牛肌肉生成抑制素基因真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

将构建的牛pMD 18-T-MSTN克隆载体与真核表达载体pef-dhfr1a酶切,回收牛MSTN目的片段及pef-dhfr1a载体,构建了牛MSTN基因的真核表达质粒pef-dhfr1a-MSTN,然后转染COS-7细胞,将牛MSTN成熟蛋白编码序列在COS-7细胞中进行了表达。提取转染细胞的总RNA,采用RT-PCR和Western-blotting方法,分别从mRNA水平和蛋白质水平上检测到了牛MSTN基因在COS-7细胞中的表达产物,证明已经成功构建出该基因的真核表达载体。     

乳牛子宫内膜抗菌肽BNBD5基因的克隆及其原核表达

为研发防治乳牛子宫内膜炎的抗菌肽生物制剂,根据已发表的牛抗菌肽基因序列设计了1对引物,用试剂盒提取乳牛新鲜子宫内膜总RNA,经RT-PCR扩增,将克隆的抗菌肽BNBD5基因全长编码区的cDNA连接到原核表达载体pET30a中,经IPTG诱导原核表达,通过Western-blot检测融合蛋白BNBD5的表达水平.结果表明,RT-PCR扩增出的cDNA片段长138 bp,编码45个氨基酸的多肽,多肽中合6个保守半胱氨酸残基.用Blast程序进行检索比较显示,克隆出了牛防御素家族成员BNBD5基因,并成功构建了pET30a-BNBD5载体,经IPTG诱导,pET30a-BNBD5原核表达产物的相对分子质量约为10 ku,与预期的融合蛋白大小一致,证实构建的重组质粒能够在大肠杆菌中表达.     

环形泰勒虫裂殖体表面蛋白基因高免疫原性区片段的克隆及其表达

根据环形泰勒虫TaA12 72 1株裂殖体表面抗原 (TaSP)基因的序列设计了 1对引物 ,用PCR扩增出该基因长为 393bp的高免疫原性区片段 (SBxp)。将扩增产物连接到 pGEM TEasy载体上 ,转化入大肠埃希氏菌JM 10 9中进行克隆。随后将重组质粒 pGEM SBxp和表达载体 pGEX 4T 1分别以BamHⅠ、XhoⅠ酶切后 ,将酶切的目的片段SBxp亚克隆到原核表达载体中构建了重组表达载体 pGEX 4T 1 SBxp ,并将其转化到BL2 1宿主菌中。提取重组质粒经BamHⅠ、XhoⅠ酶切、PCR鉴定和测序确证后 ,阳性克隆用IPTG诱导表达。收集不同时间的菌液进行SDS PAGE电泳和Westernblotting检测。结果 ,SBxp基因在大肠埃希氏菌中成功表达 ,其表达产物为分子质量 4 3ku的融合蛋白 ,该产物能被牛环形泰勒虫阳性血清所识别。     

牛分支杆菌MPT83基因的表达及重组蛋白的纯化

从牛分支杆菌培养物中抽提总DNA,扩增了MPT83基因,并克隆入pMD 18-T Simple Vector,将测序正确的目的基因插入表达载体pET-32a( )中,转化BL21(DE3)宿主菌,IPTG诱导表达,用亲和层析方法对表达蛋白进行了纯化。经测序,构建的克隆质粒pMD-MPT83与Gen- Bank中的序列一致;构建的表达质粒pET-MPT83经PCR和BamHⅠ HindⅢ双酶切鉴定构建正确;经SDS-PAGE分析,在约42 ku处出现新的蛋白条带,4 h后表达量即达到高峰;Western- blotting分析表明,融合蛋白能够被牛分支杆菌阳性血清所识别;纯化的表达蛋白经SDS-PAGE电泳,出现清晰的单一条带。表明MPT83基因原核表达载体构建成功。     

猪肌生成抑制素基因成熟蛋白编码序列表达载体的构建及其转录水平的检测

构建猪肌生成抑制素 (MSTN)成熟蛋白编码序列的克隆与表达载体 ,并对mRNA进行转录水平的检测 ,为获得较好的猪肌生成抑制素抗原、制备抗体打下良好的基础。猪MSTN基因的cDNA去除信号肽后 ,用PCR扩增的 1.2kb目的片段与 pMD18 T载体连接 ,将克隆载体的质粒DNA与同样用BamHⅠ和SalⅠ限制性内切酶酶解的表达载体 pET2 8a(+ )质粒定向连接 ,对筛选出的阳性克隆用酶切及测序法鉴定。对猪MSTN基因成熟蛋白编码序列进行反转录 ,对mRNANorthern杂交进行转录水平的检测。结果 ,所得到的序列与所设计的序列完全一致 ,表明成功地进行了猪MSTN基因编码序列的克隆及筛选 ;目的片段定向插入 ,阅读框架正确 ;RT PCR成功地反转录得到约 1.2kb的目的DNA片段 ,Northern杂交后对mRNA印迹放射自显影 ,见到清晰的 1.2kb特异带     

