发情期大熊猫阴道真菌的分离鉴定及酵母菌药敏试验

为弄清发情期大熊猫阴道内可培养真菌的种类及对药物的敏感性,为大熊猫的生殖道合理用药提供参考,对10只发情大熊猫阴道分泌物进行真菌分离培养、形态学鉴定并用真菌ITS序列通用引物对分离真菌进行PCR扩增、序列测定等;对分离到的5株酵母菌选用5种抗真菌药进行药敏试验。结果,从大熊猫阴道分泌物中共分离到30种真菌,包含25种霉菌和5种酵母菌(链状假丝酵母菌、担子菌类酵母菌、季也蒙毕赤氏酵母菌、汉氏德巴利氏酵母菌、皮状丝孢酵母菌)。5种酵母菌均对两性霉素B、制霉菌素敏感;皮状丝孢酵母菌对酮康唑、伊曲康唑中度敏感;汉氏德巴利氏酵母菌对伊曲康唑中度敏感;链状假丝酵母菌对氟康唑中度敏感,对酮康唑、伊曲康唑耐药。研究结果表明,发情期大熊猫阴道可培养真菌种类主要为霉菌(83.33%),酵母菌较少(16.67%);两性霉素B和制霉菌素是临床治疗由本研究中5种酵母菌引起的大熊猫阴道疾病的首选药物。     

大熊猫被毛可培养真菌的分离鉴定与系统发育学分析

为了掌握大熊猫体表被毛可培养真菌的分类情况,采用常规分离培养方法从不同月份(3、6、9、12月份)的大熊猫体表被毛中分离到165株真菌。通过形态学鉴定,用真菌通用引物ITS1和ITS4进行PCR鉴定,并进行系统发育学分析。结果,利用ITS区序列进行的PCR鉴定可将大多数真菌鉴定到种,部分真菌只能被鉴定到属。本次试验共分离鉴定出165株真菌,其中毛孢子菌属(Trichosporon sp.)是本次试验中的优势种群,其菌株数最多,占29%;指间毛癣菌(Trichophyton interdigitale)、蒙氏毛孢子菌(Trichosporon moniliiforme)、杂色曲霉(Aspergillus versicolor)、蜡蚧霉(Lecanicillium lecanii)等是本次试验的优势菌种。9月份样本分离得到的菌株数量最多,为50株,且包含种类最多,具有丰富的微生物多样性。3、6、12月份样本分离得到的菌株数量分别为38、38、39株。本研究结果极大地丰富了对大熊猫被毛可培养真菌种群的认识,将为大熊猫皮肤病的诊治提供参考。     

大熊猫阴道菌群调查

本试验首次对9只大熊猫阴道微生物菌群进行分离鉴定.调查结果显示,大熊猫阴道主要细菌为乳杆菌(Lac tobacillius)、消化链球菌(Peptostreptococcs)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)及表皮葡萄球菌(Stapholococcus epidermidis),其中优势菌为乳杆菌;并从其中4只大熊猫阴道分离出1株白地霉菌(Geotrichum candiolum).     

1株抗须癣毛癣菌枯草芽孢菌的鉴定

为了探讨抗须癣毛癣菌感染新的治疗途径,从患须癣毛癣菌病兔自然恢复皮肤分离了1株细菌,经16S rDNA基因比对,并结合菌落形态进行了鉴定,通过体内外试验测定其对须癣毛癣菌的拮抗作用。结果显示,分离株能在营养琼脂培养基生长,菌落为皱褶圆形,菌体呈杆状,革兰染色阳性,基因序列分析与GenBank中的枯草芽孢杆菌相似率为99.8%,该分离株被鉴定为枯草芽孢杆菌。抗菌谱分析显示,分离株对须癣毛癣菌能形成抑菌圈,对白色念珠菌、平滑念珠菌、热带念珠菌、烟曲霉菌、黄曲霉菌没有抑制作用。该分离株与须癣毛癣菌混合培养,能明显抑制须癣毛癣菌生长。在皮肤涂抹试验中,该分离株能逆转由须癣毛癣菌引起的皮肤病变。本试验证实了分离的枯草芽孢杆菌对须癣毛癣菌有明显的拮抗作用。     

