鸡IL-18对禽多杀性巴氏杆菌DNA疫苗的免疫佐剂作用

为了探索鸡IL-18在禽多杀性巴氏杆菌H基因DNA疫苗中的免疫佐剂作用,分别用共表达鸡IL-18基因和禽多杀性巴氏杆菌C48-1H基因的DNA疫苗、鸡IL-18真核表达质粒pcDNA3/cIL-18与禽多杀性巴氏杆菌C48-1H基因的DNA疫苗混合物、禽多杀性巴氏杆菌C48-1H基因的DNA疫苗肌肉注射5周龄鸡,首免后每周采取外周血及外周抗凝血,应用ELISA和MTT法分别检测免疫鸡的体液免疫及细胞免疫水平。二免后第2周用10 LD50禽多杀性巴氏杆菌强毒菌株C48-1进行攻击。结果鸡IL-18能够明显增强禽多杀性巴氏杆菌H基因DNA疫苗的免疫原性,显著提高免疫鸡的体液免疫和细胞免疫水平,并且鸡IL-18与禽多杀性巴氏杆菌H基因共表达时的免疫佐剂作用最强,能强有力地抵抗强毒菌株C48-1的致死性攻击。结果表明,鸡IL-18可作为DNA疫苗的一种理想的免疫佐剂。     

28株禽源多杀性巴氏杆菌热浸抗原的分型研究

多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)是禽出血性败血症(即禽霍乱)的病原体,其抗原结构甚为复杂。中国兽药监察所以及河北、四川、吉林、广东等地对我国禽源多杀性巴氏杆菌的K、O抗原进行了大量的分析研究,确认我国各地绝大多数的禽源多杀性巴氏杆菌的O抗原为5,K抗原为A,( 5:A),但利用琼脂扩散法(Agar diffusion method)鉴定禽源多杀性巴氏杆菌的热浸抗原的分析研究,报道较少。我们参考Heddleston的研究方法,对28株禽源多杀性巴氏杆菌进行了琼扩分型鉴定,以了解我国禽源多杀性巴氏杆菌的血清型,为进一步研究各种分型方法的关系以及为研制理想的禽霍乱菌苗提供理论根据。     

猪源多杀性巴氏杆菌的分离与鉴定

2014年3月至2015年2月从来源于全国15个省份的180份临床猪肺组织样品中共分离到71株多杀性巴氏杆菌,分离率为39.4%。利用PCR技术对所分离的多杀性巴氏杆菌进行荚膜血清型鉴定,其中A型菌株41株(占57.8%),D型菌株27株(占38.0%),F型菌株3株(占4.2%),71株多杀性巴氏杆菌中包括1株D型产毒素多杀性巴氏杆菌(占1.4%),说明当前在我国猪群中流行的多杀性巴氏杆菌主要为A型和D型菌株。应用PCR检测多杀性巴氏杆菌23种毒力基因,结果显示:多杀性巴氏杆菌毒力基因的数量大多分布在15~19之间,平均携带个数为17.5个;23种毒力基因中,ptfA,fimA,hsf-2,sodA,sodC,ompA,ompH,oma87,plpB,exbB,tonB,Fur,hgbB的检出率在90%以上,而toxA基因的检出率极低(1.4%),并且在猪源多杀性巴氏杆菌中未检测到t bpA的存在;分析毒力基因在不同血清型菌株中的携带及分布情况发现,A型的平均毒力基因携带数为18.2个,D型为16.4个;不同毒力基因在不同血清型的多杀性巴氏杆菌中的分布也存在一定的差异,其中唾液酸代谢酶基因nanB、透明质酸酶基因pmHAS及黏附基因tadD和pfhA在A型多杀性巴氏杆菌中的检出率高于其在D型多杀性巴氏杆菌中的检出率(P0.01);而黏附基因hsf-1在D型多杀性巴氏杆菌的检出率显著高于其在A型多杀性巴氏杆菌中的检出率(P0.01)。对所分离菌株的16SrRNA基因进行测序,并与NCBI上公布的10株多杀性巴氏杆菌16S rRNA基因进行进化树分析,结果显示:71株多杀性巴氏杆菌主要分为2个亚群,亚群Ⅰ和HB03及3480的亲缘关系较近,而亚群Ⅱ则与HN06、Pm70、36950等菌株的亲缘关系较近;遗传进化的结果说明,多杀性巴氏杆菌的亲缘关系与其来源、血清型及其导致的疾病种类并没有表现出特定的亲缘关系。     

