腐败梭菌α毒素重组突变体的免疫保护力评价

本研究旨在获得腐败梭菌α毒素(csa)的重组突变体,并评价该重组毒素的毒力及免疫原性。对已知的腐败梭菌α毒素编码基因进行优化设计,同时引入包括第86位半胱氨酸突变为亮氨酸及第296位的天冬氨酸、第301位的组氨酸和第342位的色氨酸突变为丙氨酸的4个氨基酸突变,经人工合成获得基因片段Gcsam4。将Gcsam4克隆至原核表达载体p ET-30(+)中进行表达与纯化,获得重组蛋白rcsam4。利用Western-blot检测rcsam4与腐败梭菌α毒素抗血清的反应性,并采用Vero细胞和小鼠检测其毒性。随后,将rcsam4与Montanide ISA 206佐剂以1∶1(V/V)的比例混合乳化制备疫苗并免疫家兔,按照《中华人民共和国兽药典》(2015年版)规定的方法检测兔血清的中和抗体效价。二免后第21天对家兔通过耳缘静脉注射1个MLD剂量的腐败梭菌毒素,来检测rcsam4对家兔的免疫保护效果。结果表明,rcsam4主要以包涵体的形式存在,且能够与腐败梭菌抗血清反应。Vero细胞毒性试验显示,9.85 g/m L的蛋白仍无细胞毒性;小鼠安全性试验显示,5.5×103g/kg的剂量对小鼠无致死性;免疫rcsam4后,每毫升的一免兔血清可中和50~70个小鼠MLD的腐败梭菌毒素;每毫升的二免兔血清可中和110~130个小鼠MLD的腐败梭菌毒素;1个家兔MLD的腐败梭菌毒素攻毒后,对照组家兔全部死亡,免疫组家兔得到了100%(4/4)的保护。以上结果表明,rcsam4在丧失毒性的同时还保留了良好的免疫原性,从而为腐败梭菌病基因工程疫苗的研制提供了重要的试验数据。     

腐败梭菌α毒素重组突变体的免疫保护力评价

本研究旨在获得腐败梭菌α毒素(csa)的重组突变体,并评价该重组毒素的毒力及免疫原性。对已知的腐败梭菌α毒素编码基因进行优化设计,同时引入包括第86位半胱氨酸突变为亮氨酸及第296位的天冬氨酸、第301位的组氨酸和第342位的色氨酸突变为丙氨酸的4个氨基酸突变,经人工合成获得基因片段Gcsa_(m4)。将Gcsa_(m4)克隆至原核表达载体pET-30a(+)中进行表达与纯化,获得重组蛋白rcsa_(m4)。利用Western-blot检测rcsa_(m4)与腐败梭菌α毒素抗血清的反应性,并采用Vero细胞和小鼠检测其毒性。随后,将rcsa_(m4)与Montanide ISA 206佐剂以1∶1(V/V)的比例混合乳化制备疫苗并免疫家兔,按照《中华人民共和国兽药典》(2015年版)规定的方法检测兔血清的中和抗体效价。二免后第21天对家兔通过耳缘静脉注射1个MLD剂量的腐败梭菌毒素,来检测rcsa_(m4)对家兔的免疫保护效果。结果表明,rcsa_(m4)主要以包涵体的形式存在,且能够与腐败梭菌抗血清反应。Vero细胞毒性试验显示,9.85μg/m L的蛋白仍无细胞毒性;小鼠安全性试验显示,5.5×10~3μg/kg的剂量对小鼠无致死性;免疫rcsa_(m4)后,每毫升的一免兔血清可中和50～70个小鼠MLD的腐败梭菌毒素;每毫升的二免兔血清可中和110～130个小鼠MLD的腐败梭菌毒素;1个家兔MLD的腐败梭菌毒素攻毒后,对照组家兔全部死亡,免疫组家兔得到了100%(4/4)的保护。以上结果表明,rcsa_(m4)在丧失毒性的同时还保留了良好的免疫原性,从而为腐败梭菌病基因工程疫苗的研制提供了重要的试验数据。     

