非洲猪瘟病毒p30单克隆抗体的制备和鉴定

p30蛋白是非洲猪瘟病毒(ASFV)的膜蛋白,在病毒感染早期分泌表达,含量丰富且抗原性较高,是重要的病毒早期诊断靶标。本研究以ASFV基因Ⅱ型格鲁吉亚2007株p30基因的质粒为模板扩增p30基因片段,连接至原核表达载体pET-28a,转化到大肠杆菌Rosetta后,经IPTG诱导表达和镍柱纯化;将纯化后的重组p30蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤细胞融合和间接ELISA方法,筛选出了2株能够稳定分泌抗p30蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,并通过制备腹水的方法获得单克隆抗体;最后经Western-blot和IFA试验鉴定,其均能与ASFV感染细胞发生特异性反应。本研究为ASFV感染的诊断和致病机制研究提供了重要材料。     

非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体的制备及阻断ELISA检测方法的建立

为建立一种能检测血清中非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)抗体的阻断ELISA方法,本研究以真核表达后纯化的ASFV p30重组蛋白作为包被抗原,以特异性单抗作为阻断抗体,经条件优化、特异性试验和敏感性试验,建立了一种检测血清中ASFV抗体的阻断ELISA方法.结果 显示,纯化后...     

非洲猪瘟病毒C-type lectin蛋白的原核表达及其免疫特性研究

为了制备非洲猪瘟病毒(ASFV)SY18毒株的C-type lectin蛋白多抗,以基因序列优化的真核质粒为模板,扩增EP153R基因,构建原核表达重组质粒pET-32a-EP153R。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态中,利用IPTG诱导宿主菌表达后,纯化C-type lectin重组蛋白。用纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,制备C-type lectin蛋白多抗,利用Western-blot和间接免疫荧光技术鉴定该抗体的反应性和特异性。结果表明,原核表达重组蛋白C-type lectin经IPTG诱导表达成功,大小约为38 ku,其主要以包涵体形式表达,且能与His标签单抗发生反应,C-type lectin蛋白多抗可特异性识别非洲猪瘟病毒C-type lectin蛋白。本研究为非洲猪瘟血清学检测方法的建立及C-type lectin蛋白生物学功能的探究奠定了基础。     

基于金纳米颗粒标记非洲猪瘟病毒p30蛋白免疫层析检测方法的建立

为建立一种用于非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体的快速检测方法,本研究将特异性高、抗原性强的重组ASFV p30蛋白用金纳米颗粒标记,制成捕获金标抗原;将p30蛋白及其多克隆抗体(ASFV-p30-Ab)包被在硝酸纤维素膜(NC)上,分别作为检测线(T线)和质控线(C线),制备ASFV p30金纳米颗粒免疫层析抗体检测试纸条,并对该方法开展了初步评价。结果表明,该试纸条可在5-10 min完成检测;以健康猪血清、口蹄疫病毒(FMDV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)等阳性血清作为对照,该方法仅特异性的检出ASFV感染的血清阳性样品,与各对照组血清无交叉反应;以进口ASFV抗体ELISA检测试剂盒作为金标准对阴、阳性样品进行对比检验,该试纸条检出的敏感性和特异性分别为92.52%和92.00%,说明本研究制备的ASFV p30抗体金纳米颗粒检测试纸条具有较高的敏感性和特异性,具备操作简便、检测快速和结果判断容易等特点,具有ASF现场检测的实际应用价值。     

IFN-λ1作为乙型脑炎病毒DNA疫苗佐剂的免疫效应研究

为了评估IFN-λ1作为免疫佐剂能否提高乙型脑炎病毒DNA疫苗的免疫效应,利用RT-PCR方法扩增猪源IFN-λ1基因,构建重组真核表达载体pVAX1-IFN-λ1,通过Western-blot和间接免疫荧光试验鉴定免疫效果。结果表明,转染pVAX1-IFN-λ1重组质粒的BHK21细胞能够正确表达IFN-λ1;将重组IFN-λ1与p VAX1-prME DNA疫苗免疫小鼠后,与对照组p VAX1-prME相比,IFN-λ1可以诱导小鼠产生乙型脑炎病毒EⅢ蛋白特异性抗体水平、乙脑病毒特异性中和抗体效价和淋巴细胞增殖水平显著提高。结论,重组猪源IFN-λ1作为乙型脑炎病毒DNA疫苗的分子免疫佐剂能够在小鼠动物模型上提高乙型脑炎病毒DNA疫苗的免疫效应。     