禽多杀性巴氏杆菌C48-1成熟外膜蛋白H重组亚单位设苗免疫效果的研究

将融合表达禽多杀性巴氏杆菌成熟外膜蛋白H(OmpmH)的重组菌pGEX-ompmH/BL21大量培养,在最佳诱导条件下诱导表达,表达产物经蛋白酶剪切及亲和层析纯化,得到OmpmH基因的原核表达产物,将其与弗氏完全佐剂混合制成油乳剂亚单位疫苗,用该疫苗肌肉注射接种5周龄鸡,首免后每周采血检测抗体,二免后第2周用10 LD50禽多杀性巴氏杆菌强毒菌株C48-1进行攻击.结果显示,OmpmH具有良好的免疫原性,能诱导鸡体产生特异性抗体,可抵抗强毒菌株C48-1的致死性攻击,免疫效果优于禽多杀性巴氏杆菌弱毒疫苗.     

禽多杀性巴氏杆菌C_(48-1)成熟外膜蛋白H重组亚单位疫苗免疫效果的研究

将融合表达禽多杀性巴氏杆菌成熟外膜蛋白H(OmpmH)的重组菌pGEX-ompmH／ BL21大量培养,在最佳诱导条件下诱导表达,表达产物经蛋白酶剪切及亲和层析纯化,得到Ompm H基因的原核表达产物,将其与弗氏完全佐剂混合制成油乳剂亚单位疫苗,用该疫苗肌肉注射接种5周龄鸡,首免后每周采血检测抗体,二免后第2周用10 LD50禽多杀性巴氏杆菌强毒菌株C48-1 进行攻击。结果显示,OmpmH具有良好的免疫原性,能诱导鸡体产生特异性抗体,可抵抗强毒菌株C48-1的致死性攻击,免疫效果优于禽多杀性巴氏杆菌弱毒疫苗。     

禽多杀性巴氏杆菌亚单位成分的免疫原性研究

禽多杀性巴氏杆菌是禽霍乱的病原,该病对养禽业危害较大,目前尚无理想的免疫制剂。学者们在筛选弱毒苗和研制灭能苗的同时,在研制禽多杀性巴氏杆菌亚单位苗方面作了一些尝试,为禽霍乱的免疫研究开辟了一条新路。本文就其亚单位成分的免疫原性、诱导产生保护作用及血清学反应等加以阐述。     

西藏八一镇雏鸭多杀性巴氏杆菌病的调查

西藏八一镇雏鸭多杀性巴氏杆菌病的调查佘永新（西藏农牧学院林芝８６００００）近年来，随着西藏地区养禽业的迅速发展，禽病的流行亦日趋严重，其中以多杀性巴氏杆菌引起的禽霍乱为危害当地养育业的主要传染病之一。其特点是具有高度传染性和死亡率，常呈毁灭性爆发流行...     

禽多杀性巴氏杆菌不同抗原成分致敏绵羊红细胞的试验

禽多杀性巴氏杆菌不同抗原成分致敏绵羊红细胞的试验韩雪清，梁惠珍，刘湘涛，李彦敏，朱有福（中国农业科学院兰州兽医研究所７３００４６）刘湘涛等对禽多杀性巴氏杆菌（ＰＭ）不同抗原成分的分析，认为ＰＭ的优势抗原富集于荚膜和胞质离心１１００００ｇ上清中。本试验...     