土壤中食线虫真菌的分离与鉴定

采用线虫诱导培养方法,自甘肃、青海、新疆、陕西、河南等五省(区)采集的234份土壤样品中分离获得了食线虫真菌23株,形态学分类研究表明,它们分属于9属22个种(包括:节丛孢属9个种、隔指孢属2个种、单顶孢属4个种、镰刀菌属2个种、钩丝孢属2个种、轮枝孢属1个种、被孢霉属1个种和茎点霉属1个种)和1株未定种。本研究为开展家畜线虫病的生物防治研究奠定了基础。     

兔万博节皮菌的分离鉴定

利用r DNA ITS序列分析,结合真菌形态学对兔的病原菌进行了鉴定。采集疑似患皮肤真菌兔的皮屑、结痂和被毛等病料,在沙保弱培养基分离培养;用分离菌株进行动物回归试验;提取分离菌株DNA,采用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增,扩增产物测序后在Gen Bank核酸数据库中进行同源性比对。结果显示,共分离出29株真菌,其菌落为颗粒状、背面有褐色色素沉着;显微镜下小分生孢子为葡萄状,大分生孢子为棒状,菌丝为螺旋状;病理组织切片显示,病变部位皮肤充血、毛囊内有孢子样菌丝段;r DNA序列比对结果显示,分离菌株与须癣毛癣菌复合体的万博节皮菌有98.6%~95.0%的同源性。根据ITS区序列比对结果,结合菌落的形态学特征和兔皮肤病理变化,证明所分离的菌株为万博节皮菌。     

大熊猫源肠球菌分布特点的研究

采用全自动微生物分析系统VITEK 2-COMPACT,结合16SrDNA分子鉴定以及菌落形态特征分别对野生、野化和圈养环境下大熊猫源肠球菌进行鉴定,共计分离鉴定得到11种肠球菌,共计381株。野生大熊猫样品中分离得到10种肠球菌,共103株,占27.03%;圈养大熊猫样品中分离得到8种肠球菌,共149株,占39.11%;野化放归前大熊猫样品分离得到6种肠球菌,放归后增加到9种,共129株,占33.86%。粪肠球菌、小肠肠球菌、坚韧肠球菌和屎肠球菌是野化和圈养大熊猫肠球菌的优势菌,粪肠球菌、鹑鸡肠球菌、鸟肠球菌和棉子糖肠球菌为野生大熊猫肠球菌的优势菌。野化大熊猫源肠球菌的种类介于野生大熊猫和圈养大熊猫之间,野化放归后,大熊猫粪便中肠球菌的种类增加,各类肠球菌所占比例更均衡,有利于放归大熊猫快速适应野外生存环境。     

国产盐霉素生产菌株——白色链霉菌_(61477)的诱变育种试验

笔者与合作者共同分离到一株放线菌,经分类学鉴定,确认为白色链霉菌的一个新变种,命名为白色链霉菌疣孢变种(代号为白色链霉菌_(61477))(曹廷弼等,1982)。该菌的代谢产物,经理化鉴定,与日本报道的盐霉素同质(王炳佑等,1982);并经临床试验确证,对各种鸡球虫病均具有较好的防治作用。故认为系日本盐霉素的同类物,命名为国产盐霉素。为了提高该分离菌的发酵效价,我们在过去工作的基础上,从诱变育种方面进行了研究,初步达到了提高效价的预期目的,经筛选出的突变菌株氯—Ⅳ的效价,平均为22375U/ml,最高可达30917U/ml。     

