猪和鸡源性产vero毒素大肠埃希氏菌的检测

产ｖｅｒｏ毒素大肠埃希氏菌（ｖｅｒｏｔｏｘｉｎｐｒｏｄｕｃｉｎｇＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ，ＶＴＥＣ），又名产志贺样毒素大肠埃希氏菌（ｓｈｉｇａｌｉｋｅｔｏｘｉｎｐｒｏｄｕｃｉｎｇＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ，ＳＬＴＥＣ），可以引起人...     

表达大肠杆菌耐热性肠毒素Ⅰ融合蛋白基因工程菌株的免疫原性研究

已构建的能表达大肠杆茵耐热性肠毒素１（ＳＴ＿１）－β－半乳糖苷酶融合蛋白基因工程菌株Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５ａ（ｐＸＳＴ＿１）经轧鼠灌胃试验证实没有毒性反应。采用超声波粉碎法裂解菌体，再辅以氢氧化铝胶制冬抗原，免疫接种ＢＡＬＢ／ｃ鼠，获得抗融合蛋白抗体，乳鼠灌胃中和试验结果表明，该抗体能中和天然ＳＴ＿１肠毒素活性，具有较好的免疫保护作用。以该菌株免疫的雌性ＥＡＬＢ／ｃ鼠产下的乳鼠吮吸初乳后，能够抵抗１个鼠活性单位ＳＴ＿１肠毒素的攻击。Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５ａ（ｐＸＳＴ＿１）工程菌株可作为预防大肠杆菌性腹泻基因工程菌苗的侯选菌株。     

岩羊病原性大肠埃希氏菌及A型产气荚膜梭菌的分离与鉴定

从1只突然死亡的1月龄雄性岩羊体内分离到1株病原性大肠埃希氏菌和1株A型产气荚膜梭菌,经毒力试验测得大肠埃希氏菌LD50为4.4×108CFU,A型产气荚膜梭菌LD50为6.1×109CFU,同时进行了药敏试验,为今后预防和诊疗提供理论基础.     

鸡大肠杆菌病疫苗滴鼻与注射免疫方法的比较试验

目前国内鸡大肠杆菌病疫苗多使用鸡源大肠埃希氏菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）Ｏ１，Ｏ２和Ｏ７８抗原提纯菌毛配以油佐剂或福氏佐剂制备，也有用鸡源大肠埃希氏菌Ｏ２，Ｏ７８和Ｏ３５抗原用甲醛灭活再加油佐剂或氢氧化铝佐剂制备。免疫途径多为鸡皮下和泄殖腔...     

牛产气荚膜梭菌病三价浓缩灭活苗免疫效力试验及免疫持续期测定

兰州生物药厂研制的牛产气荚膜梭菌三价浓缩灭活苗 ,经免疫动物血清抗体测定及本动物试验 ,效果良好。为了解血清抗体水平与攻毒耐受力间的关系及对本动物的免疫持续期 ,特进行了本试验。1　试验材料1.1　疫苗　牛产气荚膜梭菌三价浓缩灭活苗 ,共 3批 ,即960 2、960 6和 9610批。1.2　毒素　产气荚膜梭菌Ａ、Ｃ、Ｄ型毒素 ,小白鼠静脉测定毒价分别为 5 0 0、3 3 3和 2 0 0 0ＭＬＤ/ｍＬ。1.3　试验牛　免疫效力试验用 1岁以内黄牛 ,体重 80ｋｇ左右 ,性别、毛色不限 ,购自甘肃省临洮县 ;免疫持续期试验用临洮县农户所养的乳牛。2　方法与结…     

产气荚膜梭菌贵州分离株α-毒素基因的克隆与鉴定

提取了A型产气荚膜梭菌贵州分离株的染色体DNA,经聚合酶链反应(PCR)扩增并回收获得了1条242bp的特异性片段,将该基因片段克隆到质粒载体pUC19中,并转化至大肠埃希氏菌JM109中;经氨苄青霉素(Amp)抗药性和显色反应筛选及重组质粒酶切分析、PCR鉴定和Southern blotting检测,表明该重组质粒是产气荚膜梭菌α 毒素基因的克隆。     

