应用三重聚合酶链反应同时检测鉴别鸡3种病毒性呼吸道传染病的研究

根据鸡新城疫病毒(NDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)和鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)的基因文库,设计了3对分别与NDV、IBV和ILTV某段基因序列互补的引物.用这3对引物对同一样品中的NDV、IBV、ILTV核酸模板进行三重PCR扩增,结果均同时得到了3条与设计相符的310 bp(NDV)、1720 bp(IBV)和647 bp(ILTV)三重PCR扩增带,而对其他6种禽病病原的PCR扩增结果均为阴性;敏感性测定结果表明,该三重PCR技术能检出10pg的IBV、1pg的NDV RNA模板和10 pg的ILTV DNA模板.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒和日本脑炎病毒二联基因芯片的构建与应用

针对靶基因库中猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的重组质粒T/PRRS-PS9、T/Y11和日本脑炎病毒(JEV)的重组质粒T/PRM/M、T/JEV-C,设计4对特异性引物,采用PCR扩增获得4个靶基因片段,并用PCR标记Cy3探针,建立了一种检测PRRSV和JEV的芯片方法。特异性试验结果显示,PRRSV、JEV之间无交叉杂交,猪瘟病毒、猪细小病毒、伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒与PRRSV-JEV基因芯片无杂交反应。灵敏性试验结果显示,50μL杂交体系中探针DNA的质量浓度为0.295pg/μL时仍为杂交阳性。对从猪场收集的31份样品进行处理并用基因芯片检测,PRRSV的检出率为12.9%(4/31),JEV的检出率为9.68%(3/31),PRRSV与JEV混合感染的检出率为0(0/31)。此方法的结果与PCR的检测结果完全符合。结果表明,所建立的二联基因芯片有望成为一种快速鉴别PRRSV与JEV的新方法。     

7种动物冠状病毒基因芯片同步检测的研究

根据发布的7种动物冠状病毒相关基因的序列,给每种病毒设计了4~17对引物,同时依据RNA聚合酶基因序列合成了1对兼并引物,利用TCV原毒和纯化浓缩的CCV、FCV、FIPV、TGEV、PRCV、BCV细胞毒,构建了89个基因片段的克隆。采用煮沸裂解法制备质粒DNA,进行特异引物PCR扩增,回收纯化产物,点制冠状病毒基因芯片。抽提病毒总RNA,利用Cy3-dCTP随机渗入反转录PCR标记,同时对BCV、CCV利用Cy3-dCTP随机渗入反转录标记,与芯片进行杂交检测。结果显示,BCV和TCV基因克隆间未见交叉,CCV、FCV、FIPV、TGEV、PRCV则存在广泛交叉。选择无交叉的特异克隆片段点制最终基因芯片,并与病毒多重PCR扩增产物杂交,芯片信号未见交叉,结果判断明确。表明,基因芯片检测法比传统PCR法敏感1 000倍。     

禽流感病毒等RNA病毒鉴别基因芯片的制备

将克隆和鉴定的AIV的HA、NA、M、NS、NP基因以及NDV、IBDV,IBV的保守基因片段作为探针,同时以克隆的GAPDH基因作为阳性对照,利用芯片点样系统spotArray<'TM>24将探针与阳性对照、阴性对照和空白对照按照设计好的阵列点在基片上,制备了AIV等RNA病毒诊断芯片,并从点样条件和杂交条件两个方面进行了优化.结果显示,探针浓度在300～1 200 μg/mL时点样,Cy3-dUTP终浓度为0.05μmol/mL,杂交温度在42℃,杂交时间在8～12 h时,杂交信号比较理想.该方法对20份已鉴定的H5N1亚型禽流感病毒的检出率为100%(20/20);10份现地送检的疑似AIV样品的检出率为70%(7/10),检测结果与RT-PCR和鸡胚传代分离鉴定的符合率为100%.结果表明,制备的DNA芯片可有效诊断上述病毒.     

鸡传染性喉气管炎病毒TK基因的克隆与鉴定

根据鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)TK基因的核苷酸序列,设计并合成了1对引物,利用该对引物扩增出了长1800bp的TK基因核苷酸片段.将该基因克隆入PGEM-T载体后,对其进行酶切分析和序列测定.结果表明,扩增片段与发表的ILTV的TK基因核苷酸序列一致.以ILTV、正常绒毛尿囊膜组织、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、鸡新城疫病毒(NDV)感染鸡胚的尿囊膜DNA为模板进行PCR反应,结果该PCR反应体系对ILTV是特异的.敏感性试验表明,该PCR系统能检出50 pg的ILTV感染尿囊膜的DNA.     

