PRRS病毒M蛋白在大肠埃希氏菌中的高效表达

将猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF6基因从pGEM-T-ORF6重组质粒中亚克隆到pET-5a原核表达载体上,成功构建重组表达质粒pET5-ORF6.将其转化大肠埃希氏菌BL21(DE3)感受态细胞,重组菌经IPTG诱导表达,其细菌裂解物经SDS-PAGE可检测到分子质量约为19 ku的目的蛋白带,经薄层扫描分析,目的蛋白占菌体总蛋白的26.8%,采用重组菌裂解物作为包被抗原进行ELISA检测,结果表明表达的蛋白显示特异性.     

猪生殖与呼吸综合征病毒M基因和N基因的表达

将猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的M基因和N基因从重组质粒pMD18-T-M-N中亚克隆至pBV220原核表达载体上,成功构建了重组表达质粒pBVM-N。将pBVM-N转化大肠埃希氏菌DH5α感受态细胞,重组菌经温度敏感诱导表达,其细菌裂解物经SDS-PAGE可检测到分子质量约为19 ku的目的蛋白,与M基因表达产物一致;经蛋白质分析软件Bandscan分析,其表达量可达19.1%;Western-blotting分析表明,该重组蛋白可被兔抗PRRSV血清所识别,与预期的M基因表达产物相一致,而N基因未获表达。     

伪狂犬病病毒闽A株糖蛋白gD基因去信号肽片段在大肠埃希氏菌中的表达

应用PCR方法从包含伪狂犬病病毒(PRV)Fa株糖蛋白gD基因的重组质粒pB13中扩增出糖蛋白gD基因去信号肽片段,将其克隆到大肠埃希氏菌表达载体pThiohisA中。测序结果表明,糖蛋白gD基因去信号肽片段长1 155 bp,与PRV Fa株糖蛋白gD基因完全一致。经1mmol/L IPTG诱导后,重组质粒pThiohisA-gD在大肠埃希氏菌XL1-blue、Top10、DE3和DH5α中均得到表达,其中在宿主菌XL1-blue中表达量最高。Western-blotting结果显示,大肠埃希氏菌XL1-blue表达的糖蛋白gD具有免疫原性。     

长白猪γ-干扰素基因的原核表达与分析

以含长白猪IFN-γ基因的质粒载体为模板,用原核表达引物扩增了长白猪IFN-γ基因,将其定向克隆至原核表达载体pET28b的EcoRⅠ和XhoⅠ位点,构建了长白猪IFN-γ基因的原核表达载体pET28b-PoIFN-γ。经酶切、PCR鉴定,表明所构建的重组质粒为特异性长白猪IFN-γ基因原核表达质粒。将该重组质粒转化大肠埃希氏菌BL21(DE3)细胞,阳性菌落筛选、SDS-PAGE分析以及Western-blotting分析表明,成功构建了表达重组猪IFN-γ的大肠埃希氏菌基因工程菌株。亚细胞定位分析表明,目的蛋白经原核表达后主要以不溶性包涵体形式存在,其他少量可溶性目的蛋白存在于细胞浆中。     

类志贺毒素Ⅱ型变异体A亚单位基因缺失株的构建及表达

采用PCR方法分别对类志贺氏菌毒素A亚单位基因第 2 98～ 80 5序列、818～ 12 0 1序列进行了扩增 ,使其第 80 6～ 817序列的碱基 (编码 16 7～ 170位氨基酸 )缺失 ,并将两片段连接后克隆至质粒载体pGEX 6P 1中 ,获得了含有重组质粒 pGEX Ade的重组大肠埃希氏菌 ;经SDS PAGE以及使用特异性抗SLT ⅡeA单克隆抗体的Western blotting ,证明该重组大肠埃希氏菌在IPTG诱导条件下可表达SLT ⅡeA。     