气肿疽梭菌套式PCR检测方法的建立

根据GenBank中的气肿疽梭菌16SrRNA基因序列(登录号EU106373),设计合成了2对特异性引物,建立了适合气肿疽梭菌快速检测的套式PCR方法。对该方法的最佳反应条件进行了筛选,并采用该方法对气肿疽梭菌进行了检测。结果显示,气肿疽梭菌能扩增到341bp的条带,而魏氏梭菌、巴氏杆菌和腐败梭菌的扩增结果均为阴性。该方法第1次扩增的敏感性是56.41pg,第2次扩增的敏感性是56.41fg,第2次比第1次扩增的敏感性高103倍。表明,建立的套式PCR方法具有较高的敏感性和特异性,可用于气肿疽梭菌的检测,为气肿疽的临床检测、流行病学调查和进出口检疫提供了新的技术手段。     

早期断奶应激对仔猪影响的研究——对生长体重行为和发病率的影响

早期断奶应激（ＥＷＳ）对仔猪的生长、体重、行为和发病率均产生较大影响，给养猪业生产造成重大损失。试验分为２组进行观察，Ⅰ组为２８日龄断奶仔猪９８头，Ⅱ组为３５日龄断奶仔猪９６头。断奶后第１ｄ，平均每头日增重分别为１０和３０ｇ；第１０ｄ分别为１１３和１２８ｇ；第２０ｄ分别为４２２和４７７ｇ。早期断奶应激使仔猪昼夜行为发生改变，兴奋、追逐和争斗时间显著增加，休息时间减少。断奶前１ｄ，平均休息时间占７０．８４％，活动时间占２０．８３％，采食时间占８．３３％；断奶后第１ｄ分别为２５．００％，６２．５８％和１２．５０％；断奶后第５ｄ分别为５０．００％，３９．５８％和１０．４２％；断奶后第１０ｄ逐渐趋于正常。早期断奶后使仔猪应激性疾病的发病率增加，平均总发病率为７３．１９％，死亡率为８．２５％。其中腹泻发病率为４９．４８％，死亡率为５．１２％；水肿的发病率为２．５８％，死亡率为２．５８％；咬尾咬耳综合征和僵猪综合征发病率分别为１７．５３％和３．６０％，死亡率为０～０．５％。     

产气荚膜梭菌β毒素和ε毒素以及腐败梭菌α毒素三联基因工程灭活疫苗的制备与免疫效力评价

为了获得高表达量的重组C型产气荚膜梭菌β毒素,鉴定其致死性和反应原性,并评价其与D型产气荚膜梭菌ε毒素和腐败梭菌α毒素共表达产物联合制成三联基因工程灭活疫苗的免疫保护效力。设计含不同酶切位点的2对引物,PCR扩增C型产气荚膜梭菌β毒素基因cpb1和cpb2,将二者克隆至pRSFDuet-1质粒,转化大肠杆菌BL21 (DE3),自诱导培养基诱导2段基因共表达。用SDS-PAGE和Western-blot以及小鼠毒性试验、抗毒素血清和中和试验对表达产物进行鉴定。将诱导收获的大肠杆菌以及D型产气荚膜梭菌ε毒素和腐败梭菌α毒素的共表达产物1∶2配比灭活制成三联灭活铝佐剂疫苗,以每只1 m L剂量皮下免疫家兔2次后,测定血清中和抗体效价,用1 MLD的C、D型产气荚膜梭菌毒素和腐败梭菌毒素分别攻击。结果显示,所构建的重组大肠杆菌BL21(pRSFDuet-cpb1-cpb2)能够表达重组β毒素,产物能够与C型产气荚膜梭菌抗毒素血清反应,且具有小鼠致死毒性,抗毒素血清可以将其毒性中和;制成联合疫苗免疫家兔,免疫血清对C型产气荚膜梭菌毒素的中和抗体效价为8 MLD/0.1 m L,对D型产气荚膜梭菌毒素的中和抗体效价为45 MLD/0.1 m L,对腐败梭菌毒素的中和抗体效价为1.5 MLD/0.1 m L;用3种毒素攻击免疫组家兔均全部保护,对照组全部死亡,达到《中华人民共和国兽药典三部(2015版)》效力检验标准。本研究为羊猝狙、肠毒血症和快疫三联疫苗的研制提供了试验基础。     

梅花鹿猝死症的病原诊断及药敏试验

近年来,许多地区有关于牛、羊、猪发生猝死症的报道,其发病原因,河南、吉林、四川、青海、甘肃多为产气荚膜梭菌,山东的山羊发病主要是凝集芽胞杆菌和肺炎克雷白氏菌,还有一些地区分离到溶血梭菌及腐败梭菌,部分地区认为是氟乙酰胺中毒。1998年,山东省滨洲市某鹿场饲养的?..     

