水源性肠球菌对苯扎溴铵及部分抗菌药的耐药性研究

为了解水源性肠球菌对抗菌药和苯扎溴铵的耐药现状,为后期的用药提供新的方向和理论依据。运用肠球菌选择培养基和多重PCR法对福建省部分河流和猪场环境中的水源性肠球菌进行分离和种水平鉴定,采用微量肉汤法测定分离菌株的MIC值,并且用PCR方法检测16种相关抗性基因。结果显示,福建省部分地区水源性肠球菌的分离率为71.43%,其中粪肠球菌占41.33%、屎肠球菌占14.67%;多重耐药率为74.67%,对红霉素的耐药率最高,为81.33%,其次为四环素74.67%,对氨苄西林和万古霉素较敏感,耐药率仅为4.00%和2.67%;有22.67%的分离菌对苯扎溴铵的MIC值高于标准菌;共有9种抗性基因被检出,其中gyrA基因的检出率最高,为93.33%,其次是tetL基因,也高达80.00%。结果表明,福建省部分地区水源性肠球菌分离率较高且多重耐药现象严重,粪肠球菌为优势菌,且耐药率高于屎肠球菌,携带多个抗性基因是导致分离菌株对抗菌药物产生耐药性的主要原因,分离菌整体对苯扎溴铵较敏感,耐受水平低。     

发情期大熊猫阴道源产H_2O_2乳酸菌的分离鉴定及筛选

为了筛选大熊猫阴道中具有产过氧化氢特征的阴道乳酸菌,通过菌落形态特征、生化特性及触酶反应等对10只发情期大熊猫阴道乳酸菌进行分离鉴定,获得42株乳酸菌,经产过氧化氢半定量试验筛选出18株产H_2O_2的乳酸菌。将18株乳酸菌通过16S r DNA测序并进行NCBI Blast分析,鉴定出粪肠球菌(Enterococcus faecalis)12株、泰国肠球菌(Enterococcus thailandicus)2株、屎肠球菌(Enterococcus faecium)1株、耐久肠球菌(Enterococcus durans)1株、海氏肠球菌(Enterococcus hirae)1株、巴氏链球菌(Streptococcus pasteurianus)1株。用Neighbor-Joining Tree方法构建的系统进化树表明,这18株乳酸菌的16S r DNA以100%的相似性聚在同一个分支上。上述结果为进一步研究大熊猫阴道益生菌奠定了基础。     

大熊猫被毛可培养真菌的分离鉴定与系统发育学分析

为了掌握大熊猫体表被毛可培养真菌的分类情况,采用常规分离培养方法从不同月份(3、6、9、12月份)的大熊猫体表被毛中分离到165株真菌。通过形态学鉴定,用真菌通用引物ITS1和ITS4进行PCR鉴定,并进行系统发育学分析。结果,利用ITS区序列进行的PCR鉴定可将大多数真菌鉴定到种,部分真菌只能被鉴定到属。本次试验共分离鉴定出165株真菌,其中毛孢子菌属(Trichosporon sp.)是本次试验中的优势种群,其菌株数最多,占29%;指间毛癣菌(Trichophyton interdigitale)、蒙氏毛孢子菌(Trichosporon moniliiforme)、杂色曲霉(Aspergillus versicolor)、蜡蚧霉(Lecanicillium lecanii)等是本次试验的优势菌种。9月份样本分离得到的菌株数量最多,为50株,且包含种类最多,具有丰富的微生物多样性。3、6、12月份样本分离得到的菌株数量分别为38、38、39株。本研究结果极大地丰富了对大熊猫被毛可培养真菌种群的认识,将为大熊猫皮肤病的诊治提供参考。     

粪肠球菌PCR检测方法的建立

为建立一种基于细菌16 S rDNA的粪肠球菌PCR检测方法,用于检测临床样本和鉴定分离纯化的细菌,通过比较肠球菌间16 S rDNA的差异,设计了1对特异性引物,并对PCR反应条件进行了优化,对PCR的特异性和敏感性进行了检测。结果显示,粪肠球菌ATCC29212及42个鉴定阳性的临床分离株为PCR阳性,检测结果与16 S rDNA测序的鉴定结果一致,其他种属的4株菌为PCR阴性,所得扩增条带单一且与预期的产物大小一致,测序表明该条带为目的条带;该方法的最小检出量为134 CFU,并能直接对病料进行检测。表明所建立的PCR方法能特异地检测粪肠球菌,且敏感、简易、快捷,适用于实验室的日常检测。     