多杀性巴氏杆菌prfA基因的序列分析与原核表达

为探索多杀性巴氏杆菌的致病机理,采用PCR方法分别扩增了家兔源和禽源多杀性巴氏杆菌C51-17、Pm898、Pm8916、Pm901、Pm9616、PmZM、PmQin菌株的prfA基因,并对其进行序列分析。将C51-17株的prfA基因克隆到质粒pET30a中,将重组表达载体pET30a-prfA转化到大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞中,经IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE分析和Western-blot分析。结果显示,这7株菌株与GenBank登录的3株多杀性巴氏杆菌之间prfA基因在核苷酸水平上的同源性为95.6%~100%,在氨基酸水平上的同源性为98.9%~100%。诱导表达的重组蛋白PrfA的分子质量约为45.6ku,与预期的大小一致,以可溶性形式表达。重组蛋白PrfA可与家兔抗多杀性巴氏杆菌阳性血清反应,具有良好的反应原性。     

禽霍乱荚膜多糖菌苗的研究——菌苗制造与品质测定

禽霍乱(Fowl Cholera)是当前危害养禽业发展的重要疫病之一。由于引起该病的多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)的抗原结构极为复杂,免疫机制不甚清楚。我们于1981年对禽源多杀性巴氏杆菌的荚膜物质的免疫原性进行了初步研究,证实多杀性巴氏杆菌的荚膜物质具有良好的抗原性,是建立特异性免疫的重要物质。并于1982年在对研制本菌苗所使用的菌种、提取荚膜物质的方法、筛选适当的佐剂等研究的基础上,进一步对本菌苗的制造工艺流程、质量检测进行了研究。     

禽多杀性巴氏杆菌荚膜多糖—蛋白复合物对鸭的安全性和免疫原性试验

禽霍乱又称禽出败,是由多杀性巴氏杆菌引起的禽类的一种急性败血性传染病。对养禽业危害较大。我国迄今虽研制出多种禽霍乱灭活苗和弱毒苗,对控制本病流行起到了一定的作用,但安全性、稳定性及免疫期仍不够理想。多年来国外对禽巴氏杆菌荚膜抗原     

溶血性曼氏杆菌和多杀性巴氏杆菌双重PCR检测方法的建立及应用

本研究旨在建立溶血性曼氏杆菌与多杀性巴氏杆菌的双重PCR检测方法,从而为临床上同时检测这两种病原的感染提供一种更加方便、快捷、准确的工具。根据溶血性曼氏杆菌lkt基因和多杀性巴氏杆菌sp6基因分别设计引物,优化条件后进行特异性和敏感性的评价,并对180份临床样本进行了检测。结果显示,溶血性曼氏杆菌和多杀性巴氏杆菌引物的最佳终浓度分别为10和20pmol/L。该方法的特异性较好,对其他无关病原不检出。对溶血性曼氏杆菌和多杀性巴氏杆菌的检测限分别为56和22pg,与独立PCR相同。该方法对临床样本的检测结果表明,溶血性曼氏杆菌和多杀性巴氏杆菌的检出率分别为51.67%和47.78%。研究结果表明,本研究建立的双重PCR诊断技术具有特异性好、敏感度高等特点,为临床上溶血性曼氏杆菌和多杀性巴氏杆菌的快速检测、鉴定以及混合感染的流行病学调查提供了有用的工具。     