绵羊细菌性血红蛋白尿症的诊断

1926年美国人Vawter和Records报道,动物细菌性血红蛋白尿症的病原体是溶血梭菌(Clostridium hemolyticum)。该菌与水肿梭菌(lostridium Oedematiens)的毒素有密切关系,故OAkley和Warrack把它称为水肿梭菌D型。牛的细菌性血红蛋白尿症分布比较广泛(美国、澳大利亚、新西兰、英国、土耳其、罗马尼亚、古巴),在美国的牛发病地区内可见到绵羊的血红蛋白尿症(红尿症)。我们于1971年在格尔木发现此病,现报告于下。     

阿维菌素浇注剂对牛痒螨病的疗效试验

选择自然感染牛痒螨的杂交牛３０头，将其分成６组，每组５头，第１～４组分别用阿维菌素浇注剂（阿维必淋）按０．２，０．３，０．４和０．５ｍｇ／ｋｇ体重剂量在牛背部皮肤１次浇注给药；第５组用阿维菌素注射液（阿福丁）皮下１次注射；第６组为不治疗对照组。通过治疗后不同时间对每头试验牛皮肤固定部位的寄生虫检查和临床观察结果，评估阿维菌素浇注剂对牛痒螨病的疗效。治疗后第７ｄ显微镜检查时，仅从阿维菌素浇注剂０．２ｍｇ／ｋｇ体重剂量组的２头牛分别查到１和３个活螨（寄生虫指数为１）；之后，第１４，２１和３５ｄ显微镜检查时，各治疗组牛都未查到活螨（寄生虫指数为０）；治疗后第７ｄ观察，各治疗组牛的临床症状和皮肤病变都有程度不同的减轻，到第２１ｄ治疗组牛临床症状全部消失并康复。对照组牛被观察到１４ｄ，感染程度较试验开始时更严重。试验结果表明阿维菌素浇注剂体表浇注给药，０．３ｍｇ／ｋｇ体重剂量对牛痒螨有极强的杀灭作用，与阿维菌素注射液推荐剂量０．２ｍｇ／ｋｇ体重剂量的效果相同。     

北京鸭大肠杆菌病及灭活菌苗的初步研究

从１～７周龄北京鸭中分离出２９株大肠埃希氏菌，经血清学鉴定分别属血清型Ｏ１（１／２９），Ｏ２（５／２９），Ｏ８（１／２９），Ｏ２３（１／２９），Ｏ５３（１／２９），Ｏ９３（９／２９），Ｏ１３８（２／２９）及未鉴定血清型（９／２９），其中血清型Ｏ１和Ｏ２经皮下接种对１周龄和３周龄鸭有很强的致病力，所引起的病理变化主要有心包炎和肝周围有纤维素性渗出。利用血清型Ｏ２菌株制备的灭活菌苗和加铝胶灭活菌苗免疫１０日龄北京鸭，在二免后１０ｄ能完全抵抗同源菌攻击。应用ＥＬＩＳＡ在首免后第７ｄ可检测到较低水平的抗体反应，第１４ｄ达到第１个高峰，随后开始下降；３１日龄加强免疫后抗体水平大幅度上升，２周后达到最高峰，然后维持在较高的水平。     