五种重要猪病病毒基因芯片探针的建立及其应用

将猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病痛毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)的特异cDNA片段作为探针点制于氨基修饰的玻片上,以这5种细胞毒的核酸作为模板,进行不对称PCR扩增,制备靶物,经绿色荧光染料Cy3标记后,分别与cDNA微阵列的芯片探针进行杂交,杂交信号经Genepix 4000A扫描仪扫描.结果显示,该芯片探针可以特异地与Cy3标记的这5种靶物结合.用该基因芯片对100份现地采集的猪全血样品进行检测,检出PRRSV阳性样品26份,PCV-2阳性样品47份,PRRSV和PCV-2混合感染阳性样品17份,PPV阳性样品5份,PRV阳性样品2份,CSFV阳性样品20份.表明,本试验研制的cDNA芯片探针可以特异地检测这5种猪病病毒,具有良好的诊断应用前景.     

鸡传染性支气管炎病毒real-time PCR检测方法的建立

针对鸡传染性支气管炎病毒(IBV)N基因片段设计并合成了1对引物,将构建的重组质粒作为阳性标准品,成功建立了检测IBV核酸的SYBR GreenⅠreal-time PCR检测方法。结果显示,该方法的线性关系好,标准曲线的相关系数达0.998 3;最低可以检测到1×101 copies/μL的核酸模板;与常见禽源病毒新城疫病毒、传染性喉气管炎病毒、传染性法氏囊炎病毒、马立克氏病病毒均不发生交叉反应,重复性试验的变异系数小于3%。应用建立的方法对人工感染IBV的20只试验鸡的40份气管和肾样品中的病毒核酸进行检测,结果显示,攻毒后第5和第7天肾中病毒含量高于气管,证实了临床表现与病毒载量之间的关系。结果表明,建立的real-time PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可以用于IBV的病原检测及定量分析。     

二温式多重PCR同时检测鸡的6种呼吸道病病原方法的建立

设计了 6对分别针对鸡传染性支气管炎病毒 (IBV )、禽流感病毒 (AIV)、鸡毒霉形体 (MG )、鸡传染性喉气管炎病毒 (ILTV )、新城疫病毒 (NDV)和滑液霉形体 (MS)的特异性引物 ,根据反转录聚合酶链反应 (RT PCR)原理和多重PCR原则 ,优化建立了一次PCR反应同时检测 6种禽呼吸道病原的二温式多重PCR。该方法可同时扩增出 6条区段大小与设计相符的特异性片段 ,即IBV 172 0bp、AIV 10 5 0bp、MG 73 2bp、ILTV 64 7bp、NDV 3 10bp、MS 2 0 7bp ,对人工感染鸡临床样品检测结果证明 ,该方法可用于临床诊断。     

五种禽呼吸道病病原多重PCR检测方法的建立和应用

根据GenBank中禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)和鸡毒支原体(MG)的基因序列,设计了5对特异性引物,建立了分别针对鸡AIV、NDV、IBV、ILTV和MG的多重PCR鉴别诊断方法,并进行了退火温度、引物浓度和TaqDNA聚合酶浓度的优化,以及特异性、敏感性试验和临床应用。结果表明,设计的5对引物对同一样品中的RNA(AIV、NDV、IBV)和DNA(ILTV、MG)进行多重PCR扩增,均同时得到5条片段大小与设计相符的特异性片段,即268bp(AIV)、321bp(NDV)、457bp(IBV)、662bp(ILTV)和732bp(MG);建立的多重PCR方法具有较强的特异性和较高敏感性,能检测出1pgAIV、1pgNDV、10pgIBV的RNA和1pgILTV、10pgMG的DNA。对鸡临床样品的检测结果证明,该方法在临床诊断方面具有广阔的应用前景。     

采用二温式聚合酶链反应扩增鸡喉气管炎病毒TK基因的研究

建立了检测鸡喉气管炎病毒(ILTV)的二温式聚合酶链反应(二温式PCR),根据已报道的ILTV TK基因的序列,设计并合成了1对引物,用二温式PCR对5株不同ILTV DNA进行扩增.该对引物对5株ILTV DNA均扩增出与预期大小相一致的647 bp的扩增产物,而对新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、禽呼肠孤病毒(ARV)、禽沙门氏菌、鸡毒霉形体和禽巴氏杆菌等6种禽病病原体的扩增,结果全部为阴性.该二温式PCR可检测到1fg的ILTVDNA模板,其敏感性比常规三温式PCR高1万倍.     

