猪瘟病毒抗体胶体金免疫层析试纸条的研制及初步应用

为建立一种简便、快捷、特异、敏感的猪瘟病毒(CSFV)E2抗体的胶体金检测方法,本研究将E2蛋白用胶体金颗粒标记,作为金标抗原,将E2蛋白及其单克隆抗体包被在硝酸纤维素膜(NC)上,分别作为检测线(T线)和质控线(C线),组装成检测猪瘟E2蛋白抗体的胶体金免疫层析试纸条.结果 显示,该试纸条可在5～10 min完成检测...     

牛蓝舌病病毒VP7抗体胶体金试纸条检测方法的建立

为建立一种快速检测牛蓝舌病病毒抗体的免疫层析方法,本研究通过胶体金标记蓝舌病病毒VP7蛋白,以兔抗牛IgG作为检测线,抗蓝舌病毒VP7蛋白单克隆抗体作为质控线,采用间接法制备了胶体金免疫层析试纸条。结果显示,该胶体金试纸条在蓝舌病病毒抗体阳性血清稀释度为1∶64时仍可检出;该试纸条与牛结核病、牛布鲁氏菌病、牛病毒性腹泻、牛巴氏杆菌病、牛地方流行性白血病的阳性血清均无交叉反应;与国外商品化试剂盒相比较,该试纸条检测结果与ELISA检测试剂盒(IDEXX)的符合率为92.7%(51/55)。结果表明,本试验初步建立的牛蓝舌病病毒抗体的胶体金免疫层析检测方法具有较好的特异性和稳定性,整个检测过程可在10 min内完成,能够快速检测样品血清,适用于现场快速检测。     

狂犬病病毒抗体免疫金标检测试纸的制备及其应用

为了建立一种快速检测狂犬病病毒抗体水平的方法,用浓缩提纯的狂犬病病毒CVS11株作为胶体金标记抗原,以金黄色葡萄球菌A蛋白为检测线上的捕获抗原,制备狂犬病病毒抗体水平检测试纸条。应用该试纸条进行临床样品检测,结果表明,以稀释后的犬全血或血清作为检测样品,试纸条检测的灵敏度为0.002U/mL,特异性试验证明该试纸条与犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬腺病毒2型犬科疾病阳性血清没有交叉反应,稳定性试验证明该试纸条在室温下保存的有效期为12个月,检测结果与快速荧光抑制试验的符合率为95.12%。证实该狂犬病病毒抗体免疫金标检测试纸可以方便、快速、灵敏、特异地检测狂犬病病毒的抗体水平。     

A群猪轮状病毒胶体金免疫层析试纸条的研制

为建立一种快速、简便的猪轮状病毒检测方法,采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记纯化的抗猪轮状病毒VP6蛋白单克隆抗体,在硝酸纤维素膜上喷加纯化的抗猪轮状病毒VP6蛋白多克隆抗体和羊抗鼠IgG,制成检测猪轮状病毒抗原的胶体金免疫层析试纸条。结果表明,所制备的试纸条用于检测猪轮状病毒感染的MA104细胞培养物,在检测线处出现红色反应带,未感染病毒的细胞培养物在检测线处未出现反应条带,上述培养物在质控线处均出现红色反应条带;进一步试验表明,试纸条检出病毒培养液(TCID50是10-6.25/0.1 mL)的最低限为1∶32稀释;用不同批次的试纸条重复检测,结果无差异;该试纸条不与相关的腹泻病毒猪传染性胃肠炎病毒、流行性腹泻病毒发生反应,所制备的试纸条具有一定的敏感性和特异性,重复性良好。     