五皮饮加五苓散治疗仔猪水肿病

五皮饮与五苓散出自《中藏经》和《伤寒论》 ,有健脾除湿、利水消肿的功效 ,2 0 0 0年春 ,笔者试并用该 2方加减治疗仔猪水肿病 ,疗效甚好。安吉县报福镇石湖村专业户俞某 ,仔猪 1窝共 17头 ,断奶 3日后 ,忽见仔猪群步态失稳 ,眼睑、下颌、头顶部水肿 ,精神萎顿 ,呼吸急促 ,翌日死亡 6头。接诊后诊断为仔猪水肿病 ,用五皮饮与五苓散合方 :大腹皮、陈皮、茯苓、桑白皮、生姜各 2 5ｇ ,白术、杏仁、车前草、桑枝、紫苏各 2 0ｇ ,厚朴、通草、葛根各 15ｇ ,煎汁候温灌服 ,每日 2次 ,连服 3ｄ。当晚仔猪小便畅通 ,第 2ｄ精神恢复 ,3ｄ后水肿消退…     

两种附红细胞体病的鉴别诊断

１９９７年８～９月,枣庄市郊相距２０ｋｍ的两猪场相继暴发了猪球形附红细胞体与猪附红细胞体感染。临床症状Ａ种猪场一栏育成种猪７０余头,第１ｄ见３头母猪背部出现成片或零星圆形红斑,食欲稍减,粪便正常;第２ｄ全群种猪皆出现相同症状,皮肤出现大小不一的圆形红...     

乳牛肉毒梭菌中毒的诊断

1998年 6月 ,青岛市某养牛户的乳牛突然发生以口角流涎、反应迟钝、全身麻痹等症状的疾病 ,数日内相继死亡成年乳牛 2头。发病情况　该户饲养乳牛 6头 ,6月 5日突然发病 ,第 2ｄ死亡 1头 ,第 4ｄ又死亡 1头 ,笔者及时赶赴现场调查发病经过、原因和饲养管理情况 ,仔细观察临床症状 ,并对死亡牛进行剖检 ,初步诊断为肉毒梭菌中毒。临床症状及剖检变化　突然发病 ,病牛精神沉郁 ,体温正常 ,食欲略减 ,反应迟钝。病情很快加重 ,表现肌肉软弱无力 ,咀嚼和吞咽困难 ,下颌下垂 ,口角流涎 ,眼半闭 ,瞳孔散大 ,视力减弱 ,对刺激无反应。步态踉跄 ,行…     

猪水肿病诊断和防治

１９９８年９月，广西某规模化猪场有８窝断奶仔猪相继发病，前后死亡６０多头，经实验室检验，诊断为猪水肿病。根据药敏试验选用高敏药物治疗，控制了疫情。１　发病情况１９９８年９月初，该场断奶１周左右的仔猪发病，主要症状为拉白色和淡黄色稀粪，大部分病猪眼睑水肿，体温一般为３８．０～３９．５℃，个别的为４０．５℃。病程短的数小时内死亡，部分病程为１～２ｄ，个别猪出现神经症状。该场兽医对发病猪用庆大霉素和氯霉素治疗，未见明显效果。２　病理变化病死猪皮下有胶冻样渗出物，整个肠粘膜明显充血、水肿，肠系膜淋巴结水…     

猪棉子壳中毒的诊治

猪棉子壳中毒的诊治格尔木市某猪场承包人为节省饲料，把２０头成年猪赶至河滩放牧，见猪群争食一堆被抛弃的种植食用蘑菇后的棉籽壳包，遂拉回按３１与麸皮混合喂猪，２次／ｄ，连喂２ｄ，第３ｄ开始发病，当天死亡２头，接着连续死亡１５头，仅存活５头。临床症状其中１...     

猫重症肌无力的诊治

猫重症肌无力的诊治１９９７年４月１１日，张某送来一雌性、体重１．５ｋｇ的猫求诊。主诉：该猫５月龄，半月前因患疥螨在某庞物店注射过伊维菌素３次，每次间隔５～６ｄ，第２次注射后见走路不稳，左右晃动，３ｄ后恢复正常，第３次注射后又出现前述症状。近日不食不饮...     

家畜产气荚膜梭菌病的病理形态学观察

自１９９０年宁夏回族自治区泾源县发生以牛为主的猝死症以来,发病范围逐年扩大,发病动物除牛外还见于羊、猪、鹿和马属动物。现已查明,该病是由产气荚膜梭菌引起的肠毒血症。鉴于本病的病理形态学鲜有报道,故对其进行了观察和研究。１材料与方法１．１材料在进行流行...     