鸡源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及其毒力基因的检测

取病死鸡肝接种于血清琼脂平板,挑取符合巴氏杆菌特征的单菌落进行纯化培养和染色镜检;对纯培养菌提取核酸,进行16S r RNA、kmt1和cap A基因的PCR鉴定,7个管家基因的PCR扩增和多位点序列分型,以及12个毒力基因的PCR检测;并进行分离菌的动物回归试验。结果显示,分离的2株病原菌(HN-1和CZ-6)均为两极浓染的革兰阴性短杆菌,16S r RNA和kmt1基因序列与多杀性巴氏杆菌的同源性均高于99%,荚膜血清型鉴定为A型,基因型为ST129型,除tox A、ptf A、nan H之外的9个毒力基因均被检出,动物回归试验表明分离菌对鸡的致病性较强。结果表明,这2株鸡源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定为我国禽源菌株的遗传特性研究提供了一定参考。     

禽多杀性巴氏杆菌外膜蛋白单价DNA疫苗及融合DNA疫苗的免疫效果分析

为探讨禽多杀性巴氏杆菌omph和ompa基因单价DNA疫苗及融合DNA疫苗的免疫效果,利用PCR技术扩增了禽多杀性巴氏杆菌omph和ompa基因片段,并克隆入pcDNA3.1(+),构建了DNA疫苗pcDNA-OMPH(pOMPH)、pcDNA-OMPA(pOMPA)和pcDNA-OMPH/OMPA(pOMPHA),将其体外转染SP2/0细胞,用间接免疫荧光试验检测其表达情况。同时以弱毒活疫苗作为阳性对照,pcDNA3.1(+)和PBS作为阴性对照,分别免疫4周龄鸡,检测血清特异性抗体水平、外周血淋巴细胞增殖情况和IFN-γ分泌情况,经强毒攻击后计算各疫苗的保护率。结果显示,融合DNA疫苗组血清抗体水平与弱毒活疫苗相当,明显高于单价DNA疫苗(P<0.05);pOMPHA组的刺激值(SI值)和IFN-γ分泌水平显著高于其他各组(P<0.05),单价DNA疫苗组略高于弱毒活疫苗组;强毒攻击后各DNA疫苗均可为动物提供一定的保护力,其中融合DNA疫苗的保护率最高,可达86.7%,其次为弱毒活疫苗,为73.3%,而单价DNA疫苗则低于弱毒活疫苗,仅为60%和66.7%。结果表明,DNA疫苗尤其是融合DNA疫苗在预防禽多杀性巴氏杆菌病(禽霍乱)方面具有较好的应用前景。     

牛源A型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及毒力基因检测

为确定黑龙江省2个规模化奶牛场犊牛急性呼吸道感染的病因,笔者进行了病原的分离纯化,细菌16S rDNA基因和多杀性巴氏杆菌特异性基因OmpH鉴定、生化试验、药敏试验、半数致死量试验、荚膜血清型分型及22种毒力因子的检测,以确定主要病原的种类、型别及生物学特性。结果表明,从死亡牛肺和患病牛鼻拭子分离的2株病原菌均为荚膜A型多杀性巴氏杆菌,分别被命名为WC16551和LY01,序列分析结果表明,其与牛源多杀性巴氏杆菌同源性达到99%以上。药敏试验显示2株菌均对恩诺沙星、环丙沙星高度敏感。半数致死量结果表明,LY01菌株的毒力明显强于WC16551菌株,2株分离菌均携带19种毒力因子,未检出hgbB、toxA和nanB三种基因。上述研究结果表明,导致2个牛场发病的主要病原菌为荚膜A型多杀性巴氏杆菌。     

SPA协同凝集试验快速检测禽霍乱患禽组织中特异性抗原的研究

为了使禽霍乱的诊断方法简便、快速、准确、便于在广大基层兽医单位推广使用,近年来一些学者根据金黄色葡萄球菌的细胞壁成分A蛋白(简称SPA)能和人及某些哺乳动物IgG的Fc段发生非特异性结合,有抗体活性的Fab段暴露于SPA表面,当有特异性抗原存在时,则可发生协同凝集反应的原理,已用于多杀性巴氏杆菌的分型和菌体抗原的检测。如Rimler,(1978)对引起牛出血性败血症的多杀性巴氏杆菌的两个血清型进行了鉴定,并指示协同凝集反应能检测出多杀性巴氏杆菌实验感染小白鼠的肝脏提取物及血浆中的可溶性抗原,     