可控细胞膜孔形成蛋白基因的克隆与表达

根据Wood 4 6株金黄色葡萄球菌α溶血素 (α HL)基因序列设计了引物 ,用高保真PCR从 180 0株金黄色葡萄球菌基因组DNA中扩增出了 0 .9kb的α HL基因 ,序列测定结果显示 ,两菌株α HL基因的核苷酸序列有 6个碱基差异 ,但仅引起 1个氨基酸替换。用PCR分段克隆和定点突变技术将大肠埃希氏菌外膜蛋白A信号肽序列与α HL编码区融合 ,并将其第 130～ 134位氨基酸替换为 5个连续的组氨酸 ,获得的融合基因命名为H5基因。将其克隆入 pET 30a质粒 ,用获得的重组质粒pET H5转化感受态大肠埃希氏菌 ,获得分泌性表达H5的重组菌。经IPTG诱导后 ,重组菌表达出分子质量为 35ku的H5蛋白。经镍柱亲和层析纯化的H5对兔红细胞的半数溶血值为 180ng/mL ,能使鼠成纤维细胞PA317获得对台盼蓝和海藻糖的通透性 ,且能被Zn2 抑制。提示 ,表达的H5蛋白为可控细胞膜孔形成蛋白 ,能用作真核细胞内玻璃态保存的渗透剂     

环形泰勒虫裂殖体表面蛋白基因高免疫原性区片段的克隆及其表达

根据环形泰勒虫TaA12 72 1株裂殖体表面抗原 (TaSP)基因的序列设计了 1对引物 ,用PCR扩增出该基因长为 393bp的高免疫原性区片段 (SBxp)。将扩增产物连接到 pGEM TEasy载体上 ,转化入大肠埃希氏菌JM 10 9中进行克隆。随后将重组质粒 pGEM SBxp和表达载体 pGEX 4T 1分别以BamHⅠ、XhoⅠ酶切后 ,将酶切的目的片段SBxp亚克隆到原核表达载体中构建了重组表达载体 pGEX 4T 1 SBxp ,并将其转化到BL2 1宿主菌中。提取重组质粒经BamHⅠ、XhoⅠ酶切、PCR鉴定和测序确证后 ,阳性克隆用IPTG诱导表达。收集不同时间的菌液进行SDS PAGE电泳和Westernblotting检测。结果 ,SBxp基因在大肠埃希氏菌中成功表达 ,其表达产物为分子质量 4 3ku的融合蛋白 ,该产物能被牛环形泰勒虫阳性血清所识别。     

堆型艾美球虫表面抗原基因cSZ1在大肠埃希氏菌中的表达

根据已克隆的堆型艾美球虫 (Eimeriaacervulina)广东株子孢子表面抗原基因cSZ1的cDNA序列设计了特异性引物 ,用PCR方法扩增cSZ1的开放阅读框架 (ORF)后克隆至表达载体pET 32a( ) ,构建了重组表达质粒 pET 32a( ) cSZ1,并将其转化至大肠埃希氏菌BL2 1(DE3)。经IPTG诱导 ,获得了cSZ1重组抗原在大肠埃希氏菌中的高效表达 ,表达产物量可达菌体总蛋白的 9.3% ,融合蛋白的分子质量约为 4 0ku。重组菌诱导表达的产物经SDS PAGE后 ,用堆形艾美球虫感染鸡的超免疫血清进行免疫印迹分析 ,结果为阴性 ,提示cSZ1所编码的抗原可能主要是T细胞抗原表位     

猪传染性胃肠炎病毒TH-98株M蛋白基因的克隆及原核表达

构建了TGEV TH-98株M基因序列的原核表达载体,利用RT-PCR方法从TGEVTH-98株中扩增出M蛋白基因,并亚克隆至原核表达载体pGEX-6P-1上,转化大肠埃希氏菌BL21(DE3)pLysS,用IPTG诱导重组菌株表达了融合蛋白。结果表明,从TGE TH-98株克隆到了M基因cDNA,该基因全长789 bp,与T014株、Purdue株、TFI株和96-1933株的M基因同源性分别为92.37%、98.35%、99.87%和96.96%。SDS-PAGE电泳结果显示,重组表达质粒获得了约57 ku的目的带,其中M蛋白的分子质量约为31 ku,与预期的结果一致;Western-blotting分析表明,融合表达产物可与TGEV全病毒制备的阳性血清发生反应。证实,TGEV的M基因高度保守,构建的M基因原核表达载体pGEX-6P-TM能在大肠埃希氏菌中获得高效表达。     