截短腐败梭菌α毒素的表达及其免疫原性评价

为了获得截短腐败梭菌α毒素并评价其毒性、反应原性和免疫原性,根据腐败梭菌α毒素的结构与功能,设计2对引物分别扩增含有穿孔活性区和受体结合区的α毒素基因csaN和csaC,克隆至pET-28a(+)质粒,构建截短α毒素表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),诱导csaN和csaC表达,鉴定产物的反应原性和毒性,将经过诱导表达的工程菌灭活制成铝佐剂疫苗免疫家兔1次,通过血清中和试验和攻毒保护试验评价免疫效力,设立重组α全毒素rcsa免疫组作为阳性对照。结果显示,2个截短α毒素在大肠杆菌BL21(DE3)中均获得表达,产物能够与腐败梭菌抗毒素血清发生特异性反应,但失去了小鼠致死毒性。免疫家兔血清中和试验结果显示,csaN组血清的中和效价为1 MLD/0.1 mL,达到《中华人民共和国兽药典三部(2015年版)》效力检验的最低标准,csaC组为0,rcsa组为8 MLD/0.1 mL;csaN和csaC组家兔用1 MLD毒素攻击均未获得保护,而rcsa组家兔4/4获得保护。结果表明,截短α毒素与全毒素相比,失去了毒性但保留了反应原性,仅含穿孔活性结构区的截短部分具有较弱的免疫原性。     

表达CPB-ST融合蛋白工程菌株的免疫原性研究

已构建的能表达产气荚膜梭菌β毒素（ＣＰＢ）和大肠埃希氏菌ＳＴ融合蛋白（ＣＰＢＳＴ）的基因工程菌株ＢＬ２１（ＤＥ３，ｐＥＣＢＳＴ１）及其表达产物经动物试验证实没有毒性反应。用从ＩＰＴＧ诱导的工程菌株中提取的包涵体和经甲醛灭活的工程菌株全菌体制备抗原免疫小白鼠，攻毒试验结果表明，免疫小白鼠能分别抵抗１ＭＬＤ的Ｂ型产气荚膜梭菌强毒株（Ｃ５８－１）和产ＳＴ的大肠埃希氏菌工程菌株ＨＢ１０１（ｐＳＬＭ００４）的攻击。用灭活的全菌体免疫家兔后，其免疫血清能中和产气荚膜梭菌β毒素和大肠埃希氏菌ＳＴ的毒素活性。结果表明，构建的基因工程菌株ＢＬ２１（ＤＥ３，ｐＥＣＢＳＴ１）可以作为预防由产气荚膜梭菌β毒素和大肠埃希氏菌ＳＴ引起的幼畜腹泻的基因工程苗侯选菌株。     

牛羊猪“猝死症”防治技术研究——病原诊断

经过１９９５～１９９６年两年的调查研究，现已明确了本病的主要病原：除山东省外，河南、江苏、吉林、四川、青海、甘肃等省均从病死家畜的病料中分离出了魏氏梭菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｗｅｌｃｈｉｉ）；山东省从病死山羊的病料中很规律地分离出肺炎克雷伯氏菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）和凝结芽胞杆菌（Ｂａｃｉｌａｃｏａｇｕｌａｎｓ）；青海、海南、四川等省除分离到魏氏梭菌外，还从部分“猝死症”死亡牦牛、水牛和黄牛病料中分离出溶血梭菌（Ｃｌ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｍ）；江苏、四川、河南和甘肃等省还从病死家畜病料中分离到腐败梭菌（Ｃｌ．ｓｅｐｔｉｃｕｍ）。病原调查结果为这类病的预防免疫提供了依据     

魏氏梭菌肠毒素的氨基酸序列及其编码基因分析研究进展

魏氏梭菌肠毒素的氨基酸序列及其编码基因分析研究进展王云峰，崔尚金（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所１５０００１）能引起人或动物组织病变的魏氏梭菌毒素至少有１２种￣［１］，这些毒素中有一种热不稳定性肠毒素能引起空肠的液体蓄积和人的腹泻（食物中毒）。但是，...