猪源粪肠球菌的BIOLOG系统鉴定及其生物学特性

利用BIOLOG自动微生物分析系统和传统鉴定方法对1株猪源粪肠球菌进行了鉴定,并对其生物学特性进行了系统研究。结果显示,2种鉴定方法的结果一致,与传统的鉴定方法相比,BIOLOG自动微生物分析系统更快捷、方便、高效,可快速为临床诊断和用药提供依据。生物学试验表明,本株粪肠球菌在液体和固体培养基内均可有效抑制大肠杆菌生长,从而维持肠道平衡;另外,该菌株可使培养液的pH值降低至3.69。上述结果为该菌株的进一步开发利用提供了理论支持。     

亚成体大熊猫肠道纤维素降解真菌的分离与鉴定

为分离、鉴定亚成体大熊猫肠道中的纤维素降解真菌,并比较其降解纤维素能力的大小,采用PDA、SDA、GPA这3种培养基对8只亚成体大熊猫新鲜粪便进行真菌的分离培养,经纤维素刚果红培养基筛选,得到纤维素降解真菌,运用形态学和分子生物学的方法对其进行分类鉴定。结果显示,共分离到4株纤维素降解真菌,分别为白地霉、多分枝毛霉菌这2株霉菌和丝孢菌、白色念珠菌这2株酵母菌。根据纤维素水解圈与菌落直径比值、菌落直径大小,初步得出其降解纤维素能力的大小为白地霉多分枝毛霉菌白色念珠菌丝孢菌。结果表明,亚成体大熊猫肠道内存在可降解纤维素的真菌,且2株霉菌的纤维素降解能力比2株酵母菌的强。     

湖南省猪源粪肠球菌毒力基因的检测及部分表型的测定

采用PCR方法对湖南省分离的42株粪肠球菌的8种毒力相关的基因即溶血素基因cylA、明胶酶基因gelE、表面蛋白基因esp、胶原蛋白黏附素基因ace、聚集物质基因asa1、心内膜炎有关的抗原基因efaA以及2个假定毒力相关基因EF3314、EF0591进行了检测,并用平板法测定了这些分离株的溶血性和明胶溶解性。结果显示,24株粪肠球菌分离株普遍存在EF3314基因,检出率为100%;其次是efaA基因,检出率为92.9%;其他毒力基因gelE、ace、asa1、cylA、esp、EF0591的检出率为分别为88.1%、59.5%、52.4%、54.8%、38.1%、4.76%。菌株在绵羊血琼脂平板上以α溶血为主,而在家兔血琼脂平板中以β溶血为主,家兔血琼脂平板溶血的检出率(95.2%)高于绵羊血琼脂平板溶血的检出率(88.1%)。HN45菌株属于cylA基因阳性菌株却表现为不溶血,而19株cylA基因阴性菌株中只有YZ28菌株在家兔血琼脂平板上表现不溶血,HH57菌株在绵羊血琼脂平板上表现不溶血。5株gelE基因阴性分离株只有2株不分解明胶,37株gelE基因阳性分离株中,有32株分解明胶,5株gelE基因阳性菌株不能分解明胶。结果表明,这42株粪肠球菌中每株菌最少携带1个毒力因子基因,有些菌株最多携带7个毒力因子基因;菌株的溶血与明胶溶解的基因型和表现型并非完全一致。     

出壳雏鸡感染病原菌的分析

为探究刚出壳雏鸡感染病原菌的种类,本研究对90只刚出壳的病弱雏鸡进行病理观察;从肝脏等器官分离细菌,提取分离株DNA,进行16S r RNA基因序列的扩增并测序,将测定结果与Gen Bank相应细菌株比对,结合菌落菌体形态进行鉴定。结果显示,病弱雏鸡腹围较大;解剖显示皮下胶冻样,卵黄吸收不良,肝土黄色;显微镜下显示肝充血,脂肪变性。从病弱雏鸡的肝脏分离出菌株56株,分离率为62.2%(56/90)。其中粪肠球菌分离率为46.4%(26/56),大肠杆菌为16.1%(9/56),金色葡萄球菌为14.3%(8/56),奇异变形杆菌为8.9%(5/56),鲍氏不动杆菌为5.3%(3/56),沼泽考克氏菌为3.6%(2/56),柠檬酸细菌属为1.8%(1/56),无色杆菌为1.8%(1/56),地衣芽胞杆菌为1.8%(1/56)。结果提示,刚出壳雏鸡感染的细菌为9种,主要有肠球菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。这为雏鸡细菌感染的防治奠定了基础。     

大熊猫阴道菌群调查

本试验首次对9只大熊猫阴道微生物菌群进行分离鉴定.调查结果显示,大熊猫阴道主要细菌为乳杆菌(Lac tobacillius)、消化链球菌(Peptostreptococcs)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)及表皮葡萄球菌(Stapholococcus epidermidis),其中优势菌为乳杆菌;并从其中4只大熊猫阴道分离出1株白地霉菌(Geotrichum candiolum).     

