玉米赤霉烯酮免疫检测技术研究——分泌抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

用F-2-BSA人工抗原免疫Balb/c鼠,通过淋巴细胞杂交瘤技术,建立6株分泌抗F-2毒素的McAb杂交瘤细胞株。用间接ELISA法测定,细胞上清液抗体滴度为2084~×(4H_8)、256~×(6H_9、4H_3、2H_5、2C_8)、16~×(3F_(10));腹水抗体滴度为10~(-9)(4H_3、4H_8),10~(-8)(2H_5)、10~(-7)(6H_9)、10~(-6)(2C_8)、10~(-5)(3F_(10))。用竞争间接ELISA法测定6株McAb对F-2毒素的敏感度为0.8～0.3ng/ml。该抗体与同系物(玉米赤霉烯醇)交叉反应率为9.0％～1.3％。6株McAb均属IgG类。细胞体外传代培养和冻存复苏后,分泌抗体稳定。纯化抗体在37℃保存12天稳定。     

玉米赤霉烯酮对小鼠免疫器官的毒性作用

采用腹腔注射给药方式研究了玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEA)对小鼠免疫器官的毒性作用。结果表明,连续6d注射25mg/kgZEA后,试验小鼠的胸腺指数与对照组相比显著降低(P0.05),胸腺明显萎缩,胸腺细胞出现典型的凋亡峰,脾指数降低但与对照组差异不显著(P0.05),脾淋巴细胞未见典型的凋亡峰;单次注射50mg/kgZEA48h后,胸腺细胞和脾淋巴细胞均发生细胞周期阻滞,均显著阻滞于细胞周期的G2/M期;连续3d注射50mg/kgZEA后,小鼠胸腺和脾出现病理性变化,表现为胸腺皮质减少,髓质增多,脾白髓萎缩,局灶性坏死等。证明ZEA对小鼠胸腺和脾有明显的毒害作用。     

真菌毒素玉米赤霉烯酮研究进展

真菌代谢产物引起小猪阴道炎早在1927年美国已有报道。Mckay于1952年首次从引起猪外阴道炎的霉大麦饲料中分离出禾本科镰孢。Stop等人(1962)证明禾本科镰孢的毒素对子宫具有活性;Christensen等人认为该有毒物质具有雌激素作用。Mirocha等人于1967年研究了镰孢毒素对牛的作用,发现禾本科镰孢的提取物能降低人工受精率。1963年提取出玉米赤霉烯酮(Zearalenone)纯结晶,1968年完成了该毒素的人工合成。同玉米赤霉烯酮分子结构相似的其他大环次级代谢产物也已从一些真菌中分离出来。如弯孢霉素(Curvularin),     

镰刀菌毒素玉米赤霉烯酮、T-2毒素对雏鸡体液免疫影响的研究

镰刀菌毒素主要包括玉米赤霉烯酮(Zearalenone,又称F-2雌性发情毒素)和单端孢霉烯族化合物(Trichothecenes)两大类。有关这两类毒素对畜禽免疫性能的影响,国外已有不少研究报告。但通过对这些资料的分析发现,在他们的试验中饲料的毒素含量都远远超过自然污染的量,并且试验期短。换言之,这些试验的条件与实际生产情况有很大距离。为了探讨在实际生产情况下镰刀菌毒素对畜禽免疫性能的影响,我们选用F-2和T-2(单端孢霉烯族化合物中最重要的一种)两种毒素,研究雏鸡长期低剂量摄入条件下对鸡新城疫病毒抗体滴度的影响,为提高鸡群的抗病力提供科学依据。     

玉米赤霉烯酮引起奶牛流产的研究

从引起奶牛流产的霉变饲料中检出真菌31种,涉及11个属,其中串珠镰孢每克饲料达10~5个孢子。其饲料经过提取、柱层析和薄层层析,检出真菌毒素玉米赤霉烯酮。串珠镰孢在人工培养基上产生毒素玉米赤霉烯酮,经过层析获得纯毒素。纯毒素皮下接种怀孕小白鼠,引起7/8流产。     