嗜水气单胞菌胶体金快速检测试纸条的研制

用柠檬酸三钠还原氯金酸制备胶体金颗粒,标记抗嗜水气单胞菌单克隆抗体并制备金标垫。将吸收垫、喷涂有抗嗜水气单胞菌单克隆抗体和羊抗鼠抗体的硝酸纤维素膜、金标垫及样品垫组装成免疫层析试纸条,建立嗜水气单胞菌的胶体金免疫层析快速检测方法。用灭活细菌与血清混合的模拟检测样本测定试纸条的特异性、灵敏度,结果显示:试纸条对豚鼠气单胞菌、温和气单胞菌、鳗弧菌、溶藻弧菌、荧光假单胞菌、副溶血弧菌等13种常见病原菌没有交叉反应,与嗜水气单胞菌有特异性反应,检测灵敏度为1×105CFU/mL,检测时间小于5min。所制备的嗜水气单胞菌胶体金免疫层析检测试纸条具有快速、简便、特异性高、适用于基层临床生产推广应用等优点。     

鹅细小病毒胶体金免疫层析检测方法的建立

为建立一种快速、简便地检测鹅细小病毒(GPV)的方法,采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金,将其标记于抗GPV VP3蛋白单克隆抗体2D5上,在硝酸纤维素膜上喷涂抗GPV VP3蛋白单克隆抗体4A8和山羊抗小鼠IgG抗体作为检测线和质控线,制成检测GPV的胶体金免疫层析试纸条。结果显示,该试纸条检测GPV的最低TCID50为1×104.15/mL,用制备的试纸条仅检测GPV为阳性,而检测其他主要水禽病的病原结果均为阴性;同一批次和不同批次的试纸条对GPV阳性样品的检测结果均无差异。使用该试纸条对已知的80份粪便样品进行检测,阳性及阴性样品的检测符合率分别为96.49%和100%。结果表明,制备的试纸条具有良好的特异性、敏感性和重复性,为"小鹅瘟"的快速诊断提供了新的方法。     

非洲猪瘟病毒抗体量子点检测试纸条的研制

根据非洲猪瘟病毒(ASFV)VP73蛋白的氨基酸序列推测抗原表位优势区域,合成多肽并与牛血清白蛋白(BSA)偶联,筛选有抗原性的多肽作为试纸条检测线的包被抗原,采用量子点作为标记材料对葡萄球菌蛋白A(SPA)进行标记,以抗SPA的多克隆抗体作为质控线的包被蛋白,制备快速检测ASFV抗体的量子点免疫层析试纸条。结果表明,所制备的试纸条与常见相关猪疫病阳性血清无交叉反应,与进口ELISA试剂盒对临床样品的检测符合率为100%;特异性强、敏感性高、稳定性好、操作简便,可用于ASFV抗体的快速检测和流行病学调查。     

水貂阿留申病毒抗体胶体金检测方法的开发和应用

为开发一种全新的检测水貂阿留申病毒抗体的检测方法,采用胶体金标记法对水貂阿留申病毒AMDV-G株进行全病毒标记,随后将金标记物固化在固相载体中,同时按顺序将水貂阿留申病毒全病毒以及水貂抗阿留申病毒抗体喷涂于硝酸纤维素膜(NC膜)上,将金标记物固相载体以及包被有抗体及病毒的NC膜连同其他组件组装成试纸条,进行水貂阿留申病毒抗体的检测。对于水貂阿留申病毒抗体阳性样品,试纸条检测线(T线)和质控线(C线)均有条带,水貂阿留申病毒抗体阴性样品,试纸条检测线(T线)无条带,而质控线(C线)有条带。结果,所制备的水貂阿留申病毒抗体胶体金检测试纸条实验室检测阳性质控血清符合率达100%,不与MEV、CDV阳性血清及ADV阴性血清反应,对试纸条的重复性检测达100%,临床试验对240只水貂血清样品对比进行检测,两种方法检测结果符合率95.83%。上述结果表明,本研究建立的水貂阿留申病毒抗体胶体金检测方法可以作为替代对流免疫电泳检测水貂阿留申病的新方法。     