鸽源新城疫病毒F基因的克隆与原核表达

采用RT-PCR方法扩增了鸽源新城疫病毒F基因并将其克隆至pMD18-T载体,测定其核苷酸序列。根据F基因CDS序列,设计原核表达引物,扩增F基因功能区片段,并构建了重组原核表达质粒pGEX4T-1-NDV F(924),在不同时间和温度下进行诱导表达。通过SDS-PAGE检测,目的基因表达出约60ku的融合蛋白,主要以包涵体形式存在,表达目的蛋白的最佳诱导时间为6h,最佳诱导温度为42℃;提取并纯化包涵体蛋白,用其免疫BALB/c小鼠,采小鼠血进行ELISA检测。结果显示,表达蛋白具有良好的免疫原性和反应原性。上述结果表明,缺失疏水区的F基因可以在大肠杆菌BL21(DE3)中获得表达,表达的重组F蛋白具有良好的免疫原性和反应原性。     

鸡传染性贫血病毒VP1基因的克隆表达及抗原性分析

参考已发表的鸡传染性贫血病毒(CIAV)VP1基因序列,设计并合成了2对引物,经PCR扩增获得了2个基因片段。将PCR产物克隆至pGEM-T Easy载体中,成功构建了克隆载体pGEM-CIAVVP1A和pGEM-CIAVVP1B。将上述重组质粒和原核表达载体pMXB10分别用NdeⅠ+EcoRⅠ、NdeⅠ+XhoⅠ双酶切,并将纯化的2个基因亚克隆至pMXB10中,构建出原核表达载体pMXB10-VP1A和pMXB10-VP1B。在0.3 mmol/L IPTG诱导下,目的基因在大肠杆菌ER2566中以分泌型得到了大量表达。Western-blot分析发现,表达蛋白具有CIAV抗原性。表达蛋白经纯化后作为包被抗原,用间接ELISA鉴定,与CIAV阳性血清均能发生特异性反应。2组蛋白免疫SPF鸡后,用全病毒ELISA试剂盒检测血清呈阳性,表明2组蛋白均可诱发机体产生抗CIAV的抗体。     

马尔他布氏杆菌divK基因的克隆与原核表达

为了克隆马尔他布氏杆菌M 5-90株divK基因并对其进行原核表达,根据GenBank中M5-90株divK基因序列,设计了1对引物;以此菌株的基因组为模板,用设计的引物扩增出了372 bp的基因片段。用凝胶回收纯化目的基因片段,并将其与pMD 20-T载体连接,转化大肠杆菌(E.coli)DH 5α后测序;测序正确后将此基因片段克隆到pET-28a(+),构建重组质粒pET28a(+)-divK;然后,把构建好的重组质粒转化入E.coli BL 21(DE3)。1 mmol/L IPTG诱导后,SDS-PAGE和Western-blot分析的结果表明,诱导表达的蛋白与目的蛋白的大小一致,说明本研究成功构建了pET28a(+)-divk原核表达载体,并在E.coli BL21中成功表达了divK基因。     

小反刍兽疫病毒F基因真核载体的构建与表达

根据GenBank中小反刍兽疫病毒(Nigeria 75/I株)F基因序列设计了引物,应用RT-PCR方法获得了目的基因,纯化回收后将其连接到克隆载体pMD18-T上.将鉴定与序列测定后的目的基因再克隆到真核表达载体pEGFP-N1上,经过鉴定,成功构建了含有小反刍兽疫病毒F基因的真核细胞表达栽体pEGFP-N1-F.利用脂质体介导阳性pEGFP-N1-F质粒转染了BHK-21细胞.Western-blotting证实,表达的pEGFP-N1-F融合蛋白(90 ku)具有免疫活性.     

边缘无浆体MSP5蛋白基因的克隆及原核表达

参照已发表的边缘无浆体主要表面蛋白5(MSP5)基因的核苷酸序列,设计了1对特异性引物,以边缘无浆体基因组DNA为模板,采用PCR技术扩增获得了MSP5蛋白基因。将其克隆到pGEM-T Easy载体,并进行测序分析。结果表明,克隆的MSP5基因与GenBank上登录的Florida株MSP5蛋白基因的序列同源性达98.6%,编码氨基酸的同源性为99.0%,并且该序列包含有完整的开放阅读框,大小为633 bp。将该基因亚克隆入原核表达载体pGEX-4T-1,构建了重组原核表达载体。将其转化到DH5α宿主菌中,用IPTG进行诱导表达,实现了融合表达,表达产物的分子质量为45 ku。Western-blot分析表明,此表达产物能够被抗边缘无浆体阳性血清所识别。     

皮蝇Hypodermin C基因的克隆及重组表达载体的构建

参照牛皮蝇HypoderminC(HC)基因的核苷酸序列 ,设计了 1对引物 ,以牛皮蝇总RNA为模板 ,用RT PCR扩增了牛皮蝇HC基因 ,将扩增基因进行克隆测序。测序结果表明 ,所获得基因与已知序列同源性达 99.4 5 %。同时 ,将该基因与表达载体 pGEX 4T 1连接 ,构建并获得阳性重组表达载体。     