奇妙节丛孢的分离及对捻转血矛线虫幼虫和秀丽隐杆线虫捕食过程的观察

本研究从牛羊放牧草地土壤、粪堆、厩舍土壤及林地土壤中分离捕食线虫性真菌奇妙节丛孢菌(Arthrobotrys thaumasia),并进一步了解分离株对线虫的捕食过程。首先,使用诱饵平板技术分离奇妙节丛孢菌;然后,借助扫描电镜对NBS005分离株与绵羊捻转血矛线虫的幼虫及自由生活线虫秀丽隐杆线虫的捕杀动态学及相互作用进行观察。结果显示,在1 532份与牛羊相关的样品中分离出11株奇妙节丛孢菌,检出率为0.71%(11/1 532)。扫描电镜观察显示,加入试验线虫后第6小时,该菌产生捕食结构并开始捕捉试验线虫。其中,二期幼虫(L2)于捕捉后第8小时被真菌刺入角质层,第30小时虫体明显皱缩,提示虫体正处于消化过程,第78小时虫体被消化完全;第三期的感染性幼虫(L3)于捕捉后第12小时被真菌穿透,第42小时虫体表面皱缩,第84小时虫体消化完全;秀丽隐杆线虫于捕捉后第7小时被真菌刺入并明显皱缩,第12小时虫体严重皱缩,第18小时消化完全。以上结果表明,本研究中所分离的真菌属于奇妙节丛孢菌,该菌捕捉以上三种类型的线虫后,真菌对线虫捕食作用的时间随着线虫类型不同而有差异。     

关于国际标准菌株MGS_6株的探讨

鸡败血性霉形体(MG)国际标准菌株MGS_6株,是我国各生物药品厂制备MG抗原和高免血清的标准菌株,现已大量使用。有个问题值得注意,特提出讨论。 S_6菌株进行平板培养时,基本上可见到四种菌落:小脐型,大脐型,小无脐型,大无脐型。当用此菌株对雏鸡进行人工感染,可见到临床症状;并且于第10天到30天皆可分离到本菌,其菌落特征皆为小脐型(脐直径小于菌落直径二分之一);挑选抗原菌种时,选取小脐型菌落纯化亦可得到吸附鸡红血球能力极强与标     

耕牛“烂蹄病”病因学调查——几种镰刀菌代谢产物的毒性实验

此项研究对几种镰刀菌代谢产物的毒性进行了研究:其结果:①从“烂蹄病”病区采取52份耕牛饲草,共检出真菌3197株,主要是曲霉属、镰刀菌属、青霉属、芽枝孢霉属和交链孢霉属等。其中镰刀菌(拟枝孢镰刀菌、半裸镰刀菌和木贼镰刀菌)的污染率与“烂蹄病”发生呈正相关;②从“烂蹄病”病区耕牛饲草上分离的10种53株镰刀菌的玉米培养物用乙醚提取,其中30份提取物使兔的皮肤出现反应。拟枝孢镰刀菌和半裸镰刀菌的玉米培养物及其乙醚、甲醇-水(95 5)提取物引起大白鼠和小白鼠中毒死亡。用其乙醚粗毒素腹腔注射两只健康杂交公山羊,出现了典型“烂蹄病”病征。     

大熊猫源石膏样小孢子菌的分离鉴定与致病性研究

为了研究大熊猫皮肤病的病因及有效防治该病,对患皮肤病的大熊猫病变部位的皮屑进行了真菌学检查与分离,并对分离菌进行了形态学特征鉴定、ITS序列分析以及小鼠的致病性试验。结果分离到的真菌为石膏样小孢子菌(编号为MXP-13-11-1)。分离株MXP-13-11-1的ITS序列的长度为573bp,该片段包括ITS1、5.8SrDNA和ITS2的全部序列以及18SrDNA和28SrDNA的部分序列。BLAST序列比对结果显示,MXP-13-11-1与编号GU348990.1的石膏样小孢子菌的核苷酸序列的相似性为99%。根据形态学鉴定、BLAST比对结果和构建的系统进化树可以将分离株MXP-13-11-1鉴定为石膏样小孢子菌。小鼠致病性试验结果显示,该菌对皮肤致病性强。     