基于非洲猪瘟病毒p72蛋白的阻断ELISA检测方法的建立及初步应用

本研究以真核表达的非洲猪瘟病毒(ASFV)p72蛋白为包被抗原,以抗ASFV p72蛋白的特异性单克隆抗体为检测抗体,经条件优化,建立了特异性检测ASFV抗体的阻断ELISA方法。结果显示,最佳抗原包被量为100 ng/孔,待检血清样本最佳稀释度为1∶2,酶标抗体最佳稀释度为1∶10 000。该阻断ELISA方法的结果判定标准:当血清样品的PI≥41.84%时,判定为阳性;当血清样品的PI41.84%时,判定为阴性。特异性试验结果显示,该方法仅能与非洲猪瘟病毒阳性血清反应,与PRV、PCV2、PRRSV、CSFV和PPV等猪病疫苗毒阳性血清无交叉反应;敏感性试验结果显示,该方法最低能检出1∶128稀释的阳性血清;批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%;与商品化ELISA试剂盒的对比检测结果表明,两种方法的符合率为100%。上述结果表明,本研究建立的基于ASFV p72蛋白的阻断ELISA方法可以应用于ASFV抗体的检测,为ASFV流行病学调查及疫情监测提供了有效的检测手段。     

表达猪瘟病毒E2蛋白重组减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗株的构建及动物免疫试验

为了构建表达猪瘟病毒E2蛋白的口服重组减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗株,亚克隆猪瘟病毒E2基因,将其插入到表达载体pYA3341中,构建了重组质粒pYA3341-E2。将该重组质粒电转入鼠伤寒沙门氏菌疫苗株X4550(缺失asd、cya、crp基因),获得重组疫苗菌株X4550(pYA3341-E2),并对重组菌表达的E2蛋白进行SDS-PAGE和Western-blot分析、测定其在体内外的稳定性、生长曲线、安全性及动物免疫试验。结果显示,重组菌能表达E2蛋白且表达的蛋白能与猪瘟病毒阳性血清特异性结合。在体外营养选择压力下,重组菌株在体外可稳定地携带重组质粒传代繁殖,在体内可稳定地定居于肠系膜淋巴结和脾。小鼠口服试验证实重组菌无毒性,安全可靠。动物免疫试验表明,口服重组菌免疫猪产生了抗E2蛋白抗体。淋巴细胞增殖试验表明,重组菌能诱导机体产生较强的细胞免疫应答。结果表明,成功构建了能稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的口服减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗株,为研究猪瘟口服基因工程疫苗奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒p54蛋白特定抗原表位单克隆抗体的制备

为了制备针对非洲猪瘟病毒p54蛋白已知特定抗原表位的单克隆抗体,采用原核表达的重组蛋白p54免疫小鼠,并制备了原核表达p54蛋白、真核表达p54蛋白以及人工合成特定抗原表位氨基酸多肽A三种筛选抗原,筛选出了1株针对已知抗原位点的杂交瘤细胞株。对其分泌的单克隆抗体进行了亚类及特异性鉴定,并利用ProteOn XPR36大分子相互作用系统分析了该单克隆抗体的亲和性。结果显示,该单克隆抗体属IgG1亚类,特异性强、亲和力高。这为以后的免疫学检测方法的建立奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒K205R蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

将合成的非洲猪瘟病毒K205R基因序列插入p ET-28a(+)表达载体,经IPTG诱导表达p ET-28aK205R重组蛋白。用制备的重组抗原免疫BALB/c小鼠,采用化学融合方法融合、筛选,获得了6A4、7F5和7G3三株抗K205R蛋白的杂交瘤细胞株。经鉴定,这3株单克隆抗体(单抗)的亚类均为Ig G1型;单抗的腹水效价分别为1∶51 200、1∶409 600和1∶102 400。将这3株杂交瘤细胞连续培养20代,在第20代仍有很高的分泌抗体的能力,表明其稳定性较好。Western-blot检测结果表明,这3株单抗与K205R重组蛋白有良好的反应性和特异性。上述结果表明,本研究制备的这3株杂交瘤细胞株能够稳定分泌抗体,分泌的抗体特异性高,为非洲猪瘟诊断技术的研究奠定了基础。     