猪大肠杆菌不耐热肠毒素LTB基因的克隆及原核表达

从河北省部分地区病猪中分离大肠杆菌,根据GenBank中登录的大肠杆菌不耐热肠毒素B亚基(LTB)基因序列,设计了1对引物,采用PCR技术扩增LTB的编码基因,得到一条375bp的片段。将其连入Simple-T载体中,经酶切、PCR及序列测定法进行鉴定。测序正确后,将该基因插入到pET-28a(+)载体中构建原核表达载体,将此重组质粒转化到Rosetta(DE3)感受态细胞中,并用IPTG诱导,将诱导产物用SDS-PAGE和Western-blot进行分析。结果显示,LTB基因可以在大肠杆菌中获得表达,表达产物分子质量约为14ku,与预计的蛋白分子质量大小一致。Western-blot分析表明,该蛋白可以与大肠杆菌免疫血清产生特异性结合反应,具有良好的抗原性,为大肠杆菌亚单位疫苗的研究奠定了基础。     

致猪水肿病大肠杆菌标准菌株F107/86 fedA基因的克隆与原核表达

以致猪水肿病大肠杆菌标准菌株F107/86的基因组DNA为模板,对去掉信号肽的456bp的fe-dA基因进行了PCR扩增,将其克隆到原核表达载体pGEX-6P-1的BamHⅠ与EcoRⅠ位点之间,经酶切鉴定与测序,在大肠杆菌中以IPTG诱导表达,并对表达产物用SDS-PAGE和Western-blot分析进行验证。结果表明,筛选出的阳性质粒pGEX-fedA-2(pfedA)经测序并与GenBank中收录的M61713序列进行比较,证明插入序列及读码框正确;表达产物GST-FedA经SDS-PAGE分析大小约42.4ku,Western-blot分析证实其具有良好的反应原性。所构建的原核表达载体可大量表达抗原蛋白,为进一步研究猪水肿病亚单位疫苗奠定了基础。     

猪传染性胃肠炎病毒S基因A抗原位点序列的克隆与原核表达

将RT-PCR扩增的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因A抗原位点目的片段克隆、双酶切后连接于表达载体,经酶切、PCR和测序鉴定的阳性重组质粒转化BL21(DE3),用IPTG诱导,进行SDS-PAGE和Western-blotting分析,确定目的蛋白的原核表达情况和免疫特异性。结果显示,目的片段的大小为534bp,序列分析表明,该基因与其他TGEV相应基因具有很高的同源性;Western-blotting检测可见分子质量约43 ku的融合蛋白条带,表明,该蛋白具有良好的反应原性。     

鸡毒霉形体H3株TM-1基因的克隆与序列分析

对鸡毒霉形体内蒙古分离株H3 株的TM 1基因进行了克隆和序列分析。根据巳发表的MGS6株TM 1蛋白基因序列分析设计了 1对引物 ,以H3 株DNA为模板进行PCR扩增 ,得到约 0 .8kb的片段 ,将该产物克隆到pUCm T载体上 ,得到重组质粒。经Kieser法、质粒PCR法、PstⅠ单酶切等方法鉴定后 ,测定H3 株TM 1基因序列 ,并与已知S6株TM 1基因序列进行了比较 ,结果表明 ,MGH3 株与S6株TM 1基因核苷酸序列同一性为 96.5 7% ,氨基酸同一性为95 .42 %。这些结果为进一步研究MGH3 株的基因免疫和基因工程疫苗等奠定了基础     

伪狂犬病病毒Min-A株糖蛋白gE基因真核表达质粒的构建

根据已发表的伪狂犬病病毒 (PRV)Rice株的 gE基因序列设计了 1对引物 ,用PCR法特异性地扩增出了PRVMin A株的 gE基因 ,并克隆到 pUC19中 ,再与杆状病毒转座质粒pFastBac1连接得到 pFastBac gE ,pFastBac gE转化穿梭载体Bacmid ,得到了重组rBacmid gE表达载体     

鸭源H9N2亚型流感病毒NS基因的克隆及表达

根据GenBank中收录的H9N2亚型流感病毒的NS基因序列设计合成了 1对引物NSU/NSL ,利用RT PCR扩增出了H9N2株NS基因 ;将该基因片段克隆到 pMD 18 T载体上 ,并对所得到的重组质粒进行酶切分析及序列测定。结果 ,获得了NS基因片段的阳性重组子 ,扩增的NS基因包含NS1基因完整的阅读框架和部分NS2基因 ,其序列与GenBank中收录的其他分离株NS基因比较 ,同源性达 96 %～ 99%。再将克隆的NS基因插入到原核表达载体 pET 2 8a后 ,转化E .coliBL2 1(DE3)感受态细胞 ,在IPTG诱导下获得了预期的蛋白表达 ,所表达蛋白质的分子质量约为 30ku。