产气荚膜梭菌多联浓缩苗对牛的田间免疫试验

产气荚膜梭菌多联浓缩苗对牛的田间免疫试验杜莲洪马乐英蒋祯吕红杨爱玲（农业部兰州生物药厂７３００４６）产气荚膜梭菌（即魏氏梭菌）多联浓缩苗是兰州生物药厂近年研制的预防牛、羊等动物产气荚膜梭菌病的生物制品，制苗菌株包括Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ四个型，浓缩比例为５１...     

志贺氏菌样毒素Ⅱ型变异体单克隆抗体的制备及其应用

应用淋巴细胞杂交瘤技术,获得１株针对志贺氏菌样毒素Ⅱ型变异体（ＳｈｉｇａｌｉｋｅｔｏｘｉｎⅡｖａｒｉａｎｔ,ＳＬＴⅡｖ）Ａ亚基单位的杂交瘤细胞,并建立了以硝酸纤维素膜为载体的菌落ＥＬＩＳＡ法。用此法检测１５株分离自猪水肿病的野毒菌株和３株产其它型ＳＬＴ的标准菌株,发现该单克隆抗体与１４株野毒菌株呈阳性反应,与产ＳＬＴⅡ的９３３Ｗ株菌有微弱交叉反应,但与产ＳＬＴⅠ和ＶＴ２的菌株（Ｈ３０和Ｅ３２５１１）均无反应。这表明该法能特异、敏感、简便、快速地鉴定产ＳＬＴⅡｖ的大肠埃希氏菌,适用于猪水肿病临床诊断及流行病学调查     

志贺样毒素与动物的大肠杆菌病

志贺样毒素与动物的大肠杆菌病高崧，张如宽（审校）（江苏农学院扬州２２５００９）人医中，除产肠毒素性大肠埃希氏菌（ＥＴＥＣ）外，肠致病性大肠杆菌（ＥＰＥＣ）的研究已相当深入（林万明１９９１）．ＥＰＥＣ中有一亚群可产生对Ｖｅｒｏ细胞有致死作用的细胞毒素，...     

新城疫病毒融合蛋白基因片段的构建与鉴定

重组和构建了新城疫病毒（ＮＤＶ）融合蛋白基因，并对该基因进行了鉴定。结果显示，将ＮＤＶＦｘ基因片段经ＲＴＰＣＲ扩增，插入经ＥｃｏＲⅠ和（或）ＳａｌⅠ酶切克隆载体ｐＵＣ１８及表达载体转化大肠埃希氏菌ＪＭ１０９株。用氨苄青霉素平板法初步筛选克隆，双酶切法、核酸探针、ＰＣＲ及核苷酸序列分析法鉴定后，表明插入成功且阅读框架正确。     

番鸭呼肠孤病毒σB蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

以纯化复性的原核表达的番鸭呼肠孤病毒(MDRV)σB蛋白为抗原免疫BALB/c雌性小鼠,按常规方法制备单克隆抗体,通过间接ELISA、Western-blot和免疫组织化学试验进行筛选及鉴定.结果显示,获得4株能够稳定分泌抗σB蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株(A3F、B2B、C3E和D2G),其亚型分别属于IgG2b、IgG2b、IgM和IgM.采用小鼠体内诱生法制备的腹水均能与MDRV的σB蛋白发生特异性反应,表明,制备的单克隆抗体能够识别天然构象的σB蛋白.     