玉米赤霉烯酮致大鼠睾丸支持细胞DNA损伤的研究

以大鼠原代睾丸支持细胞为材料,用0(对照组)、5、10、20 mol/L的玉米赤霉烯酮(ZEA)进行染毒,24 h后,通过彗星试验观、免疫荧光试验、Western-blot等方法检测ZEA对细胞DNA及相关蛋白表达的影响。结果显示,随着ZEA浓度的增加,DNA彗星样拖尾现象逐渐明显,与对照组比较,10 mol/L和20 mol/L ZEA剂量组的细胞的彗星拖尾尾长、尾部DNA含量比例和尾矩均有极显著差异(P0.01);10 mol/L和20mol/L ZEA剂量组γ-H2AX焦点数量均较对照组有极显著差异(P0.01);各染毒组γ-H2AX、P53、P21等蛋白的表达水平均较对照组有显著或极显著差异(P0.05或P0.01)。结果表明,ZEA能致大鼠睾丸支持细胞DNA损伤,这一过程能激活P-ATM→P53→P21信号通路,促使细胞发生生长阻滞并抑制其增殖。     

β-玉米赤霉烯醇单克隆抗体的研制及CiELISA检测方法的建立

为建立一种针对β-玉米赤霉烯醇(β-ZOL)快速准确的检测方法,笔者用活性酯法将β-ZOL与牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)偶联合成人工完全抗原,纯化鉴定后免疫BALB/c小鼠。经筛选最终获得1株稳定分泌抗β-ZOL抗体的细胞株1F5。利用该抗体建立检测β-ZOL的间接竞争酶联免疫吸附试验(CiELISA)方法。结果显示,β-ZOL的药物抑制标准曲线在浓度为5～500 ng/m L时线性关系良好,标准曲线方程为y=0.406 3x-0.204 2(R~2=0.990 4),IC_(50)为53.19 ng/m L,检测下限(LOD)为6 ng/m L。该单克隆抗体对β-ZOL的抑制率为100%,与α-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉烯酮、β-雌二醇、呕吐毒素、伏马毒素等基本无交叉反应。牛奶样品β-ZOL添加回收试验显示,β-ZOL的回收率为91.24%～110.07%,变异系数为6.17%～8.73%。说明建立的检测β-ZOL的CiELISA方法稳定可靠。     

白藜芦醇对玉米赤霉烯酮致TM4细胞氧化损伤及凋亡的保护作用

为探究白藜芦醇(RSV)对玉米赤霉烯酮(ZEA)致睾丸支持细胞氧化损伤及凋亡的保护作用,以小鼠睾丸支持细胞系TM4细胞为研究对象,分别设对照组、ZEA组(20μmol/L)、RSV组(5μmol/L)、ZEA+RSV组(5μmol/L RSV处理30 min后+20μmol/L ZEA),24 h后,通过CCK-8法检测细胞活力,流式细胞术检测ROS水平和细胞凋亡率,试剂盒检测细胞内MDA含量和SOD活力,免疫荧光法结合流式细胞术检测线粒体膜电位(ΔΨm)变化,Western-blot检测Fas/FasL通路相关蛋白表达。结果显示,与对照组相比,ZEA极显著抑制TM4细胞活性(P0.01),增加细胞凋亡率及提高ROS、SOD和MDA水平(P0.01),并能够显著增加Fas/FasL信号通路相关蛋白FasL、FADD、Cleaved-caspase8的表达水平(P0.05),极显著增加Fas的表达水平(P0.01);与ZEA组相比,ZEA+RSV组细胞活力显著提高(P0.05),细胞凋亡率和SOD水平显著降低(P0.05),ROS和MDA水平极显著下降(P0.01),Fas、FasL表达下调(P0.01和P0.05)。结果表明,RSV可有效减轻ZEA对小鼠睾丸支持细胞的氧化损伤作用,并能够通过调控Fas/FasL通路缓解ZEA诱导的睾丸支持细胞凋亡。     