二温式多重PCR同时检测鸡的6种呼吸道病病原方法建立

设计了6对分别针对鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、禽流感病毒(AIV)、鸡毒霉形体(MG)、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)、新城疫病毒(NDV)和滑液霉形体(MS)的特异性引物,根据反转录聚合酶链反应(RT-PCR)原理和多重PCR原则,优化建立了一次PCR反应同时检测6种禽呼吸道病原的二温式多重PCR.该方法可同时扩增出6条区段大小与设计相符的特异性片段,即IBV 1720 bp、AIV 1050 bp、MG 732 bp、ILTV 647 bp、NDV 310 bp、MS 207 bp,对人工感染鸡临床样品检测结果证明,该方法可用于临床诊断.     

胶体金快速诊断方法对鸡减蛋综合征病毒的检测

选择15 nm的胶体金颗粒作为标记物,制备了鸡减蛋综合征病毒(EDSV)胶体金试纸条。该试纸条能检出浓度约为1.35μg/mL的纯化EDSV,用该试纸条检测135份临床样本,并与HA方法相比较,结果显示,二者的阳性符合率为89.8%。特异性试验结果显示,与鸡新城疫病毒(NDV)、鸡传染性腔上囊病病毒(IBDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)无交叉反应。表明,该试纸条用于检测EDSV具有快速、操作简便、特异性强等优点,可用于大批量抗原样本的检测。     

用于诊断4种猪病毒病的寡核苷酸芯片的研制

制备可同时检测引起集约化养猪业常见4种传染病,病毒(猪流感病毒、口蹄疫病毒、猪伪狂犬病毒、猪蓝耳)的寡核苷酸芯片。根据4种猪疫病病毒特异性基因的保守区域设计合成了60 mer寡核苷酸探针,制备寡核苷酸芯片。采用不对称PCR和间接荧光标记技术进行单链DNA扩增和荧光标记,标记样品与寡核苷酸芯片杂交后,进行芯片清洗、扫描及结果分析。杂交结果显示,4种病毒的寡核苷酸检测探针均特异地与相应的标记样品杂交,芯片上呈现较强的阳性杂交信号,而除阳性质控探针外,阴性对照和空白对照均检测不到荧光信号。证明寡核苷酸芯片适用于快速、准确、高通量地诊断影响集约化养猪业的多种猪疫病病毒。     

几种动物病毒的基因芯片检测技术

分别用水疱性口炎病毒、蓝舌病病毒、口蹄疫病毒、猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒、鹿流行性出血热病毒和赤羽病病毒各一段高度保守的基因片段构建质粒 ,在此基础上制备了芯片探针。提取样品中的核酸 ,经反转录和荧光标记后滴加到芯片上进行特异性杂交 ,对杂交结果扫描检测 ,可同时对上述 7种动物传染病进行快速、准确的诊断 ,此方法敏感性高 ,特异性强 ,适合于大批动物高通量检疫。     

鸡肾型传染性支气管炎病毒的分离及其N基因片段的克隆和测序

通过形态学观察、动物回归试验、鸡胚接种试验、病毒干扰试验以及血凝试验分离鉴定了1株肾型鸡传染性支气管炎病毒(IBV)。在透射电子显微镜下,病毒粒子多呈球形,直径为80~120 nm,有囊膜,表面有冠状突起。鸡胚连续盲传至第 1~2 代,开始出现死亡或出现侏儒胚;分离株可显著干扰NDV在鸡胚中的增殖;病毒尿囊液无凝血活性,但经5 g/L胰蛋白酶处理后,能够凝集10 mL/L的鸡红细胞。利用RT PCR技术对分离株的N基因进行了扩增,经克隆、序列测定和分析比较,证实分离株为肾型IBV,命名为AH3 04株。     

ABC-Dot-ELISA检测鸡传染性支气管炎病毒

建立了ABC-Dot-ELISA检测鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的方法,其最佳反应条件是包被液为0.05 mol/LpH 9.6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(CBS),兔抗IBV IgG的最佳工作浓度为180,抗原的最佳浓度为1800,封闭剂选用0.01 mol/L pH 7.4含30mL/L白明胶的PBS,B-AgG和ABC-HEP的最佳工作浓度为1200.用ABC-Dot-ELISA与琼脂扩散试验(AGP)比较检测255份自然发病鸡和20份人工感染雏鸡的口咽拭子、气管、肺、肾,前者的检出率远高于后者.     