大肠埃希氏菌F18菌毛FedF蛋白的表达与鉴定

根据已发表的F18菌毛F亚单位的基因序列(fedF)设计了1对引物,利用PCR技术分别扩增到F18ab和F18ac菌毛的fedF编码序列,并按预定的阅读框架分别插入表达载体pGEX 6p 1中谷胱甘肽转移酶(GST)基因的下游,获得重组质粒pPFedF/ab与pPFedF/ac,然后转化大肠埃希氏菌BL21获得重组菌PPFedF/ab与PPFedF/ac。测序结果表明,fedF编码序列大小均为837 bp,与GenBank中登录的FedF 结构编码序列(Z26520)大小一致。通过对菌体裂解物进行SDS PAGE电泳分析以及Western blotting鉴定,证明重组大肠埃希氏菌PPFedF/ab与PPFedF/ac均可以表达融合蛋白形式的FedF(分别命名为GST FedF/ab与GST FedF/ac)。     

近期朝鲜经济发展变化及中韩的作用

朝鲜自2002年7月开始实行经济管理调整措施以来已经历了五个年头,此间在经济发展政策上虽然做过一些调整,但总体政策上却没有发生明显的变化。经济上出现了恢复性的好转,可是,短期内还很难从根本上改变经济困难局面。中韩两国均是朝鲜的近邻,目前都与朝鲜建立了较为密切的经济往来关系,为缓解朝鲜的经济困难给予了较多的支援,对朝鲜经济的恢复和发展发挥了积极的作用,而且今后的作用会愈来愈明显。     

亚太地区的安全稳定与俄中利益

亚太地区出现一个全新的局面。一方面,区域内的国际合作正在拓展,一个能够带来区域稳定和安全并得到普遍认同的体系正在形成。另一方面,亚太国家之间争夺地区内影响力的对抗和竞争的危险性日益加重,甚至有可能导致公开冲突并阻碍区域一体化的进程。为此,继续构建一个囊括地区内所有国家的,以合作、互信、对等安全为基础的新机制十分重要。亚太地区的发展直接影响俄罗斯联邦的利益,俄罗斯倡导要确保地区的稳定和安全,以及囊括所有亚太国家的建设性合作。近年来,俄罗斯政府特别重视促进东西伯利亚及远东地区的经济发展,该地区是俄罗斯实现亚太地区一体化的一个重要载体。开展同中国的合作,进一步开发俄罗斯远东地区,对于俄罗斯贯彻经济战略、实现经济现代化、融入亚太地区的经济空间,都具有原则性的重要意义。     

长吉图开发开放与吉林省对俄经贸发展前景分析

2009年国务院批复长吉图开放开发先导区规划,为吉林省发展对俄贸易提供了新机遇。该规划的实施将大力推动中俄互市贸易区、中俄产业合作园区、中俄经济走廊及物流体系的形成和发展,为吉林省对俄贸易在政策保障、资源利用、实力支撑、旅游产业以及科技交流等方面带来了新契机。     

朝鲜的核、导战略态势及其影响

朝鲜实施导弹发射和地下核试验,意在实现核拥有,籍以提高对美战略的筹码。朝鲜开展核战略角逐由来已久,先后展开过以守为攻;“边缘”对应;将计就计;以硬对强四个回合。角逐结果虽不乏战术上的小胜,却丧失了战略上的大胜。此番的导弹试射与地下核试验可视为第五个回合,是朝鲜核、导角逐战略“以攻为守”的转换。朝鲜执意实现核拥有纵有多种原因,却因核、导本身所拥有的“双刃剑”作用,带来于己、于他都不利的负面影响。包括:自食其言,愈加难以取信于国际社会;产生连锁反映,引发新一轮的军备竞赛;挑战核不扩散条约,难免遭到更大封杀;破坏合作气氛,延缓统一进程;置中国于尴尬境地,动摇中朝关系基础。朝鲜的“自行其事”难免遭到国际社会更加严厉的抵制。     