禽霍乱改进型灭活苗的研制

用禽源多杀性巴氏杆菌Ｃ４８－１强毒株接种１日龄雏公鸡，制取肌肉脏器菌液，与Ｃ４８－１肉汤培养菌液按一定比例混合，制备成禽霍乱氢氧化铝胶灭活苗。攻毒试验表明，该苗对异型菌株Ｐ１０５９及从皖中西部地区分离的禽巴氏杆菌强毒株均有１００％保护力。     

鸡源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及生物学特性分析

为了对云南某鸡场发生鸡急性死亡的疑似禽霍乱病例进行病原确诊,无菌采集送检死鸡肝脏组织进行细菌分离培养、生化鉴定、细菌16S rRNA基因分析及荚膜分型鉴定,对分离菌株进行耐药性、致病性分析。结果,该分离菌为荚膜A型多杀性巴氏杆菌;药敏试验表明,分离菌对头孢氨苄、头孢他啶、阿莫西林、氨苄西林等8种药物敏感,对大观霉素、复方新诺明等6种药物中度敏感,对卡那霉素、链霉素、四环素等12种药物耐药;耐药基因检测显示,该分离株仅含有磺胺类sul2基因和四环素类tetB基因;动物试验表明,接种500 CFU的45日龄鸡在接种后7 d内全部死亡,接种12.5 CFU的小鼠在接种后48 h内全部死亡,死亡小鼠病理组织切片显示各器官均有不同程度的病变。上述结果表明,该分离株为荚膜A型多杀性巴氏杆菌强毒株,是该鸡场发生疫情的病原。本研究结果为我国鸡源多杀性巴氏杆菌的遗传特性研究提供了基础资料。     

兔多杀性巴氏杆菌外膜蛋白ompH2基因的克隆与原核表达

为克隆和表达兔多杀性巴氏杆菌外膜蛋白ompH2基因,并对其表达产物的反应原性进行研究,用设计的1对特异性引物对兔多杀性巴氏杆菌CVCC500株总DNA进行ompH2基因的PCR扩增。将PCR片段克隆至pMD18-T载体中,进行测序。随后,将该基因克隆到原核表达载体pET-30a(+)中,将重组表达质粒pET30a(+)-ompH2转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG进行诱导。测序分析证明,得到了1条大小为1 052bp的基因片段,与国内外报道的兔多杀性巴氏杆菌ompH2基因的核苷酸序列相似性达99%以上。重组表达质粒的酶切鉴定、PCR扩增和测序分析表明,重组表达载体构建成功。SDS-PAGE检测结果证实,该基因可以在大肠杆菌中表达,表达产物为分子质量约47ku的融合蛋白。Western-blot分析表明,表达的重组蛋白ompH2具有反应原性。为研究兔多杀性巴氏杆菌外膜蛋白ompH2的免疫学活性奠定了基础。     

多重PCR在多杀性巴氏杆菌荚膜定群中的应用

为了修订行业标准《猪巴氏杆菌病诊断技术》(NY/T 564-2002),改进多杀性巴氏杆菌荚膜定群方法,制备了多杀性巴氏杆菌分群抗血清,并建立了多重PCR,对53株菌同时用血凝方法及多重PCR进行定群。经正向间接血凝试验测定,制备的各型血清仅与对应型抗原发生凝集反应,表明血清具有较高的特异性,可作为多杀性巴氏杆菌的荚膜定群抗血清。53株多杀性巴氏杆菌均扩增出了相应的预期片段,PCR结果与Carter氏间接血细胞凝集试验结果相一致。结果表明,可将多重PCR增添至行业标准中,用其代替原有血清学方法进行多杀性巴氏杆菌荚膜定群。