四川家兔源万博节皮菌的分离鉴定及其致病性研究

为了有效防治家兔的真菌性皮肤病,对发生皮癣病家兔患部的皮屑、被毛采用沙保弱氏培养法(Sabourord cultivation)进行了分离纯化。对分离株进行了形态学鉴定、ITS序列分析和小鼠致病性试验。结果,分离到1株真菌(编号MXP-15-12-21)。分离株的ITS序列长度为669 bp,该片段包括ITS1、5.8S r DNA和ITS2的全部序列以及18S r DNA和28S r DNA的部分序列。NCBI Blast比对结果显示,分离株的ITS序列与须癣毛癣菌的有性型万博节皮菌(EU683894.1)的相似性为99%。根据形态学特征、ITS序列分析结果和构建的系统发育树可以将分离株鉴定为万博节皮菌。动物试验结果表明,该菌对小鼠皮肤有较强的致病性。     

肉鸡白色念珠菌的分离鉴定与基因分型

从病鸡嗉囊分离出3株酵母状真菌;在不同培养条件下观察分离菌株的菌落与个体形态特征;用分离菌株BCA1在雏鸡上进行人工感染试验;对原分离菌株和再分离菌株BCA1-1用rDNA-ITS序列分析鉴定,并以其25SrDNAⅠ型内含子序列进行基因分型。结果显示,3个分离菌株均为白色念珠菌,归属于2个基因型,BCA2株属于A型,BCA1和BCA3株的扩增产物包括C型的2条带和介于其间的第3条带。在人工感染试验中,雏鸡发病率为88%,病死率为68%,症状与临床自然发病的相一致;再分离菌株BCA1-1与接种菌株BCA1相同。可见,导致该批肉鸡发病的病原确系白色念珠菌,3个分离株中的2株不同于已知的基因型。     

家兔须癣毛癣菌SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

为建立家兔须癣毛癣菌快速检测方法,根据GenBank上已发表的须癣毛癣菌rDNA内转录间隔区核苷酸序列设计了1对特异性引物,建立了检测须癣毛癣菌SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,并用该方法对临床分离的须癣毛癣菌和病料进行检测。结果显示,该方法灵敏度高,对须癣毛癣菌的最低检出量为10copies/μL;特异性强,与犬小孢子菌、絮状表皮癣、红毛癣菌、白色念珠菌、烟曲霉等病原真菌没有交叉反应。该方法操作简单,耗时短,只需2h即可完成整个试验过程。提示该方法可用于须癣毛癣菌的检测。     

牦牛肠道与粪便乳酸菌的分离鉴定及PCR-16 S rDNA鉴定

以取自四川省不同地区的牦牛粪便、肠道内容物为材料,用MRS琼脂双层培养基进行厌氧培养,分离到50株乳酸菌,经生化鉴定为嗜热链球菌(2株)、乳酸乳球菌(1株)、保加利亚乳杆菌(5株)、嗜粪乳杆菌(10株)、嗜酸乳杆菌(8株)、乳酸乳杆菌(9株)、肠乳杆菌(10株)、弯曲乳杆菌(5株)。采用乳酸菌16 S rDNA通用引物,对分离的8种菌的16 S rDNA一段可变区序列进行扩增,均得到大小约470 bp的产物;扩增产物经纯化、测序后与GenBank中标准菌株的核甘酸序列比较,同源性均大于97．5％,同源性分析与生化试验的结果是一致的。证实,牦牛肠道和粪便的乳酸菌较为丰富,且乳杆菌的数量较多,这可能与牦牛复杂的生长环境有关。     