海权争霸与俄苏的兴衰及其历史反思

从海权的角度分析俄苏的兴衰是一个尚未有人进行充分探讨的问题。在数百年的争夺中 ,海权的扩张固然构成了俄苏崛起的一个因素 ,但从长远的角度看 ,对海权的过度追求又构成了俄苏走向衰落的根源之一。具体说来 ,从俄苏海权扩张西进、南下和东进 3条线路中 ,西进战略较为成功 ,并促进了俄苏的崛起 ;南下和东进战略虽有所收获 ,但都遭遇挫折 ,尤其是南下的世界扩张战略直接导致了苏联的衰落。从本质上来说 ,地缘政治条件的制约、俄苏海权过渡扩张所导致的一系列矛盾构成了俄苏海权战略失败并导致国力衰微的根源之一。     

猪传染性胃肠炎病毒四川株的分离鉴定及其S基因的克隆和序列分析

通过核酸类型试验、脂溶性敏感试验,鉴定了1株分离自四川某猪场腹泻病猪粪便的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)。经电子显微镜观察,可以看到大小约90 nm的病毒粒子;通过中和试验,将病毒细胞液与TGEV超免疫血清进行中和反应,显示较高的中和抗体效价。根据GenBank中的TGEV序列,设计了1对包含TGEV S基因1 760 bp部分片段的引物,经RT-PCR扩增获得了1条约1.8 kb的条带,通过低熔点琼脂糖凝胶纯化回收该片段后,将其连接在pMD 18-T载体上,转化DH5α大肠埃希氏菌,用双酶切和PCR对重组质粒进行鉴定并测序,经用DNAStar软件进行同源性分析和多重序列比较,TGEV四川株(SC-A)与国外报道的部分TGEV分离株具有高达98.8%的同源性。     

印度陆路交通运输业的改革与发展

本文概述了独立以来印度陆路交通运输的发展情况、政府的相关政策措施 ,分析了近年来印度的相关改革情况。     

Value and Politics of China and Russia

The 17th National Congress stressed that the Party must keep to the path of political development under socialism with Chinese characteristics. Since the introduction of the reform and opening up policy, China＇s economy has developed quickly, supplementing its political construction. Progress in the economy and political development have raised China＇s confidence and made the Chinese system more attractive to the rest of the world. Though China＇s political development has been achieved under the correct democratic development viewpoint, difficulties may yet arise, and China may need to look outside to other political achievements; importantly, China has the confidence and determination to make its political development harmonious, orderly and effective.     

改革开放与中国硬软实力的构建

改革开放是一场伟大的革命,不仅彻底改变了国家和民族的面貌,而且具有重大国际战略意义。改革开放既解放了物质生产力,也解放了精神生产力;既大幅提升了中国的硬实力,也增强了中国的软实力,提高了中国的国际地位。为了实现国家的全面发展,需要中国特色的硬软实力,而塑造和平和谐的硬软实力则需要永久的改革开放。     

中朝经贸关系发展现状与前景展望

2000年以后,中朝双边经贸关系迅速发展,双边贸易额、投资额均大幅增长,朝鲜对中国的经济依存度也逐年增加。虽然增速很快,但中朝之间贸易投资总额仍然不高,两国的经济交往仍面临很多障碍,朝鲜的外汇短缺、外贸交流体制的不健全、封闭的政策以及朝核危机等问题均为两国经济交往带来了阻碍。展望未来,中朝经贸关系具有很大的提升空间与发展潜力,根据两国面临的经济形势,建立中朝自由贸易区是一个具有战略意义的选择。