 ,5日龄和 10日龄免疫鸡的AIV H5抗体效价差别不明显 ;用引进的 3号AIV H9毒株制备的联苗对 10日龄雏鸡免疫后 2 0d产生AIV H9保护性抗体 ,一直持续到 80日龄以上 ,期间的抗体平均效价为 6 .72 (lb) ,而现制苗用的AIV H9毒株制备的联苗免疫力较差 ;现制苗用的AIV H5毒株制备的联苗免疫效力仍较好 ;分别接种 0 .2 5、0 .30mL/只联苗的雏鸡AIV H5抗体效价没有明显差别 ,而AIV H9抗体效价以接种 0 .30mL/只剂量的为高 ;不同日龄、不同免疫剂量的试验鸡NDV抗体效价没有明显差异。     

H5N1和H9N2亚型禽流感病毒型特异性抗原捕捉ELISA检测方法的建立

采用禽流感病毒多克隆抗体及型特异性单克隆抗体,研究建立了型特异性抗原捕捉ELISA检测方法,用于检测H5N1和H9N2亚型禽流感病毒。优化了反应条件,确定了包被抗体、检测抗体及酶结合物的最佳工作浓度,对该方法的敏感性、特异性、重复性及稳定性进行了分析,并与病毒分离鉴定的结果进行了比较。结果表明,该方法敏感、特异,具有良好的重复性和稳定性,可用于临床样品及鸡胚、细胞培养物中禽流感病毒的检测。     

A型H1N1及H3N2亚型流感病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立

根据A型H1N1亚型流感病毒2009年北美变异株和H3N2亚型流行株的基因序列,设计了3套特异性引物、TaqMan探针,分别用不同的荧光基团标记,以构建的A型流感病毒及H1N1和H3N2亚型流感病毒基因重组质粒作为阳性对照,经反应条件优化,特异性、敏感性和重复性试验,筛选出3套不同的反应体系及同一个反应参数,建立了可同时检测A型流感病毒、H1N1和H3N2亚型流感病毒的实时荧光RT-PCR方法。结果表明,该方法可特异地检测H1N1(人源、猪源)、H3N2(猪源),禽流感病毒H5、H9等A型流感病毒,且与新城疫病毒、减蛋综合征病毒等其他病毒不发生交叉反应,具有特异、敏感、重复性好、快速、费用低廉等优点,试验耗时仅3h。表明,建立的方法,一次试验即可完成A型流感病毒的初筛和H1N1、H3N2亚型流感病毒的初步确认定型。     

H5亚型禽流感病毒RT-LAMP快速检测方法的建立

根据GenBank中登录的H5亚型禽流感病毒(H5-AIV)血凝素基因序列,设计了1套特异识别HA基因序列中6个不同区段的环介导恒等温扩增(LAMP)引物,并以此套引物建立了一种基于LAMP技术的H5亚型禽流感病毒诊断方法。结果表明,该方法对H5-AIV RNA的最小检测限为10-6,灵敏性高于一步RT-PCR方法;全部反应可在1.5 h内完成;在反应体系中添加SYBR GREENⅠ染料后,可通过肉眼观察有无荧光直接判定结果。灵敏性及特异性试验证明,该方法灵敏度高、特异性好,能够作为H5亚型禽流感病毒的快速诊断方法。     

H7N9亚型禽流感病毒血凝素和神经氨酸酶单因子血清的制备

为获得特异性H7N9亚型禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)单因子血清,根据GenBank中A/Chicken/Zhejiang/SD007/2013毒株的序列人工合成了HA基因和NA基因,然后将其分别克隆至真核表达载体pCAGGS,构建了重组真核表达质粒pCAGGS-HA和pCAGGS-NA,经酶切和测序鉴定后将阳性重组质粒转染COS-7细胞,利用H7N9AIV鸡血清进行Western-blot分析。结果显示,重组质粒中的目的基因均能够成功表达。将重组质粒以每只200μg的剂量免疫4周龄SPF鸡,二免后第14天采集血清并用间接免疫荧光试验和Western-blot检测抗体。结果显示,免疫鸡产生的血清均能与对应质粒经COS-7细胞表达的蛋白发生特异性反应。结果表明,成功制备的H7N9AIV HA蛋白和NA蛋白单因子血清具有良好的反应原性,为提高H7N9AIV的血清学检测方法的准确性提供了一定技术支撑。     

禽流感野毒感染禽与疫苗免疫禽NS1-ELISA鉴别方法的建立

分别构建了重组禽流感病毒H9N2亚型、H5N1亚型NS1基因原核表达菌株,IPTG诱导表达,表达的蛋白用Ni -NTA Agarose纯化,Western-blotting检测两种蛋白的活性,并进行交叉反应检测;以H5N1亚型禽流感病毒NS1蛋白为包被抗原,建立了间接ELISA检测方法,并优化各项反应条件.高效表达了H9N2和H5N1亚型NS1蛋白,融合蛋白的分子质量均为30 ku左右;Western-blotting检测均有特异性条带,并且存在明显的交叉反应.选择重组的H5N1亚型NS1蛋白建立了间接ELISA检测方法,最佳抗原包被浓度为1.325μg/mL,血清稀释度为1400.结果表明,以H5N1亚型禽流感病毒NS1蛋白为包被抗原的ELISA检测方法可区分禽流感病毒感染禽与疫苗免疫禽.