玉米赤霉烯酮对大鼠睾丸支持细胞Fas/FasL凋亡信号通路的影响

为探讨玉米赤霉烯酮(zearalenon,ZEA)诱导睾丸支持细胞(sertoli cell,SC)凋亡的影响,试验以分离大鼠原代SC为材料,不同浓度ZEA处理SC 24 h,采用CCK-8法观察支持细胞活力的变化,流式细胞术检测细胞凋亡率的影响,q RT-PCR检测Fas、Fas L转录水平的变化,Western-blot法检测Fas、Fas L等凋亡相关蛋白表达的情况。结果显示,与对照组相比,随着ZEA浓度的升高,睾丸支持细胞的活力受到明显的抑制(P0.05或P0.01);流式细胞术检测结果显示,与对照组相比,10、20 mol/L ZEA染毒组细胞凋亡率呈极显著升高(P0.01);q RT-PCR结果分析显示,10、20 mol/L染毒组细胞Fas和Fas L转录水平呈显著或极显著升高(P0.05或P0.01);凋亡相关蛋白检测结果显示,与对照组相比,5 mol/L以上ZEA染毒组Fas、Fas L、FADD、Cleaved-caspase8、Cleaved-caspase3蛋白表达均出现显著或极显著性升高(P0.05或P0.01)。结果表明,ZEA可以通过Fas/Fas L途径诱导睾丸支持细胞发生凋亡。     

ERK信号在玉米赤霉烯酮诱导的睾丸支持细胞自噬中作用的研究

为探讨玉米赤霉烯酮(ZEA)雄性生殖毒性作用机理,本试验以睾丸支持细胞TM4细胞系为对象,研究了ZEA对睾丸支持细胞自噬及相关信号通路的影响。试验分别以浓度为0、0.1、1、10、20、30 mol/L的ZEA进行染毒,24 h后,利用CCK-8、激光共聚焦,透射电镜、Western-blot等技术检测了ZEA对TM4细胞的存活率、自噬,MAPK信号通路的影响以及MAPK信号通路与自噬的相互关系。免疫荧光结果显示,随着ZEA浓度的升高,TM4细胞内LC3聚点数量显著升高,酸性囊泡的个数增多;Western-blot结果显示,自噬相关蛋白LC3Ⅱ、Beclin-1、ATG5、ATG7表达显著升高,而P62蛋白表达显著下降(P0.05或P0.01);MAPK信号通路中ERK1/2磷酸化水平显著升高(P0.05或P0.01),加入ERK磷酸化抑制剂U0126后,ZEA诱导TM4自噬水平显著下降(P0.05或P0.01)。结果表明,在一定浓度范围内,玉米赤霉烯酮可以诱导TM4细胞产生自噬,且发生自噬与ERK信号通路激活有关。     

动物玉米霉烯酮中毒研究进展

动物玉米霉烯酮中毒研究进展张云德（中国农业科学院兰州兽医研究所７３００４６）ＭｃＮｕｔｔ等（１９２８）首次报道了霉玉米中有一种雌激素因子。ｓｔｏｂ等（１９６２）从玉米赤霉污染的玉米中分离出一种子宫营养性化合物，Ｕｒｒｙ等（１９６６）对该化合物进行了研...     

分泌抗赭曲霉素A单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

用赭曲霉素A(OA)-BSA合成抗原免疫Balb/c小鼠,取免疫鼠脾细胞与sp2/0细胞融合。通过克隆和ELISA法筛选,建立三株分泌抗OA单克隆抗体杂交瘤细胞株(3C_(12)、1D_(12)和2G_7)。用间接ELISA法测定,细胞上清液抗体效价为128~χ(3C_(12))和64~χ(1D_(12)和2G_7),腹水抗体效价为10~(-7)(3C_(12)、1D_(12))和10~(-6)(2G_7)。三株单抗(McAb)'均属IgG类,分泌抗体稳定。用竞争间接ELISA测定三株McAb对OA的敏感性为22.5～39.2ng/ml,与异种毒素黄曲霉毒素B_1和ZEN毒素无交叉反应。     