ASFV毒力蛋白MGF360-9L降解宿主蛋白MATR3促进病毒复制的研究

非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）感染所引起的一种高度致死的传染性疾病。ASFV多基因家族编码的MGF360-9L已被证实是ASFV重要的毒力蛋白,是ASFV逃逸宿主天然免疫应答的关键之一。本实验室的前期研究基础表明,宿主细胞核基质蛋白3(Matrin 3,MATR3)可能是MGF360-9L的相互作用蛋白之一,但这种相互作用未经验证。此外,MGF360-9L和MATR3之间是否存在相互调控,对于病毒复制或宿主免疫有何意义尚不可知。因此,本研究首先通过免疫共沉淀（Co-immunprecipitation,Co-IP）验证MGF360-9L与MATR3的相互作用;通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、蛋白免疫印迹（Western-blot）分析ASFV野生型病毒株（ASFV-WT）、ASFV MGF360-9L缺失毒株（ASFV-ΔMGF360-9L）感染或MGF360-9L过表达对MATR3表达的影响;通过RT-qPCR、Western-blot以及分析ASFV荧光重组毒株复制...     

抗非洲猪瘟病毒药物筛选Cell-ELISA法的建立及应用

为了建立一种抗非洲猪瘟病毒（ASFV）药物高通量筛选（HTS）方法,采用ASFV感染细胞作为包被抗原,以p30单克隆抗体作为检测抗体,通过优化抗体稀释度、孵育时间等试验条件,成功建立了Cell-ELISA方法,并使用该方法对Selleck天然产物库中的1 036个化合物进行了筛选。结果显示,该Cell-ELISA法筛选得到5个具有抗ASFV活性的化合物;当5个化合物浓度为10μmol/L时,PAM细胞存活率均大于80%;进一步分析ASFV p72的转录和翻译水平,结果显示,ASFV在经化合物处理的PAM上被显著抑制,确保了Cell-ELISA筛选结果的准确性。上述结果表明,该Cell-ELISA法可作为一种HTS方法 ,用于筛选抗ASFV药物,并促进ASFV抗病毒药物的开发,对ASF疫情防控具有重要意义。     

非洲猪瘟病毒外膜蛋白CD2v的原核表达及其免疫特性的研究

本研究参考非洲猪瘟病毒(ASFV)国内分离株SY18株的EP402R基因(编码CD2v蛋白),优化其序列,设计特异性引物扩增。将去除跨膜保留胞外区或胞内区的两种截短体克隆到原核表达载体p ET-28a中,再转化至大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞。经IPTG诱导,铁蛋白融合CD2v胞外区(CD2vN-Fe)和铁蛋白融合CD2v胞外-胞内区(CD2v-NC-Fe)均获得高效表达。以该融合蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,通过酶联免疫吸附实验(ELISA)和间接免疫荧光(IFA)方法检测其灵敏度和特异性。结果表明:CD2vN-Fe多抗特异性较强。本研究为建立ASFV的血清学鉴别检测方法奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒p72蛋白N末端的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

根据非洲猪瘟病毒Pig/HLJ/2018株p72-N末端基因的核苷酸序列,合成p72-N末端648 bp基因序列,连入pET-28a(+)载体进行诱导表达,经SDS-PAGE和Western-blotting鉴定后,用重组蛋白p72-N末端作为包被抗原,建立检测猪血清中非洲猪瘟抗体的间接ELISA方法。结果显示,非洲猪瘟病毒p72-N末端648 bp基因片段成功克隆到pET-28a(+)载体中,经诱导表达获得约27 ku的重组蛋白,Western-blotting结果显示,重组蛋白与非洲猪瘟抗体阳性血清具有良好的反应原性。建立的ELISA方法结果显示,重组蛋白p72-N末端的最佳包被浓度为2.5μg/mL,待检血清最佳稀释度为1:100,该方法特异性好,仅与非洲猪瘟抗体阳性猪血清发生特异性反应,敏感度可达1:1 600;批内重复性和批间重复性变异系数均小于10%,与西班牙INGENASA公司非洲猪瘟抗体阻断ELISA检测试剂盒符合率可达93.75%。结果表明,获得的重组蛋白p72-N末端具有良好的反应原性和免疫原性,建立的非洲猪瘟抗体间接ELISA方法具有良好的特异性、敏感性和重复性。     