断奶仔猪胃肠道乳酸菌及芽孢杆菌的分离鉴定

为研制优良的猪用益生菌制剂,从断奶仔猪胃肠道分离乳酸菌和芽孢杆菌,结合细菌的形态特征、生理生化指标,运用16SrRNA基因序列分析方法对其进行了鉴定。结果表明,分离株WR、KR、HR、JR分别为胃、空肠、回肠、结肠源的唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius);ZR株为直肠源的约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii);MR株为盲肠源的粪肠球菌(Enterococcus faecalis);分离株WY、SY、KY分别为胃、十二指肠、空肠源的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis);HY株为回肠源的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cere-us)。各分离株的生长曲线有明显差异,HR、ZR和WY株的生长速度较快,分别于接种后第12、12和20小时达到生长高峰期,显示了良好的培养特性。     

产后奶牛子宫黏液中微生物的分离鉴定及与黏液性状的关系

选择产后荷斯坦奶牛18头,以产后第21天的黏液性状评分和中性粒细胞计数为基础,将其分为健康组9头,亚临床子宫内膜炎组3头和临床子宫内膜炎组6头。通过对黏液中细菌的分离培养和测序,检测产后奶牛不同时间、不同子宫状态下子宫黏液中细菌的种类和数量,并分析了细菌种类、数量与产后时间及黏液性状的关系。试验表明,在健康组和患病组奶牛子宫内共分离到407株纯菌,经测序后发现其分别属于变形菌门、厚壁菌门、放线菌门的25种细菌,其中大肠杆菌、芽胞杆菌、葡萄球菌和希瓦菌的分离率较高,分别为44.14%、19.31%、6.21%和4.83%;蜡样芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌等只出现在健康牛子宫,克雷伯菌、不动杆菌、志贺菌、肾棒状杆菌、绵羊创伤球菌只出现在患子宫内膜炎的奶牛子宫。黏稠且不透明黏液中的分离菌数为98株,显著多于分离菌为37株的半透明、白色脓性黏液及分离菌为10株的透明、偶带白丝的黏液;其中产后第35天菌株分离数量和黏稠黏液数量最多,在黏稠型黏液中共分离出41株纯菌,占细菌分离总数的74.56%,绵羊创伤球菌、志贺菌、表皮葡萄球菌、不动杆菌等只从黏稠型黏液中分离到;产后第49~56天,细菌分离数量及黏稠型黏液数量较产后第35天逐渐减少。结果表明,大肠杆菌是感染产后奶牛子宫的主要微生物,奶牛产后子宫感染细菌数量越多黏液脓性越高,并且奶牛产生子宫内膜炎及脓性黏液可能与不动杆菌、绵羊创伤球菌、志贺菌等病原菌感染有关。     

野生动物园不同源性VRE耐药性及REP-PCR分型研究

为了解福州市野生动物园内不同源性耐万古霉素肠球菌的耐药现状及亲缘情况,进而指导兽医临床合理用药,并对控制耐药性传播提供理论依据。用微量肉汤法对6种抗生素进行药敏试验,PCR法检测VanA、VanB、VanC1和VanC2/C3基因,并采用重复基因外回文序列PCR分析技术(REP-PCR),对分离自不同源性的耐万古霉素肠球菌进行基因多样性研究,比较菌株之间的亲缘关系。结果显示,福州市动物园内不同源性肠球菌分离到VRE共41株,耐药率高达100%,其中红霉素(100%)、土霉素(97.58%)和氯霉素(86.67%)耐药率最高;氨苄西林和万古霉素敏感率分别为92.12%和84.85%;万古霉素相关耐药基因VanA检出率为4.88%,VanB基因检出率为17.07%,VanC1基因检出率为31.71%,VanC2/C3基因检出率为39.02%;REP-PCR分型结果显示,不同来源的耐万古霉素肠球菌菌株大致可分为2~3个型,其中,分离自动物园环境的H2和H3、H1、H8和H9及分离自动物园不同动物的M9和NL6、MH5和MH8、M3、BM3和L6具有100%同源性。结果表明,动物园内肠球菌整体耐药情况较严重,耐药基因VanA、VanB、VanC1和VanC2/C3基因与多重耐药具有相关性;动物源性、环境源性和人员性VRE之间发现同源性100%的菌株,可能存在同一菌株的垂直克隆传播,不同源性VRE之间存在一定的流行病学相关性。     