禽呼肠孤病毒P17蛋白基因在大肠杆菌中的表达及其ELISA检测方法的建立

用设计合成的1对跨越禽呼肠孤病毒(ARV)P17非结构蛋白基因完整开放阅读框(ORF)的特异性引物,对ARV S1133株进行了RT-PCR扩增。扩增产物与pGEX-4T-1原核表达载体连接后,转化大肠杆菌BL21感受态细胞。经0.2 mmol/LIPTG诱导,表达的融合蛋白分子质量为42.4 ku,占菌体总蛋白的34%。表达产物P17蛋白经不同浓度尿素纯化后,纯度达到85%。Western-blotting显示,纯化的P17蛋白能与感染ARV的阳性血清反应,说明其具有抗原性。以此重组蛋白为包被抗原初步建立了用于鉴别检测ARV活病毒感染与灭活疫苗免疫的SPF鸡血清的ELISA。     

猕猴溶组织内阿米巴凝集素hgl基因LC3段的克隆及原核表达

为了研究动物溶组织内阿米巴基因工程疫苗,以川西猕猴溶组织内阿米巴分离株中提取的总基因组DNA为模板,扩增了hgl基因抗原区LC3段,将其重组于原核表达载体pET-32b(+)中,构建了pET-32b(+)-hglLC3表达载体,转化至大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导表达融合蛋白,获得了1200bp的hgl基因LC3编码区片段;SDS-PAGE分析结果显示,重组表达质粒产生了大小为66ku的目的条带,与预期的结果一致;Western-blot分析结果显示,重组蛋白与兔超免疫血清呈阳性反应,表明,该抗原可作为动物溶组织内阿米巴疫苗的候选抗原。     

临床分离动物源性大肠杆菌周浆蛋白AcrA表达水平的测定

为研究大肠杆菌周浆蛋白AcrA表达水平与不同动物源性大肠杆菌多重耐药水平之间的关系,将获得的重组阳性质粒pET28a(+)-acrA转化至大肠杆菌BL21(DE3)细胞中,经IPTG诱导表达,得到约42ku的目的蛋白。AcrA蛋白表达产物经侧带法纯化后免疫獭兔,制备抗AcrA的多克隆抗体,采用间接ELISA法检测临床分离的31株不同动物源性大肠杆菌中acrA基因的表达水平。结果显示,随着多数被检大肠杆菌多重耐药水平的提高,AcrA蛋白的表达量有上调的趋势。表明,动物源性大肠杆菌的多重耐药水平与AcrA蛋白的表达水平可能存在相关性。     

猪链球菌2型mrp基因ORF1序列的克隆及原核表达

根据猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白基因(mrp)的序列,设计并合成了1对特异性引物,以青海株的基因组DNA为模板扩增了mrp基因ORF1序列。将PCR产物进行了T/A克隆,转化大肠杆菌,鉴定成功获得目的片段后,将其定向亚克隆到pET-28a( )中,构建了原核表达质粒pET-28a-mrp,并将其转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中,经1 mmol/L IPTG诱导和SDS-PAGE分析,出现了与预期目的蛋白一致的外源蛋白带(27.0 ku)。Western-blot分析表明,该融合蛋白具有MRP的抗原表位。研究结果为今后开展该病的免疫学研究奠定了一定基础。     

牦牛源多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H重组亚单位疫苗对小鼠的免疫保护效果

为分析牦牛源多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H的免疫保护效果,将纯化的牦牛源多杀性巴氏杆菌重组外膜蛋白H(rOmpH)制备成疫苗,用该重组疫苗和全菌灭活疫苗皮下免疫小鼠。首免后每周采血1次,用间接ELISA方法检测其抗体动态变化,并于三免后第9天用2LD50的分离株进行攻毒,比较两者的保护力。结果显示,全菌灭活疫苗组小鼠30h后死亡率为20%,重组疫苗组小鼠30h后100%死亡,PBS对照组小鼠24h后100%死亡。结果表明,全菌灭活疫苗具有保护力,而重组蛋白疫苗保护性微弱。     