非洲猪瘟病毒P54基因原核表达载体的构建与表达

根据GenBank中非洲猪瘟病毒(ASFV)P54基因序列,设计合成了2对引物,采用PCR方法从ASFV DNA中分别扩增出了P54基因片段和经过改造的跨膜信号肽缺失的P54基因,将其克隆到表达载体pET28b中,构建了重组质粒pET-P54和pET-P54q,测序验证后转化入表达宿主菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE,Western-blotting检测.结果显示,经过改造的信号肽缺失的重组菌pET-P54q可表达出分子质量约24.5 ku的重组融合蛋白,表达的蛋白以可溶形式存在于菌体中,经镍柱亲和层析纯化可获得纯度较高的目的蛋白.纯化的蛋白能与ASFV阳性血清发生特异性的免疫印迹反应,证实,表达的蛋白具有较好的反应原性.     

非洲猪瘟病毒环介导等温扩增诊断方法的建立

通过对GenBank中登录的非洲猪瘟病毒(ASFV)p72蛋白基因序列进行分析,根据p72保守区序列设计合成了内(FIP,BIP)、外(F3,B3)2对引物,其中外引物扩增片段的大小为184bp。通过对反应条件进行优化,建立了非洲猪瘟LAMP检测方法。结果显示,该方法在62℃保温60min即可完成,最低可检测到1×101 copies/μL的病毒DNA,与常规PCR方法相比灵敏度高100倍。对ASFV、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒基因组DNA同时检测,结果仅有ASFV出现条带,而其他均未出现目的条带。表明,建立的ASFV-LAMP诊断方法具有较好的特异性和敏感性。     

非洲猪瘟病毒荧光量子点检测试纸条的研制

根据非洲猪瘟病毒（ASFV）VP72蛋白的氨基酸序列筛选合成多肽,并与载体蛋白BSA进行偶联,将以此得到的多肽作为抗原免疫小鼠,用来制备鼠源抗ASFV VP72蛋白的单克隆抗体。将上述方法制备的针对ASFV VP72蛋白的单抗作为荧光量子点标记的抗体,以与这种标记单抗互相配对的另一单抗包被检测线（T线）,采用山羊抗鼠二抗Ig G包被质控线（C线）,建立了一种简便、快速、准确的用于ASFV抗原检测的荧光量子点免疫层析试纸条。结果表明,制备的试纸条对于猪瘟等8种猪常见疫病免疫用灭活疫苗检测时无交叉反应;可检测到8μg/m L的VP72重组蛋白;与商品化的ASFV荧光定量PCR检测试剂盒进行比对检测,其对临床样品检测的阳性符合率为82.1%(23/28),阴性符合率为93.8%(75/80)。该试纸条特异性好、灵敏度高以及稳定性好,为ASFV的现场快速初步诊断提供了一种技术支持。     