基于金纳米颗粒标记非洲猪瘟病毒p30蛋白免疫层析检测方法的建立

为建立一种用于非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体的快速检测方法,本研究将特异性高、抗原性强的重组ASFV p30蛋白用金纳米颗粒标记,制成捕获金标抗原;将p30蛋白及其多克隆抗体(ASFV-p30-Ab)包被在硝酸纤维素膜(NC)上,分别作为检测线(T线)和质控线(C线),制备ASFV p30金纳米颗粒免疫层析抗体检测试纸条,并对该方法开展了初步评价。结果表明,该试纸条可在5-10 min完成检测;以健康猪血清、口蹄疫病毒(FMDV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)等阳性血清作为对照,该方法仅特异性的检出ASFV感染的血清阳性样品,与各对照组血清无交叉反应;以进口ASFV抗体ELISA检测试剂盒作为金标准对阴、阳性样品进行对比检验,该试纸条检出的敏感性和特异性分别为92.52%和92.00%,说明本研究制备的ASFV p30抗体金纳米颗粒检测试纸条具有较高的敏感性和特异性,具备操作简便、检测快速和结果判断容易等特点,具有ASF现场检测的实际应用价值。     

弓形虫抗体免疫胶体金快速检测试纸条的研制

将样品垫(加样区)、包被了弓形虫排泄分泌抗原和胶体金结合物的结合垫、包被了弓形虫排泄分泌抗原和抗弓形虫抗体的硝酸纤维素膜、吸水垫依次首尾互相衔接粘贴在白色塑料板上,组装成检测弓形虫抗体的免疫胶体金快速试纸条。然后用其进行动物弓形虫病血清抗体检测,并用弓形虫IHA诊断试剂进行对照试验。经对已知弓形虫阴、阳性血清检测,与弓形虫IHA检测结果的符合率为82.5%,金标试纸条较弓形虫IHA诊断试剂能提前2 d检测到抗体。结果表明,检测弓形虫抗体免疫胶体金试剂(金标试纸条)的敏感度高于IHA。     

奶牛乳房炎四种致病菌PCR核酸免疫层析试纸条快速检测方法的建立及应用

为了开发检测导致奶牛乳房炎的无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和停乳链球菌这四种重要致病菌的PCR核酸免疫层析试纸条方法,本研究采用柠檬酸还原法制备10 nm的胶体金溶液,选用优化的10μL 1 mol/L碳酸钾溶液调节pH和5μL异硫氰酸荧光素抗体偶联金颗粒,并使用优化的封闭液(10%BSA、0.25%PEG2000、0.05%吐温-20、0.05%Triton-X100)进行封闭,将地高辛抗体和山羊抗鼠二抗分别喷涂在检测线和质控线上,烘干并组装成试纸条,进行细菌的纯培养物和鲜牛奶加样检测。结果显示,所制备的PCR核酸免疫层析试纸条和凝胶电泳均具有较好的特异性,最低检测限要比凝胶电泳高10倍,在模拟污染牛奶样品测试中,试纸条仍然具有很好的特异性且灵敏度比凝胶电泳的高。上述结果表明,本研究建立的PCR核酸免疫层析试纸条检测方法具有良好的临床应用潜力。     

大肠杆菌O157∶H7胶体金免疫层析检测试纸条在感染牛和小鼠排菌检测中的应用

为了检验大肠杆菌O157∶H7胶体金免疫层析检测试纸条在感染动物排菌中的应用效果,将牛和小鼠采用灌胃攻毒方式试验感染大肠杆菌O157∶H7,用大肠杆菌O157∶H7胶体金免疫层析检测试纸条、细菌鉴别培养基培养计数以及PCR 3种方法检测感染动物粪便中O157∶H7的排菌量和持续时间。牛在感染大肠杆菌O157∶H7后的第2天开始从粪便排菌,第4天达到峰值,排菌时间可持续28d;小鼠在感染O157∶H7后的第4小时开始从粪便排菌,第6小时达到峰值,排菌时间可持续15d。大肠杆菌O157∶H7胶体金免疫层析检测试纸条、细菌鉴别培养基培养计数以及PCR 3种方法的检测结果一致,但试纸条更简便、快捷、直观,1～5min可得出检测结果,便于现场检测样品中O157∶H7的快速筛查。     