玉米赤霉烯酮和脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其联合染毒对小鼠肝氧化损伤的研究

将成年雌性昆明小鼠360只随机分为9组,即空白对照组、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)1.5mg/kg(按体重给药,下同)给药组、DON 2.5mg/kg给药组、玉米赤霉烯酮(ZEA)20mg/kg给药组、ZEA30mg/kg给药组、DON 1.5mg/kg+ZEA 20mg/kg给药组、DON 1.5mg/kg+ZEA 30mg/kg给药组、DON 2.5mg/kg+ZEA 20mg/kg给药组、DON 2.5mg/kg+ZEA 30mg/kg给药组,每天腹腔注射1次,每次200μL,连续注射4d。分别在试验的第0、3、5、8、12天测定小鼠肝组织中MDA含量、抑制OH-能力、TAOC、GSH-Px活性和SOD活性。结果,ZEA或/和DON染毒均导致小鼠肝MDA含量明显升高,抑制OH-能力、T-AOC、GSH-Px活性和SOD活性明显降低(P0.05或P0.01),具有明显的染毒剂量和染毒时间依赖效应。结果表明,联合染毒具有互作效应或亚加性效应,其中以2.5mg/kg DON与30mg/kg ZEA联合染毒所呈现的亚加性效应最明显。     

F-2毒素检测方法的研究——F-2的光谱分析

1986年我们从饲料中分离出引起奶牛流产的物质,其生物学特性及薄层色谱特征均被证明为F-2毒素。该物质分离的纯品进一步通过光谱分析,也确定为F-2。材料与方法(一)F-2样品的制备1.菌种:QFM-1和QFG-1。2.培养方法:大米50g加40％水,分装500ml三角瓶内,121℃高压灭菌30分钟,冷却后接上述菌种,27℃培养14天,15℃培养21天,25℃再培养14天。培养物取出后65℃烘干,球磨机粉碎后备用。3.提取制备F-2纯品:用正己烷和三氯甲烷提取,经离心薄层层析仪分离(以TO:TC:A=3:15:1 V/V/V为展开洗脱剂),刮取转子硅     

乳牛孕酮人工抗原的制备与鉴定

采用二环己基碳化二亚胺偶联法将孕酮-11α-半琥珀酸酯(11-αOH-P4-HS)分别与牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)载体偶联,制备乳牛孕酮人工抗原P4-BSA和P4-OVA,并用SDS-PAGE对制备的人工抗原进行测定。再用制备的人工免疫抗原P4-BSA免疫BALB/c小鼠制备免疫血清。用P4-OVA作为ELISA检测抗原,方阵滴定法确定检测抗原的最佳包被浓度,间接ELISA测定免疫血清中抗体的特异性及效价。结果表明,成功制备了乳牛孕酮人工抗原,P4-OVA的最佳包被浓度为5.82×10-5ng/mL,最佳封闭液为50 mL/L的羊血清,免疫血清具有良好的特异性。     

环丙沙星在霉形体性肺炎猪体内的组织药代动力学研究

将21头健康杜洛克×长白×大白杂交猪复制成霉形体性肺炎模型后,分别肌肉注射环丙沙星(5.0 mg/kg)进行组织及血浆药代动力学研究。结果显示,环丙沙星在感染猪肺中的浓度-时间数据适合一级吸收二室开放模型,外观正常肺与外观实变肺的主要参数分别是:t1/2Ka为0.19和0.46 h,t1/2α为2.68和2.52 h,t1/2β为8.12和6.87 h,tmax为1.10和1.47 h,Cmax为6.00和4.46μg/g,AUC为38.65和33.33mg/(L.h),Tcp(ther)为57.10和50.59 h。气管、支气管组织中的药物浓度-时间数据适合一级吸收一室开放模型,主要参数分别是:t1/2Ka为0.56和0.38 h,t1/2ke为5.68和5.67 h,tmax为2.08和1.60 h,Cmax为3.73和2.62μg/g,AUC为39.44和26.10 mg/(L.h),Tcp(ther)为50.60和47.16 h。表明,环丙沙星对霉形体性肺炎猪呼吸道组织具有良好的穿透性,组织药物浓度明显高于血浆药物浓度,且消除缓慢。     