猪传染性胃肠炎病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为了建立一种定量检测猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的实时荧光定量PCR方法,用RT-PCR扩增TGEV的M基因片段,构建含有TGEV M基因片段的重组质粒。用系列稀释后的重组质粒为模板,基于SYBR GreenⅠ来进行检测TGEV的实时荧光定量PCR扩增。结果显示,扩增效率为103.0%,相邻扩增曲线之间间距均匀,所有产物的熔解曲线具有单一整齐的峰,标准曲线具有优良的线性关系,最低可准确检测63copies/μL的核酸模板,重复性试验的变异系数小于3%。用建立的PCR对3种常见猪源RNA病毒的检测结果均为阴性,对65份临床样品的检出率高于常规PCR。结果表明,建立了一种灵敏度高、特异性强、重复性好的检测TGEV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,可用于TGEV的定量检测和猪传染性胃肠炎的早期快速诊断。     

3种基因型鸡传染性支气管炎病毒免疫对tl/CH/LDT3/03株的保护性

以鸡传染性支气管炎病毒(IBV)S1基因比较为基础,分析了IBV tl/CH/LDT3/03型毒株与中国其他流行IBV毒株之间的关系,选择5株代表3种基因型的毒株进行动物免疫攻毒试验,以发病率、死亡率、抗体产生及在不同脏器中的病毒检出率作为指标来评价异种毒株对tl/CH/LDT3/03株的保护性。结果显示,同种致弱毒株对tl/CH/LDT3/03强毒株具有良好的保护性,而异种毒株对tl/CH/LDT3/03强毒株的保护性低。     

鸡肾型传染性支气管炎病毒的分离鉴定

从陕西省榆林市某蛋用种鸡场疑似肾型传染性支气管炎病鸡中分离到了1 株肾型IBV(定名为YL 04),并对分离病毒进行了血凝性、血凝抑制性、致病性、鸡胚矮小化、电镜特征等生物学特性鉴定及S1基因5′端的RT PCR鉴定。结果表明,该分离株经10 g/L胰酶处理后的各代病毒尿囊收集液均可凝集鸡红细胞;标准阳性血清可特异性地抑制其凝集性;可复制出与自然发病相同的病例;病毒传代物有明显的致鸡胚矮小化作用;透射电镜下可见有近似球形、直径100 nm左右的冠状病毒粒子;用RT PCR方法扩增到1 条373 bp的目的片段,其核苷酸序列与IBV CQ/01/2004株序列的同源性达98%。     

金丝桃素体外抗传染性支气管炎病毒的研究

将不同浓度的金丝桃素和鸡传染性支气管炎病毒(IBV)以三种方式加入鸡胚肾细胞(CEK)培养体系中,采用细胞病变效应(CPE)法、MTT法、病毒滴度法、实时荧光定量PCR以及间接免疫荧光技术检测金丝桃素体外抗IBV作用,同时检测其对IBV诱发细胞凋亡的影响。结果显示,金丝桃素在CEK细胞感染IBV前、后及同时加入,都有明显抑制CPE的作用;随着添加药物浓度的增加,CEK细胞活力明显增高,病毒TCID50滴度、病毒核衣壳蛋白RNA相对表达量和CEK细胞中病毒阳性绿色荧光信号显著降低或减少(P0.01),并且呈现明显的剂量依赖性。三种给药方式以药物和病毒互作后同时加入效果最好。IBV可以引起CEK细胞凋亡的发生,添加金丝桃素能够抑制病毒引起的凋亡。上述试验结果表明,金丝桃素具有很好的抗IBV作用,其作用可能是通过抑制感染细胞凋亡产生的,这可能是金丝桃素抗IBV的作用机制之一。