水牛赤霉菌中毒病例报告

赤霉菌中毒是由产生F—2雌性发情毒素(或称玉米赤霉烯酮)的一类镰刀菌,寄生或腐生于玉米和其他禾本科作物茎叶、种子以及贮藏饲料中,在适宜的湿度和温度条件下,产生毒素被动物采食而发生中毒。目前关于猪的赤霉菌中毒已有不少报道,但国内引起耕牛中毒则甚少见。 1977年冬我们在进行耕牛“蹄腿肿烂病”的调查中,发现牛饲喂霉稻草后,除普遍发生“蹄腿肿烂病”外,还曾见到不少水牛发生一种不明原因的外阴异常肿大的病例。为此,用霉稻草中分离的镰刀菌制备霉玉米菌饲料,进行牛的饲喂试验,结果复制出水牛赤霉菌中毒的典型病例,并作了临床观察和病因分析,现报告如下: (一)复制试验与临床观察 将霉稻草中分离的禾谷镰刀菌(以下简称F)、串珠F、燕麦F、茄病F、烟草F及尖孢镰刀菌,接种玉米粉培养基中,置22～28℃培养7～10天,再转入2～15℃培养20～40天,收贮。     

青海高原产纤维素酶菌的选育

从 11株分离自青海省东部森林的产纤维素酶真菌中 ,筛选出产纤维素酶性能优良的0 14 3菌株 ,根据其形态学特征及培养特性 ,鉴定为康氏木霉 (Trichodermakoningii ) ,该菌湿固体发酵物的滤纸酶活力 (FPA)为 15 μmol/min。 0 14 3菌株经亚硝基胍诱变后 ,获得突变株 0 14 3p ,其湿固体发酵物FPA为 2 0 μmol/min ,是原菌株的 1.33倍。该菌无毒副作用 ,可应用于饲料中 ,作为饲料用酶源菌。     

乳孕生菌种的保存期及使用剂型

乳孕生(Lactobiogen)是一种活菌制剂,其菌种是由健康母牛阴道分离的一株产酸能力强的正常菌,属乳杆菌属。现将该菌的驯化和制作过程报告如下。 (一)乳孕生菌种的驯化 刚从阴道中分离出的菌种需在微需氧条件下才能生长。本试验是在直径18厘米的干燥器内点燃蜡烛,造成微氧环境,进行培养。所用培养基为MRS培养基,培养温度37℃。经分离培养的菌种在固体斜面中只存活5～7天。因此,为了用于治疗试验,需进行驯化。驯化方法:每5天传代一次,微需氧培养和一般有氧培养交替进行。交     

绵羊源荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及其生物学特性研究

为明确从新疆某绵羊养殖场送检的病死羊的致病菌,对病死羊的心脏、肝和肺组织采用细菌分离培养、形态观察、生化试验,纯化菌落进行种特异性和荚膜血清型PCR鉴定以及药敏试验、致病性试验和动物回归试验。为了解分离菌株的生物学特性及免疫原性,笔者以BALB/c小鼠为动物模型对分离株进行同源性和异源性的免疫攻毒保护试验。结果显示,在BHI琼脂培养基上长出灰色、光滑小菌落,革兰氏染色为红色的小短杆菌;分离株能发酵葡萄糖等,符合多杀性巴氏杆菌（Pm）的生化特性;PCR扩增出大小为460 bp的种特异性条带和1045 bp的荚膜血清A型特异性条带,Blast检索结果与Pm的同源性为99.7%。结果表明,分离菌为多杀性巴氏杆菌,属于荚膜血清A型。药敏试验显示,该菌株对头孢拉定、环丙沙星、替米考星等7种药物具有敏感性;该菌株能够引起实验小鼠和兔的发病死亡,根据羔羊的发病情况和临床检查表明,本菌为强致病性菌株;将分离株培养物研制成不同佐剂的灭活疫苗探究其免疫效果,氢氧化铝佐剂灭活疫苗可以抵抗同源菌的攻击,保护率能够达到100%;对异源血清型Pm免疫攻毒保护效果差,对D型、F型和未知型的保护率分别为20%、20%、0。本研究成功分离出1株绵羊A型多杀性巴氏杆菌,对羊巴氏杆菌病的流行监测和防控具有重要意义。