基于非洲猪瘟病毒pA104R蛋白的间接ELISA检测方法的建立与应用

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的一种危害性极强的病毒性疾病,该病的发生和流行对全球养猪业、猪肉食品供应及经济发展造成了巨大影响。ASFV基因组较大、编码蛋白众多,但目前很多病毒蛋白的功能尚不清楚。由于缺乏有效的治疗措施和安全的疫苗,所以ASF的防控及疫区的净化仍然面临巨大挑战,而早期、快速、可靠的实验室诊断仍然是该病防控的重要手段。本研究以ASFV基因Ⅱ型毒株的基因组为模板,扩增A104R、B602L、CP204L (P30)、B646L(P72)和K205R基因,并将其克隆至表达载体pET-30a,构建原核表达质粒,经IPTG诱导后表达5种病毒蛋白,其中p A104R、pK205R为可溶性表达,P30、P72、pB602L为包涵体表达。经Western-blot分析鉴定蛋白的抗原性,五种原核表达的蛋白都能够和ASF阳性血清发生特异性反应,通过比较,筛选出pA104R作为最佳诊断抗原,并初步建立了ASFV抗体检测间接ELISA方法。该方法能够敏感、特异的检测ASFV阳性血清,而与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病病毒(PRV)、口蹄疫病毒(FMDV)阳性血清均无交叉反应。利用建立的间接ELISA方法与商品化间接ELISA抗体检测试剂盒平行检测田间样本,结果表明,本研究建立的方法与商品化试剂盒之间的符合率达到94.7%(142/150)。上述结果表明,本研究建立的间接ELISA方法能够用于ASF血清抗体的检测。     

非洲猪瘟病毒PP62蛋白在昆虫细胞中的表达与鉴定

为表达非洲猪瘟病毒PP62蛋白,将非洲猪瘟病毒pp62基因克隆至pFastBac-HTA载体,经转座、转染后获得重组杆状病毒rBac-pp62。将该重组病毒感染Sf9细胞后,采用间接免疫荧光(IFA)检测PP62蛋白的表达,通过亲和层析纯化重组蛋白PP62,以Western-blot和间接ELISA方法鉴定纯化的重组蛋白PP62的免疫反应活性。结果显示,重组杆状病毒rBac-pp62感染的Sf9细胞可以大量表达PP62蛋白,纯化的PP62重组蛋白能够与非洲猪瘟阳性血清发生特异性反应,以重组蛋白PP62为包被抗原建立的间接ELISA方法可以区分非洲猪瘟阳性血清和阴性血清。结果表明,表达的重组蛋白PP62具有良好的反应活性,可作为开发非洲猪瘟抗体检测试剂盒的抗原以及用于PP62蛋白的结构和生物学功能研究。     

猪瘟病毒表面抗原E2-E~(rns)蛋白在拟南芥种子中的表达及抗原性分析

根据拟南芥密码子偏好性对猪瘟病毒表面抗原基因E2和E~(rns)的序列进行优化,并将优化的E2-E~(rns)基因克隆入植物表达载体中;利用农杆菌介导的花序浸染法转化拟南芥,通过1%草铵膦喷洒筛选阳性植株,利用PCR鉴定阳性植株;提取阳性种子总蛋白进行ELISA检测评价重组E2-E~(rns)蛋白的免疫反应原性;用E2-E~(rns)融合蛋白灌胃免疫小鼠并检测其血清中的特异抗体效价。结果,成功构建了由菜豆蛋白启动子驱动的种子特异性表达目的基因的植物表达载体p PHAP1301-E2-E~(rns),并利用拟南芥成功表达了猪瘟病毒表面抗原E2-E~(rns)融合蛋白。免疫试验结果表明,通过拟南芥表达的E2-E~(rns)融合蛋白具有良好的免疫反应原性。结果表明,本研究获得了表达E2-E~(rns)蛋白的转基因拟南芥,小鼠口服植物源E2-E~(rns)融合蛋白具有良好的抗原性,这为深入研究利用植物表达猪瘟病毒表面抗原奠定了基础。     

山羊痘病毒L1R蛋白的原核表达及其免疫原性的研究

为探究山羊痘病毒L1R蛋白的免疫原性,将山羊痘病毒的L1R基因克隆到p ET-30a(+)原核表达载体并转化大肠杆菌BL21(DE3),挑取阳性克隆进行诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western-blot分析后进行纯化,将纯化的重组L1R蛋白免疫BALB/c小鼠,通过间接ELISA、淋巴细胞增殖和微量中和试验研究重组L1R蛋白的免疫原性及其多克隆抗体的抗病毒作用。结果显示,成功表达出分子质量约为26 ku的目的蛋白,其可被山羊抗绵羊痘阳性血清所特异性识别。重组L1R蛋白能够刺激小鼠产生体液免疫和细胞免疫,并且其多克隆抗体能够中和山羊痘病毒,从而证实山羊痘病毒L1R蛋白具有良好的免疫原性。