山羊源志贺菌的分离鉴定及其部分生物学特性的研究

对采集自四川部分地区的226份羔羊粪便样本进行志贺菌的分离鉴定,同时对分离菌株进行血清型鉴定,并用PCR检测其携带sat、sen、set A、pic、sig A、ics P、ial、ics A、iut A、ipa H共10个毒力基因的情况;采用灌胃法检测携带毒力基因最多的4株优势血清型菌株培养物对BALB/c小鼠的致病力。经细菌分离鉴定,从226份样本中共分离到54株志贺菌;血清型鉴定结果显示,4株的血清型为福氏志贺菌1a型,11株的血清型为福氏志贺菌1b型,28株的血清型为福氏志贺菌2b型,11株的血清型为福氏志贺菌3b型。54株志贺菌均携带sat、sen、ipa H基因,而set A、pic、sig A、ics P、ial、ics A、iut A基因的阳性携带率分别为73.6%、65.2%、77.8%、82.0%、79.1%、79.1%,每个菌株携带4~10种毒力基因。携带10个毒力基因的4株福氏志贺菌2b型优势血清型菌株均在1.7×108CFU/m L剂量下致死全部试验小鼠,其中福氏志贺菌SWUN553对BALB/c小鼠的LD50为1.04×106CFU;致死小鼠的组织病理学检查显示,心、肝、脾、肺、结肠出现明显的坏死与炎性细胞浸润等病变,提示结肠为该菌入侵的最有可能部位。本研究阐明了山羊源志贺菌的部分生物学特性,为山羊志贺菌病的防控提供了科学依据。     

猪和野生动物源大肠杆菌及沙门菌中磺胺类药物耐药基因的检测

对从四川省10个规模化猪场和16种野生动物的粪样中分离鉴定出的67株大肠杆菌、57株沙门菌进行了药敏试验。结果,猪源和野生动物源分离菌对磺胺类药物的耐药率分别为72.0%(72/100)和29.2%(7/24)。根据GenBank中登录的序列,设计了3对特异性引物,对磺胺类药物的耐药基因Sul1、Sul2、Sul3进行了三重PCR检测。在这124株细菌中,Sul1基因的检出率最高,为47.6%(59/124),Sul2基因的检出率为17.7%(22/124),Sul3基因的检出率为18.5%(23/124)。药敏试验结果与基因检测结果的符合率为89.9%。     

大熊猫源石膏样小孢子菌的分离鉴定与致病性研究

为了研究大熊猫皮肤病的病因及有效防治该病,对患皮肤病的大熊猫病变部位的皮屑进行了真菌学检查与分离,并对分离菌进行了形态学特征鉴定、ITS序列分析以及小鼠的致病性试验。结果分离到的真菌为石膏样小孢子菌(编号为MXP-13-11-1)。分离株MXP-13-11-1的ITS序列的长度为573bp,该片段包括ITS1、5.8SrDNA和ITS2的全部序列以及18SrDNA和28SrDNA的部分序列。BLAST序列比对结果显示,MXP-13-11-1与编号GU348990.1的石膏样小孢子菌的核苷酸序列的相似性为99%。根据形态学鉴定、BLAST比对结果和构建的系统进化树可以将分离株MXP-13-11-1鉴定为石膏样小孢子菌。小鼠致病性试验结果显示,该菌对皮肤致病性强。     

屎肠球菌携带毒力基因及其耐药性检测

为探究屎肠球菌携带毒力基因及耐药性相关基因,本研究采用PCR方法对不同来源的41株屎肠球菌中携带10种毒力基因、万古霉素耐药基因和四环素耐药基因进行检测,并应用K-B纸片法分析屎肠球菌对9种抗生素的敏感性。结果表明,在41株屎肠球菌中检测3种毒力基因gel E、efaAfs和ccf的阳性率均为100%,其他毒力基因的阳性率依次为cpd(80.49%)、agg(39.02%)、cylM(4.88%)、cylB(9.76%)、cylA(9.76%)、cob(4.88%)及esp(0);在41株屎肠球菌中,能检测出4种毒力基因的菌株数占46.34%,能检测到5种毒力基因的菌株数占29.27%;41株屎肠球菌对庆大霉素、萘啶酸和卡那霉素的耐药率均为100%,对其他抗生素的耐药率分别为诺氟沙星(31.7%)、四环素(26.83%)、氯霉素(7.31%)、万古霉素和阿莫西林(4.88%)、氨苄西林(0)。通过对不同基质屎肠球菌携带毒力基因和耐药性的检测分析,为今后屎肠球菌毒力基因和耐药性的分子机制研究奠定基础。     