猪瘟病毒荧光RT-PCR快速检测方法的建立

以猪瘟病毒5′端非编码区为靶核酸序列设计引物和探针,建立了一步法荧光RT-PCR检测猪瘟病毒。荧光RT-PCR仅检测出猪瘟C株、T株,未能检测出牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪呼吸系统冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪细小病毒、伪狂犬病病毒、猪生殖与呼吸综合征病毒、PK-15细胞和牛睾丸原代细胞;对猪瘟病毒T株的扩增反应产物进行了测序分析,与预期序列相符。荧光RT-PCR的检测极限可达到1 TCID50/mL,整个试验流程只需2 h。采用荧光RT-PCR和抗原捕获ELISA同时检测临床病料、猪副产品共207份样本,两种方法的检出率分别为17.4%和13.5%,两者符合率为95.7%(198/207);荧光RT-PCR的检出率高于ELISA,两者差异显著。结果表明,建立的荧光RT-PCR可用于猪产品、临床病料中猪瘟病毒的快速检测。     

猪瘟病毒NASBA-ELISA检测方法的建立与应用

为建立猪瘟病毒NASBA-ELISA检测方法,以猪瘟病毒(CSFV)E2基因为研究对象,利用Prim-er 5.0和Blastn生物软件,设计并合成了特异的核酸序列依赖扩增(NASBA)引物和探针。经条件优化,确定的最佳扩增反应条件为42℃,反应1.5h。临床检测结果显示,用该方法可特异地扩增CSFV E2基因约155bp的目的片段,而对TGEV、PRRSV、PCV2、PPV、PEDV、APP和PK-15正常细胞等核酸的检测均为阴性,可最低检出1×100～1×101 copies/μL,其灵敏度比RT-PCR略高。应用该方法对采自重庆部分地区猪场的125份样品进行了检测;结果,猪瘟病毒阳性检出率为5.6%,NASBA-ELISA法与RT-PCR法的检出符合率为94.4%。结果表明,NASBA-ELISA方法可应用于CSFV的快速鉴别检测。     

RT-PCR与兔体交叉试验检测猪瘟病毒感染的相关性研究

对猪瘟RT PCR诊断方法与兔体交叉试验诊断方法的相关性进行了研究。通过计算机软件设计了猪瘟病毒E2基因保守区的 1对引物 ,建立了猪瘟病毒RT PCR检测方法 ,同时应用兔体交叉试验进行对比 ,对 7份临床送检病例进行了检测。结果表明 ,二者的符合率为 10 0 % ,但RT PCR可大大降低检测所用的时间 ,更便于猪瘟的快速诊断。     

布鲁氏菌血清抗体量子点荧光微球检测试纸条的研制

为研制一种现场快速筛查布鲁氏菌病的免疫层析试纸条,本研究以量子点荧光微球作为示踪物,共价偶联布鲁氏菌外膜蛋白OMP22,并将布鲁氏菌外膜蛋白OMP28和抗OMP22的单克隆抗体喷涂于硝酸纤维素膜上分别作为检测线和质控线,组装试纸条。结果显示,量子点荧光微球试纸条检测阳性血清的最大稀释度为1∶512,检测布鲁氏菌病阳性血清的敏感性为99%,特异性为98%,与虎红平板凝集试验(RBPT)的符合率为99%。且与结核病、蓝舌病、病毒性腹泻、口蹄疫及小反刍兽疫血清无交叉反应。上述结果表明量子点荧光微球免疫层析试纸条检测速度快、灵敏度高、特异性强且成本低,适用于布鲁氏菌病的现场筛查。     

H5亚型禽流感病毒反应原性差异及ELISA检测方法的研究

在获得禽流感病毒多克隆抗体及H5亚型特异性单克隆抗体的基础上,建立了H5亚型特异性抗原捕捉ELISA检测方法。通过分析不同单克隆抗体与不同禽流感毒株的反应性差异,筛选高特异性和高敏感性的H5亚型单克隆抗体。优化反应条件,确定包被抗体、检测抗体及酶标抗体的最佳工作浓度,进行敏感性、特异性、重复性及稳定性分析,并与斑点ELISA、H5N1多重RT-PCR或病毒分离鉴定的结果相比较,同时使用该方法对野外样品进行了检测。结果表明,该方法敏感、特异,具有良好的重复性和稳定性,可用于检测临床样品、鸡胚培养物及细胞培养物中的H5亚型禽流感病毒。