猪瘟病毒E2基因主要抗原区原核表达载体的构建及表达

用RT PCR技术对猪瘟兔化弱毒C株、石门强毒株 (Shimen)、近期地方流行的属于第 1群毒株的新疆毒株 (XJ)和第 2群代表毒株甘肃临洮 (LT)株E2基因的主要抗原区进行扩增 ,均得到约 5 6 1bp的基因片段 ;经克隆测序及序列分析 ,该基因编码 187个氨基酸残基 ,预计蛋白分子质量为 2 1.7ku。将这 4个基因分别克隆到原核表达载体 pGEX 4T 1中 ,经酶切、PCR扩增和测序分析确证其正确插入到表达载体中 ,阅读框是正确的 ,从而构建成重组表达载体。重组质粒转化至宿主菌BL2 1(DE3)中 ,用异丙基硫代 β D 半乳糖苷 (IPTG )进行诱导表达 ,对表达的蛋白用SDS PAGE电泳、免疫印迹和薄层凝胶扫描分析。结果表明 ,E2基因的主要抗原区可以在大肠埃希氏菌中表达 ,表达的蛋白多以包涵体形式存在 ,表达产物的分子质量约为 5 0 .0ku ,与理论推测的分子质量一致 ;薄层凝胶扫描分析表明 ,表达蛋白约占菌体蛋白总量的 2 0 .1% ;免疫印迹结果证明 ,表达的E2蛋白可被猪瘟阳性血清所识别。     

新城疫病毒ClassⅠ强毒株L基因的表达及单克隆抗体的制备

采用RT-PCR方法从新城疫病毒(NDV)ClassⅠ强毒株9a5b中扩增出了L基因C末端的基因片段,将其克隆到表达载体pGEX-6P-1中,测序验证后转化入表达宿主菌BL21进行IPTG诱导表达,表达的蛋白接种8周龄BALB/c小鼠,制备L蛋白的单克隆抗体,用间接免疫荧光试验(IFA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western-bolt方法共同检测所获得的抗体。结果显示,重组菌可表达出分子质量约为39ku的重组融合蛋白。SDS-PAGE分析显示,表达的蛋白以包涵体的形式存在于菌体中。多种方法筛选显示成功制备了4株单克隆抗体。免疫特异性鉴定结果表明,在所获得的单抗中,4株单抗均具有ELISA和IFA效价,且4株单抗与ClassⅠ毒株的反应均强于与ClassⅡ毒株的反应。     

结核分枝杆菌pdhA基因的原核表达及其免疫原性分析

以结核分枝杆菌H37Rv菌株的基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增出1 100bp的pdhA(pyruvate dehydrogenase E1component alpha subunit)基因,经限制性酶切后,与pET-28a载体连接,转化到大肠杆菌BL21中,重组菌经1mmol/L IPTG诱导表达了pdhA蛋白,并用Ni-His-resin纯化了目的蛋白,经Western-blot分析鉴定了目的蛋白的免疫原性。结果显示,重组质粒的双酶切鉴定和DNA测序均正确;SDS-PAGE和Western-blot分析结果显示,在44ku处获得一目的条带,且具有很好的免疫原性。本研究成功获得了高纯度的重组蛋白pdhA,为深入研究其功能奠定了基础。     

抗鹅细小病毒VP3蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

利用已构建好的pET-30a重组菌E.coli Rosetta(DE3)表达鹅细小病毒(GPV)VP3重组蛋白,经Ni-NTA亲和层析纯化后作为免疫原,经腹膜腔接种4～6周龄BALB/c小鼠3次,末次免疫后第3d取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合。用建立的间接ELISA方法进行筛选,经4次亚克隆,最终获得4株能稳定分泌抗GPVVP3单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1F1、2A9、3B11和4A2。亚类鉴定结果显示,单抗1F1为IgG2b亚型,其余3株单抗为IgG1亚型,轻链均为κ链。经间接ELISA检测,单抗1F1、2A9、3B11和4A2的腹水效价分别为1:819200、1:1638400、1:409600和1:819200。Western-blot分析表明,获得的4株单克隆抗体均能特异性识别GPVVP3重组蛋白;间接免疫荧光试验证明,这4株单抗能够与天然GPV结合。