牦牛肠道与粪便乳酸菌的分离鉴定及PCR-16 S rDNA鉴定

以取自四川省不同地区的牦牛粪便、肠道内容物为材料,用MRS琼脂双层培养基进行厌氧培养,分离到50株乳酸菌,经生化鉴定为嗜热链球菌(2株)、乳酸乳球菌(1株)、保加利亚乳杆菌(5株)、嗜粪乳杆菌(10株)、嗜酸乳杆菌(8株)、乳酸乳杆菌(9株)、肠乳杆菌(10株)、弯曲乳杆菌(5株)。采用乳酸菌16 S rDNA通用引物,对分离的8种菌的16 S rDNA一段可变区序列进行扩增,均得到大小约470 bp的产物;扩增产物经纯化、测序后与GenBank中标准菌株的核甘酸序列比较,同源性均大于97．5％,同源性分析与生化试验的结果是一致的。证实,牦牛肠道和粪便的乳酸菌较为丰富,且乳杆菌的数量较多,这可能与牦牛复杂的生长环境有关。     

动物肠道中具有益生特征的抗铅乳酸菌的分离与鉴定

为开发治疗重金属铅中毒的生物制剂,通过平板涂布的方式从猪、马、牛、鸡、犬、鱼等多种畜禽的肠道内容物及排泄物中分离筛选具有耐受重金属铅的乳酸菌,并对分离菌株进行耐受试验、抑菌试验、对铅的吸附试验以及体外抗氧化试验的测定,结合16SrRNA鉴定结果确定菌株的种类。逐级分离筛选出5株耐受重金属铅的乳酸菌,不仅能够耐受2 000mg/L的Pb2+,还可以耐受pH=2盐酸、8g/L胆盐、1g/L胰蛋白酶,并且对铅的吸附率可达到84.23%,同时在体外具有抗氧化能力。通过分离鉴定,得到具有良好耐铅特性的罗伊氏乳杆菌、粪肠球菌、嗜淀粉乳杆菌、乳酸乳球菌,将来可以作为益生菌制剂添加到饲料和食品中,不仅可以抑制其他病原菌的生长,还可以对过量的铅进行高效吸附,为减少动物体内铅的富集和治疗铅引起的中毒提供新的思路。     

粪肠球菌BN6株的体外益生特性评价

为了评价粪肠球菌BN6株的益生潜能,本试验测定了BN6株在低pH值和高胆盐环境的耐受性,对抗生素敏感性以及抑菌、细菌的疏水率、自凝集率和抗氧化性能等特性。结果表明,BN6株在pH=2.5的PBS中耐受3 h的存活率达到97.45%,并且能够耐受0.3%的胆盐环境;BN6株对氨苄西林、万古霉素、红霉素、阿莫西林和氯霉素敏感;BN6株培养上清对大肠埃希氏杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌和普通变形杆菌等肠道致病菌具有良好的抑菌作用;以二甲苯和三氯甲烷为有机相,疏水率分别为47.8%和55.19%,自凝集率为21.57%;BN6株无细胞提取物和菌体DPPH清除率分别为26.83%±4.93%和22.13%±9.43%,无细胞提取物抗脂质过氧化率35.55%±3.28%。结论,粪肠球菌BN6株具有良好的益生特性,可作为候选益生菌进行深入研究。     

发情期大熊猫阴道真菌的分离鉴定及酵母菌药敏试验

为弄清发情期大熊猫阴道内可培养真菌的种类及对药物的敏感性,为大熊猫的生殖道合理用药提供参考,对10只发情大熊猫阴道分泌物进行真菌分离培养、形态学鉴定并用真菌ITS序列通用引物对分离真菌进行PCR扩增、序列测定等;对分离到的5株酵母菌选用5种抗真菌药进行药敏试验。结果,从大熊猫阴道分泌物中共分离到30种真菌,包含25种霉菌和5种酵母菌(链状假丝酵母菌、担子菌类酵母菌、季也蒙毕赤氏酵母菌、汉氏德巴利氏酵母菌、皮状丝孢酵母菌)。5种酵母菌均对两性霉素B、制霉菌素敏感;皮状丝孢酵母菌对酮康唑、伊曲康唑中度敏感;汉氏德巴利氏酵母菌对伊曲康唑中度敏感;链状假丝酵母菌对氟康唑中度敏感,对酮康唑、伊曲康唑耐药。研究结果表明,发情期大熊猫阴道可培养真菌种类主要为霉菌(83.33%),酵母菌较少(16.67%);两性霉素B和制霉菌素是临床治疗由本研究中5种酵母菌引起的大熊猫阴道疾病的首选药物。