PCR检测鸡毒霉形体和鸡滑液囊霉形体的研究

根据禽霉形体 16SrRNA的基因序列设计、合成了 1对引物 ,用这对引物对鸡毒霉形体 (Mycoplasmagallisep ticum ,MG)和鸡滑液囊霉形体 (Mycoplasmasynoviae ,MS)菌株DNA进行PCR扩增 ,得到了与预期大小相一致的约 5 80bp的PCR产物 ,而这对引物对其他禽病病原DNA或RNA模板的扩增结果为阴性。PCR方法对MG和MS的最小检出量分别为 2 pg和 3pg。应用已建立的PCR方法检测MG人工感染样品和临床样品 ,从人工感染样品中均检测到MG ,临床样品的MG阳性检出率为 10 .2 5 % ,高于常规分离培养的阳性检出率     

小山羊腺垂体—甲状腺轴内分泌活动的季节及昼夜动态研究

用RIA法对6只6～15月龄去势沙能公山羊血清中T_3、T_4和TSH含量的季节及昼夜变化的测定表明,血清中T_3的年均含量1.709±0.45ng/ml,T_4 113.315±7.60ng/ml,TSH3.199±1.02μIU/ml。冬季含量最高,昼夜均值T_3 2.259±0.18ng/ml,T_4 168.671±12.84ng/ml,TSH4.454±0.34μIU/ml。春秋次之,夏季含量最低,日均值T_3 1.208±0.17ng/ml,T_4 63.495±6.38ng/ml,TSH2.078±0.59μIU/ml。三种激素的季节含量变化有极显著的季节差异(P<0.01),且含量变化是同步平行的,与外界气温升降成负相关,与动物机体代谢成正相关。T_3、T_4和TSH含量的昼夜变化无明显差异(P>0.05)。T_3、T_4含量的昼夜变化是同步平行的,而TSH的昼夜变化则不与T_3、T_4同步。山羊血清中T_3、T_4和TSH含量在多数个体间有明显差别。     

鸡源霉形体的分离和鉴定

对乌鲁木齐市 2个大型鸡场鸡毒霉形体 (Mycoplasmagallisepticum ,MG)、滑液囊霉形体 (M .synoviae ,MS)感染情况用血清平板凝集试验 (SPA)进行了血清学抽样调查。结果表明 ,凝集抗体的阳性率分别为 6 6 .92 %和 35 .90 %,其中商品鸡场MG和MS的阳性率分别为 82 .5 0 %和 5 2 .5 0 %。从疑似MG、MS感染鸡的气管、肺、气囊、鼻裂和跗关节腔分离到 19株分离物。经初步鉴定 ,分离物均为霉形体属成员。用生化和血清学及其他生物学方法 ,对这些分离物进行了鉴定。结果 6株为MG ,3株为MS ,其余 10株也属于霉形体。     

猪肺炎霉形体单克隆抗体的制备与鉴定

用KM 2培养基 (含马血清 )培养猪肺炎霉形体 (Mhp)ZCF2 3株 ,对培养物高速离心 ,用PBS悬浮 ,反复冻融裂解后作为免疫原 ,腹腔注射免疫BALB/c小鼠。利用淋巴细胞杂交瘤技术获得了 5株分泌特异性抗体的单克隆抗体细胞株 ,分别命名为 11C6、14C11、11B6 1、10C11 2和12E7 1。生物学特性鉴定结果表明 ,5株腹水单克隆抗体的间接ELISA效价均在 1∶10 0 0 0左右 ;免疫球蛋白亚类均为IgG3;免疫印迹结果显示 ,5株单克隆抗体所针对的抗原表位在 90、4 0、70和6 0ku左右的蛋白分子上 ,均不与马血清蛋白反应 ,说明这些单克隆抗体均是针对Mhp蛋白的特异性单克隆抗体。